專利名稱：檢測高脂血癥易感性的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢搠用的試劑盒，尤其是一種檢擁商鹿血癥易-性的試劑食，通過同時檢 灑血漿膽固醉豳轉移蛋白基因'(cholesteryl ester transfer protein, plana, '.CEl ).的單核勞酸多東 性(SNP)位點與脂蛋白脂酶基因(lipoprotein lipase, LPL)的單核苷酸多審性位點來預測^對離鹿 血癥的易感性。
背景技術：
由于脂肪代謝或運轉異常使血漿中一種或幾種脂質離于正常稱為離簾lflue(byperlipiiJ挪ia),可表現(xiàn) 為高膽固醉血癥(hyperchoesterolemia)、髙甘油三酯血癥(hypertriglycerid一ift〉戒兩者兼有(混合型 髙脂血癥)。脂質不溶或微溶于水，必須與蛋白質結合以脂蛋白形式存在，才l^血被糖環(huán)中運轉，因此, 高脂血癥常為布脂蛋白血癥(hyperlip鄰rotein棚ia)的反映。由于逐漸認識到臘漿中Att度牖蛋'白降低也 是一種血脂代謝紊亂，因而稱之為血脂異常(dyslipid棚ia)更為全面、準確地，jfijg代謝紊亂狀態(tài)，目 前冊0將高脂蛋白血癥分為五大類，主要為根據(jù)血漿脂蛋白升離的程度不同進行的表塞分類:家族性離乳糜傲粒血癥(家族性離甘油三酯血癥)、家族性髙膽固醉血癥(家族性離e脂蛋白血癥)、家族性異常e脂 蛋白血癥、高前e脂蛋白血癥、混和型離甘油三醮血癥(混和性離脂血癥)。脂蛋白的蛋白部分是一種特殊蛋白，因與脂質結合擔負在血漿運轉月皆類的功能，故稱為載脂蛋白(apoprotein),載脂蛋白除了與脂質結合形成水搏性物質,成為轉運脂類的載體以外，還有其他械功能, 尤其是參與酶活動的調節(jié)，以及參與脂蛋白與細胞腆受體的識別和結合反應.血漿中的脂蛋白呈徵粒狀， 核心主要為甘油三酯和膽固醉醮，外層由磷脂.、膽固酵、載脂蛋白構成。水溶性酶可透Si表層進入內層起 作用。脂蛋白的代謝有兩條途徑①外源性代謝途徑是指飲食攝入的膽固酵和甘油三醮在小腸中合成CM 及其代謝過程；②內源性代謝途徑是指由肝合成的VLDL轉變?yōu)镮DL和、LDL，以及LDL被肝或其他器官 代謝的過程。其中乳糜微粒CM不能進入動脈壁內， 一般不致動脈粥樣硬化，但易誘發(fā)鷹腺炎。血萊極低費度脂蛋 白VLDL水平升髙是冠心病的危險因素，低密度脂當白LDL容易進入動脈壁并Vm化修飾，是主要的致動 脈粥樣硬化的因素.高密度脂蛋白HDL水平升高有利于外周組織移除膽齒醉，防止動脈粥樣硬化發(fā)生，高脂血癥(高脂蛋白血癥)臨床上可分為兩類①原發(fā)性，厲逮#^脂代 ^亂疾??；，發(fā)性，常 見于控制不良的糖尿病、飲酒、甲狀腺功能減退癥、腎病練合征、透析、腎移植、膽堪扭塞、口康避孕藥 等.血脂異常與心血管病，尤其與冠心病的發(fā)生和發(fā)展密切相關，是代謝綜合癍的組成成分之一。已知部分原發(fā)性髙脂血癥是由先天性基因缺陷所致，如LDL受體基因缺陷可引起家族性商膽圃醉血癥，而常見繼發(fā)性高脂血癥病因有下列幾種1、 離膽固醉血癥糖尿病、腎病綜合癥、甲狀腺功能減填、Cushing練合癥2、 髙甘油三醮血癥糖尿病(未控制)、腎病綜合癥、尿毒癥(透析時)、肥自、雌撒素治療、糖原貯 積癥(I型)、飲酒、系統(tǒng)性紅鄉(xiāng)瘡、異常Y-球蛋白血癥、痛風；3、 高異常脂蛋白血癥各種原因引起的肝內外膽道梗阻、膽汁淤積性肝膽病、包括肝內膽小管性肝炎、 膽汁性肝硬化。我國人群血脂平均水平低于發(fā)達國家，但其升布幗度卻很驚人。我國對不同地區(qū)9組人群，從20世 紀80年代初至90年代末的20年間進伃了 3次可比性調査，結果表明血演凝JiaW(TC) >5.2(tool/ L(200呢/dl)，男性患病率由17%連續(xù)上升至33%,女性患病率由9%連續(xù)上升至32%, S此，積極檢出'、 預防和控制血脂異常成為經濟發(fā)達地區(qū)心血管病預防工作的主要內容之一。SNP (single nucl的tide polymorphism)，即單核苷齡態(tài)蹄記，是一類軒單 $異弓1 的DNA 多態(tài)性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序判多態(tài)性， 包括單IC基轉換、瞎換，以及單堿基的插入/缺失等，它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標記，占 大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感性、和對環(huán)境因素、藥物反應的差異.CETP(cholesteryl ester transfer protein, plasma )是血漿膽囲醉鵬轉移蛋白編碼基因，由該基 因鳊碼的蛋白是脂代謝中重要的轉運蛋白之一，它主要介導膽固酵的逆向轉運過程，即在離崈度脂蛋白 (HDL)顆粒與其他脂蛋白或細胞膜之間不斷地進行脂質成分交換的同時増加膽固糖從組織細鹿中流出轉 運至肝臟的過程，近年來研究認為CETP基因上的多態(tài)現(xiàn)象與多種異常脂蛋白血癥(異裙P脂蛋白血癥， 家庭性離膽固醉血癥和混合型商脂蛋向血癥〉，肥胖、糖尿病、腎病綜合征以及AS型心擴血管疾病等因素 相關。CETP基因的缺陷可以引起HDL中CE蓄積、TC降低VLDL、 LDL中的CE減少，TC塌加.而CETP活 性增加，脂肪攝取過多易沉積于肝，更多富含CE和LDL顆粒和VLDL殘粒集聚于血漿中，過多的LDL就榮 集在動脈壁細胞內，導致CE沉積于動脈壁內，從而引發(fā)多種癥狀。國內外大樣本研究均表明CBTP基因上 的rsl7237904號SNP位點(SEQ ID NO: 1所示序列中146位)基因型與血漿離密度脂蛋白膽困.醉水平的 升S有顯著關系，rsl7237904號位點是位于第16染色體上CETP基因第1內含子的,切位點T叫IB處的 一個的G/A多態(tài)SNP位點，低頻等位基因A即為國內外文獻中常見的T叫IB的B2位點，可以PMfe血漿內 膽糊酵脂轉運蛋白的濃度，抑制髙密度脂蛋白向低密度脂蛋白的轉化，因此對于心腦血管疾病的發(fā)生有一 定的保護作用。LPL基因編碼脂蛋白脂酶，該酶在心臟、肌肉和脂肪組織中進行表達。LPL以同型二聚體蛋白的形式 行使功能，其分子生物學的作用包括兩部分，一部分為甘油三脂的水解,作用，另一部分則是受體介導的 脂翠白內吞作用的橋梁。LPL蛋白上的位點突變在嚴重的情況下可以導致I型離脂蛋白血癥，而較輕ga 上則引起體內脂蛋白代謝的紊亂.LPL基因上rs320位點(SEQ ID NO: 1所示序列中118位)是位于第八 號染色體8p22上的脂蛋白脂錄LPL第八號內含子的多態(tài)，由T到G的改變使屎有的HiildIII瞎切位點消 失，國內外研究表明LPL的HindIII位點與血flgTlC平相關。大樣本的中國人群的關聯(lián)分折(共3000多例) 結果顯示帶有H—單倍型的個體具有更低的甘油三脂水平和更髙的髙密度脂蛋白膽圃瞎水平，可齙是保護 個體不受到血脂異常危害的單倍型。國內外的大量的關M析表明.CETP基因上的rsl7237恥4號SNP位點基因型為A時能夠降低布脂血 癥的發(fā)生；LPL基因上rs320號SNP位點基因型為T時能夠降低甘油三脂水平，保護個體不受對血脂異常 的危害。這兩個SNPs位點的多態(tài)性可用于評估個體對髙脂血癥的易感性，目前己通過中國科學院理家生 物基因檢測技術應用評估認證中心的認證。發(fā)明內容基于CETP基因上的rsl7237904號SNP位點和LPL基因上rs320號SNP位點的多態(tài)性可用于評估個體 對布脂血癥的易感性的基礎上，本發(fā)明提供一種檢測高脂血癥易感性的試劑盒，該試劑盒包括檢測CETP基因SEQ ID NO: 1中第146位SNP的特異性引物對及特異性熒光探針、檢 渕LPL基因S印ID NO: 2中第118位SNP的特異性引物對及特異性熒光探、Taq酶、(WiP混合液、MgCl， 溶液、熒光定豕PCR反應緩沖液、去離子水，本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO: 1中第146位SNP與SEQ ID NO: 2中第118位 SNP位點而設計，能特異性擴埔出SEQ ID NO: 1中包含第146位SNP位點的DNA片段與SEQ ID NO: 2中 包含第118位SNP位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的*優(yōu)選地， 試劑盒中包含具有S印ID NO: 3和4所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對， 特異性引物對可用常規(guī)的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對引 物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID亂1中第146位SNP與SEQ ID恥2中第118 位SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這兩個SNPs位點敏。痛S錄籌因1WI探針， 設計這類探針是本領域技術人員能夠輕通完成的.優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 7和S所示序 列的T叫ioan探針。特異性熒光探針可用常規(guī)的合成技術進行合成.本領域的技術人員il夠理解，本發(fā)明
的特異性熒光探針不限千這兩條探針，所有可用于熒光定量PCR檢抓SEQ ID NO: 1中第146位SNP與S印 ID NO: 2中第118位SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括lul 10 X熒光定量PCR反應緩沖液，0. l|il 25ndl dNTP混合液，0. 5 tl 25mM HgCl,柳，0.02|il (5unitsAi1) Tag DNA聚合瞎，20MM特異性引物對(四條)各0,225iil，IOHM特異性熒光探針(兩條)各0.25ji1,去離子水4.98ji1,本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-201C。
具體實施方式
卜'面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，下列實施例中未注明具體條件的實驗56rte,通常推照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢新試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法^ll口腔上皮細胞的基因組DNA, 步驟2:熒光定量PCR反應使用可檢測離脂血癥易感性的熒光定豕PCR檢擁試劑盒，其中，含有下列對物對，光探針，有義引物1: 5' - AACAGCCAGGTATAGGGAT -3' (SEQ ID NO: 3) THii值為56"C反義引物1: 5' - TATACACCAACCTCCTAATC -3， (SHJ ID NO: 4) Tm值為561C有義引物2: 5' - AGGGTGAGATTCCAAGATAA -3' (SEQ ID NO: 5) Tm值為561C反義引物2: 5' - CAAGCAAATGACTAAAGAGAA -3' (SEQ ID NO: 6) Tn值為561C熒光探針1: 5' - GGnCGAGTTAGGGTTCAGATC -3' (SEQ ID NO: 7) Tm值為661C熒光探針2: 5' - CGCTATAGGATTTAAAGCTTTTATA -3' (SEQ ID NO: 8) Tm值為64"C有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異地針對檢測CETP基因上的rsl7237904號SNP位點(SEQ ID NO: 1所示序列中146位〉多態(tài)性；有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異地針對檢測LPL基因上的 rs320號SNP位點(SEQ ID NO: 2所示序列中118位)多態(tài)性。熒光定量PCR反應體系為總體積lO(il，包含濃度為20ng/|xl的DNA模板2jil、 ljil 10 X熒光定量PCR 反應緩沖液、0. lpl 25mH dOTP混合液，0.5pl 2^M MgCl:溶液、0.02pl (5units/(tl) T叫D恥榮合瞎、 20| M的有義引物1和2各0. 225nl、20jiM的反義引物1和2各0.225nl、l(HiM的熒光探針1和2各O.25jil， 去離子水4.98|11。在ABI9700型PCR擴塌儀上進行反應，反應條件為50*C 、 2分鐘，95TC 、 10分鐘，進行60個循環(huán)的 951C、 30秒，601C、 l分鐘。反應結束后在旭I7恥0型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光瘇。步驟3: SNP基因型分析將熒光定豕PCR儀上顯示的最終樣顯熒光量和正常對照相對比，熒光探針1最終的炎光信號明顯高于 正黹對瓶，說明被檢劂DNA的CETP基芮上的rsl7237904號SNP位點基接型攜帶有G型》為AISA癥易感 型；熒光探針2最終的熒光信號明顯髙于正常對照，說明被檢測DNA的LPL基因上rs3加號SNP位點基因 型擁帶有T型，為高脂血癥易感型， 實施例2.指導人們主動預防高脂血癥的服務目前在上海主健生物工程有限公司已經開展了這項服務。 步驟l: DNA提取對被檢測者進行服務前咨詢，由被檢測者簽著知情同意書，填寫生活飲食習慣問INI査表，依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細魔的DKA步據(jù)2:基因分型檢淵使用本發(fā)明提供的試劑盒,對被檢擁者DNA的CETP基因上的rsl7237904號SNP位點和LPL基因上Ts320 號SNP位點同時進行熒光定量iO檢測，確定這兩個SNPs位點的基因型，步驟3:指導人們主動預防商脂血癥通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健IE指導報吿.基因 檢翔報吿詳細說明了被檢測者髙脂血癥易感程度的髙低以及患病的概率大小。個體化^ 指導報吿以被& 測者的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問巻調査結果，評估被檢糖者Am血癥逸傳易感的 相對風險。同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進 建議等，并為被檢測者普及預防高脂血癥的健康知識。
序列表<110〉上海主健生物工程有限公司<120〉檢測高脂血癥易感性的試劑盒<160〉 8<210〉 1 <211> 300 <212> DNA〈213>人屬，,人種(Homosapiens, human)<柳〉1gg扭gatgggct卿c鵬gctgtcatcac cccctcctgacctcgccttc幼ggtc幼gt60tctuggtgag幼ggtcctagctgcattgc aaacagccaggtatagggatttgtgtttgt120ct辟gacccag助tcactggggttcgagtt agggttcagatctgagccaggttagggggt180tgagtc鄉(xiāng)gggtaaagatt鄉(xiāng)aggttgg tgtatatttggtgttgggggtcactctatg240gcca卿tcag鵬ttgccat卿ctc鄉(xiāng)tgacggaggctccatcactgactgttgtgt300<210> 2〈211〉卿<212〉 DNA<213>人屬，人種(Homosapiens, human)<柳> 2tc助accaacctcttcaagagtgagat tcctaatctccctgtctccgcagcccacccatgtgtacccataaaatgaatta cacgatcgctataggatttaaagcttt120t8t肌t幼atgtgctgg辟ttttgcaaact atagtgtgctgttattgttaatttaaad180actctaagUaggattgacattatttct ctttagtcatttgcttgtatcaccaaagaa240gcaaac幼acaaacaa幼aaaaaaagaaaa agatcttgggtggaaatgttataaagaa300<210> 3 <211〉 19 <212〉 DNA <2i3>人工序列<220><223〉引物 <400〉 aacagcc鄉(xiāng)tatagggat 19<210> 4 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列<2加><223>引物 <400> 4tatacacc幼cctcct幼tc 20<210〉 5 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>引物 <柳> 5a鵬tgagat tccaagataa 20〈210〉 6 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223>引物 <柳〉6c助gcaaatg actaaagaga a 21<210> 7 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>探針
<400> 7ggttcgagtt agggttcaga tc<210> 8 〈211〉 25 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探針 <400> 8cgctatagga ttt幼agctt ttata
權利要求
1.一種檢測高脂血癥易感性的試劑盒，包括同時檢測CETP基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點與LPL基因SEQ ID NO2中第118位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對SEQIDNO: l中第l新 位SNP與SEQ ID NO: 2中第118位SNP位點而設計，能特異性擴墦出包含SEQ ID NO: 1中第146位SNP 位點的DNA片段與包含SEQ ID NO: 2中第118位SNP位點的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權利耍求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第 146位SNP與SEQ ID NO: 2中第118位SNP位點而設計，能通過熒光定董PCR技術特異性檢測出這兩個 SNPs位點冠心病易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選瞎具有SHJ IDNO, 3和4所 示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對。
5. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO: 7和8 所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括lul IOX熒光定豕PCR反 應緩沖液，0. l|il 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCh溶液，0.02(il (5units/|il〉 T叫DNA榮合瞎， 20nM特異性引物對(四條)各0.225ji1, 10nM特異性熒光探針(兩條)各0.25jil，去離子水4.98nl。本 試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20"。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測高脂血癥易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測CETP基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點和LPL基因SEQ ID NO2中第118位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測分析個體的CETP基因與LPL基因上SNPs位點基因攜帶型來預測個體對高脂血癥的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101130809SQ200610030380
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 屹 樓, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司