專利名稱：用于檢測冠心病易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測疾病易感性的試劑盒，尤其是一種檢裙潘心病M性的試劑盒，壤過檢m敢麻酯瓣l基因(paraoxonase 1, P0N1)的單核苷酸多態(tài)性位點來預(yù)測個^Mt冠^H)i的易感性。背錄技術(shù)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease)指冠狀勸勝粥^9Hb使血管 腔狹窄或阻塞，或沐)因冠狀動脈功能性改變(痙牽)導致心肌缺血缺艦壞頓弓l起的心臟病，統(tǒng)稱靴 動脈性心臟病(coronary heart disease),簡稱冠心病(CHD),亦稱缺血性心臟病(isch棚ic heart disease)。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，也是嚴重危害人民健康, 見病。本病多發(fā)生在40歲以后，男性多于女性，發(fā)達國家常見，美國約有700萬人患本病，毎年約50余 萬人死于本病，占人口死亡數(shù)的l/3 l/2，占心臟病死亡數(shù)的50 75%。在我國，近年來雖增長趨勢， 加世紀70年代北京、上海、廣州本病的人口死亡率分別為21.7/10萬人口、 15.7/10萬人口和4.1/10萬 人口 ；恥年代我國城市男性本病死亡率為49.2/10萬人口 ，女性為32.2/10萬人口 。冠心病的發(fā)病隨年齡的增長而增商，程度也隨年齡的增長而加重，有資料表明，自40歲開始，每坩 加10歲，冠心病的患病率增l倍。男性50歲，女性60歲以后，冠狀動脈硬化發(fā)展比較迅速，同樣心肌 梗塞的危險也隨著年齡的增長而增長。年輕的男性患者比年輕的女性患者多，但絕經(jīng)后的女性以及年過六 十的婦女，其危險就幾乎與男性相等了，甚至大于男性。老年人心臟病發(fā)作的可能性較商，其發(fā)病機理是復雜的，綜合性的較長過程.可歸納為四個步驟1.心血管內(nèi)皮敏胞損害，平滑肌細 胞增生。2.血小板粘附于受損的血管壁后，釋放出血淸素，血栓素A2、血小板IV、 Vl因子等。3.低密度 脂蛋白由受損的內(nèi)皮細胞滲入內(nèi)膜下的平滑肌細胞，并被吞噬，進入細胞后被細胞內(nèi)裕瞎體的水解瞎分解 而釋放出游離膽固醉，后者與亞油酸結(jié)合，成為重要發(fā)病環(huán)節(jié)，4.在上述病理變化基礎(chǔ)上，最終發(fā)生冠 狀動脈纖維化、鈣化.冠心病是一種有遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找冠心病相關(guān)基因進而鰣明冠心 病發(fā)病的遺傳機制已經(jīng)成為目前研究的熱點。P0N1為paraoxonase 1 (對氣麻脂,l)編碼基因，血淸中的對氣磷ISW 1可以作為抗敏化劑，對低 密度脂蛋白LPL等生物大分子進行水解并降低瓶化水平.從而&低血管內(nèi)的氧化勢，起到對血管的保護作 用，基因發(fā)生缺陷后，導自低密度脂蛋白LPL等生物大分子進行水解并IBMK氣化水平下降，造成對血管 蜜的損傷，帶來心腦血管的疾病。SNP(singlenucl的tide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性標記，是一類基于單 變異引起的加A 多態(tài)性，被遺傳學界稱為第三代通傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、頮換，以及單堿基的插入/缺失等，它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標記，占 大約90%.這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感 性、和對環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。研究表明，P0Nl基因上的rs662號SNP位點(SEQ1DNO: 1所示 序列中146位)的多態(tài)性(A/G)會弓l起基因編碼蛋白的第192個氨基酸由Gln變?yōu)锳rg,而冠心病患者帶 有Arg的頻率明顯高于正常人群，P0N1基因的Glnl92Arg多態(tài)性與冠心病嚴重性、冠狀動脈粥樣硬化進展 程度、血脂水平和降血脂藥物治療效果相關(guān)。國內(nèi)外的大量的關(guān)聯(lián)分析表明，PONl基因的Gln多態(tài)(SNP 位點基因型為A)能夠降低冠心病的易感性、延緩冠狀動脈粥樣硬化進展程度*該SNPs位點的多態(tài)性可 用于評估個體對冠心病的易感性，目前已通過中國科學院國家生物基因檢測技術(shù)應(yīng)用評估認證中心的認 證，
發(fā)明內(nèi)容
基于P0N1基因上的rs662號SNP位點可用來評估個體對冠心病怖易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種 用于檢淵冠心病易感性的試劑盒，該試劑盒包括檢測P0N1基因SEQ ID NO: 1中第146位SNP的特異性引物對及特異性熒光探針、Tag 酶、dNTP混合液、MgCh溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO: 1中第1站位SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增 出SEQ ID NO: 1中包含第146位SNP位點的DM片段的引物對，設(shè)計這類弓嫩對是本領(lǐng)域技術(shù)人員US^ 輕易完成的，優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對，特異性引物對可用常規(guī) 的合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對引物，本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光 定量PCR技術(shù)特異性檢糖出該SNP位點冠心病易感基因型的探針。設(shè)計這類,是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕 易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有S印ID NO: 4所示序列的T叫nan探針，特異性熒光探針可用常規(guī) 的合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這條探針，所有可用 于熒光定量PCR檢獮SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 ljil 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液， 0. l(il 25mM dNTP混合液， 0.6pl 25mM MgCl，溶液， 0.025)il (5units/)il) T叫DNA聚合酶， 20(iM特異性引物對(兩條)各0.225jil， 10nM特異性熒光探針0.25(i1, 去離子水5. 575jil。本試劑盒供一人份檢擁應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-201C。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條自實敏方法，通紫按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步籌l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組咖A。 步，2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢測冠心病易感性的熒光定1:PCR檢擁試劑盒，其中，含有下列弓l物對和熒光探針有義引物5' - GGACCTCAGCACTTTTATC -3' (SEQ Iti NO: 2) T鵬值為561C反義引物5' — TTGGACTATAGTAGACAACA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為541C熒光探針5' - CGATCCTGGGAGATCTATTTGG-3' (SEQ ID NO: 4) Tn值為641C熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積lOjil,包含濃度為20ng/nl的DNA模板2fi1、 lpl 10 X熒光定S PCR 皮應(yīng)緩沖液、0.1^1 25mM dNTP泡合液、0. 6(il 25mM MgCl,溶液、0. 025|U (5units/|il) T叫DNA聚合,、 加fiM的有義引物和反義引物各0.225nl、 IOjiM的熒光探針0. 25nl,去離子水5.575jil。在旭I9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為501C、 2分鐘，訴1C、 IO分鐘，進行抑個循環(huán)的 95"、 30秒，601C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在旭I7恥0型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，步澳3: SNP基因型分析
將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光豕和正常對照相對比，熒光探針最終的爽光信號與正常對照 相差不多，說明被檢淵DNA的P0N1基因上的rs662號SNP位點基因型攜帶為A型，非冠心病易感型，實施例2.指導人們主動預(yù)防冠心病的股務(wù)目前在上海主健生物工程有限公司己經(jīng)開展了這項服務(wù)。 步騍l: DNA提取對被檢潿者進行服務(wù)前咨詢，由被檢測者簽豕知情同塞書，填寫生活飲食習慎詢眷調(diào)査表，依照％# 盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細趣的DNA抽提.步紫2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢潿者DNA的P0N1基因上的rs662號SNP位點進行熒光定量PCR檢 測，確定該SNP位點的基因型。步驟3:指導人們主動預(yù)防冠'll禍通過對被檢測者SNP基因型的分折，出具基因分型檢測報告和被檢鑭者個體化健康指導報吿，基BI^ 翻報吿詳細說明了被檢測者冠心病易感程度的髙低以及患病的概率大小。個^ttt康接導報吿以被檢JWt 的基因分型檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習慣問巻調(diào)査結(jié)果，評估被檢1 #冠心病通傳易 的相對風 險。同時制定出針對于被檢淵者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建議等， 并為被檢測者普及預(yù)防冠心病的健康知識。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120>用于檢測冠心病易感性的試劑盒<160> 4<210> <211> <212> <213〉1300 DNA 人厲,人種(Hono sapiens, human)<400> 1cC8gtt幼ta蹄ttgcagttcactattttctatgUgtct幼tggaatcaatcctgt幼t gttc祖tacc ttcaccttat Btattatgtg tgtatgtttt 60tg幼tgatat tgttgctgtg ggacctgagc acttttatgg cacaaatgat 120ttgaccccta cttac幼tcc tgggagatgt atttgggttt agcgtggtcg l抑actatagtcc助gtgaagtt cgagtggtgg cagaag辟U tgattttgct 240acatttcacc cgatggc幼g tatgt卿ct ctctgaaatg tagt鵬ttt 300<210〉 <211> <212> <213>219脆人工序列<220> <223>引物<柳〉219<210> <211> <212> <213>3加 腿人工序列<咖> <223>引物<柳> 320<210〉 4 <211> 22 <212>醒 <213>人工序列<220><223>探針 <400> 權(quán)利要求
1.一種用于檢測冠心病易感性的試劑盒，其特征在于包括檢測PON1基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性弓I物對是播針對咖IDNO: 1中第H6 位SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點的DNA片段的引物對.
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對SEQ IDN0: 1中第 146位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定至PCR技術(shù)特異性檢擁出該SNP位點冠心病易感基因型的探針，
4. 根據(jù)權(quán)利耍求l所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性弓I物對選自具有SEQIDNO: 2和3所示序列的引物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ IDN0: 4所示 序列的T叫man探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括l(il IOX熒光定麓PCR反 應(yīng)緩沖液，O.l(il 25mM dNTP稱合液，0.6)il 25mH MgCl,溶液，0.025fil (5units/(il) T叫DNA衆(zhòng)合,， 幼一特異性引物對(兩條)各0.225jd， 10nM特異性熒光探針0.25fi1，去離子水5.575p1,本試劑錄 —人份檢瀕應(yīng)用，試劑盒的保^m度為-20TC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測冠心病易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測PON1基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測分析個體的PON1基因上SNP位點基因攜帶型來預(yù)測個體對冠心病的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101131358SQ20061003038
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 屹 樓, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司