專利名稱：高同型半胱氨酸血癥易感性檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測離同型半胱貧敏血癥暴m的試刑盒， 通過檢擁耽琉醚-^合成瞎基因(cystathionine-beta-synthase, CBS)的單核f^g多態(tài)性(SNP〉位點來 預(yù)測個體對離同型半胱氛酸血癥的易感性。背錄技術(shù)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是嚴(yán)重危害人民健康的常見病，占心臟病死亡數(shù)的一半以上， 在我國呈増長趨勢。髙同型半胱貧酸血癥是冠心病發(fā)病的獨立危險因素，高同型半胱氨酸血癥通過損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、改變血液系統(tǒng)的凝固狀態(tài)和血小板功能、刺激蠢蟹平滑 肌細(xì)胞增殖和促進(jìn)低密度脂蛋白氧化等參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。有報堪指出離同型半JK氨酸血 癥也與懷孕并發(fā)癥有關(guān)。通過針對CBS基因的動物模型研究發(fā)現(xiàn)，CBS基因缺陷可iW小亂的軟骨內(nèi)骨化,. 造成小鼠的脂代謝紊亂。高同型半胱豕酸血癥和遺傳基因變異有關(guān)聯(lián)，尤其是和血液同敏半胱気醴4t謝有 關(guān)鍵性作用的胱琉醚-F合成酶(CBS)的控制基因變異聯(lián)系緊密。CBS是編碼胱琉鵬-P-合成籌的基因，定位于21號染色體靠近端粒的位置(21q22. 3〉。人CBS的cDNA 全長約23kb,有17個外顯子構(gòu)成。CBS多肽含551個氨基酸殘基。人CBS基因至少存在兩個啟動子，它 們定位于外顯子-la和-lb的上游，是富含GC(8諷)的區(qū)域，并含多個反式作用ra子的特異性結(jié)合位點， 如Spl， Apl, Ap2 and c-niyb等。胱硫醚-P-合成酶，參與同型半胱貧酸的轉(zhuǎn)琉途徑的第一步反應(yīng)，將同 型半胱氨酸不可逆的轉(zhuǎn)化為半胱氨酸和Q翻丁酸。CBS的缺陷會導(dǎo)致離胱氨酸尿，該病癥會影響多種器官 和組織，包括眼睛和肌肉、血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等.該基因己有100個以上的突變體，CBS缺失患者中可 見的大多為錯義突變，現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)71種，其中4種為無義突變，其余的是各種缺失和剪接突變。SNP(single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類 單 ||變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占 大約90%。這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感 性、和對環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。目前的研究認(rèn)為CBS基因缺陷造成的高胱氨酸尿癥和高胱貧酸血癥是血管性疾病新的獨立i^齒素， 胱瑰醴-^合成酶基因多態(tài)性已成為研究的熱點。rs5742905是位于第21號染色體上CBS基因上的一個G/A多態(tài)，引起CBS基因^的蛋白第278個氨 基酸由lie [I]變?yōu)門hr [T]。改變了編碼子導(dǎo)致氨基酸編碼改變，對蛋白質(zhì)功能或者結(jié)構(gòu)成生影響，從 而對同型半胱氣酸的轉(zhuǎn)硫能力下降，使其在血管中發(fā)生集結(jié).在世界人群中的該多態(tài)的頻率分布，G占 0.998, A占0.002左右。中國人群中的分布G為0.94, A為0.06。國內(nèi)的大量的關(guān)聯(lián)分析中超過500對對 各類心腦血管疾病(包括腦血栓，冠心病)的研究發(fā)現(xiàn)，rs5742905位點對于個體的血漿同型半麻氨艘水 平有著明確的影響，冠心病組的CC、 CT基因型同型半胱氨酸(HCY)水平顯著高于TT型，因此re5742卯5 位點攜帶A型即為高同型半胱氨酸血癥易踏型。這個SNP位點的多^tt可用于評估個體對高同型半脹氨酸 血癥的易感性，目前己通過中國科學(xué)院國家生物基因檢測技術(shù)應(yīng)用評估認(rèn)證中心的認(rèn)證。發(fā)明內(nèi)容基于CBS基因上的rs5742905號SNP位點可用來評估個體對髙同型半胱豕酸血癥的應(yīng)感性的基礎(chǔ)上, 本發(fā)明提供一種檢測高同型半胱氨酸恥癥易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測CBS基因SEQ ID NO: 1中第115位SNP的特異性引物對炎特異性熒光探針、T叫 酶、dKIP棍合液、MgCh溶液、熒光定紫PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水，本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO: 1中第115位SNP位點而設(shè)計，能 # 擴(kuò)增
出SEQ ID NO: 1中包含第115位SNP位點的DNA片段的引物對，設(shè)計這類引，是本領(lǐng)域技術(shù)人員餹夠 輕易完成的，優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對，特異性引物對可用常規(guī) 的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第115位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光 定量PCR技術(shù)特異性檢測出這個SNP位點高同型半胱氨酸血癥易感基因型的探針.設(shè)計這類探針是本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫nan探針，特異性熒 光探針可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明W^異性熒，針不鬼于這條 探針，所有可用于熒光定量PCR檢測SEQ ID NO: 1中第115位SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含撇包括 ljil 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液， 0. l)il 25mM dNTP混合液， 0.6^1 25oM HgCh溶液， 0.025(il (5units/"l) T叫鵬A聚合酶， 20nM特異性引物對(兩條〉各0.225ji1， 10lUI特異性熒光探針0.25nl， 去離子水5.575jxl。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑A的保存溫度為-201C。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步閘述本發(fā)明，下列實施例中未注明具體條件的實lfe方法，通常拔瓶常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件，實tt例l.檢測試劑盒的使用 步翻l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步*2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢擁商同型半胱氣酸血癥易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針有義引物5' - MGCTGGACATGCTCGTC -3，(SEQ ID NO: 2) Tm值為56"C反義引物5， - TTGTCTGCTCCGTCTGGTT -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為5 X:熒光探針5' - ATCAATGGGGTGGATCOXiA -3' (SEQ ID NO: 4) Tra值為62X3熒光定豕PCR反應(yīng)體系為總體積l(Hil，包含濃度為20ng/)il的DNA模板2"、 l|il 10 X熒光定置PCR 反應(yīng)緩沖液、0. lftl 25mH dNTP混合液、0.6pl 25mM MgCl豕溶液、0.025|tl (5units/pl) T叫DNA蹇合酶、 20nM的有義引物和反義引物各0.225ji1、 10(iM的熒光探針0.25ji1，去離子水5.575^1,在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為501C 、 2分鐘，951C 、 10分鐘，進(jìn)行60個循環(huán)的 訴1C、 30秒，601C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上'讀取樣品熒光量，步驟3: SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針最終的炎光侑號明JliF于正 常對照，說明被檢淵DNA的CBS基因上rs5742905號SNP位點基因型攜帶有A型，為離兩型半MIK酸血 癥易感型，
實據(jù)例2.指導(dǎo)人們主動預(yù)防高同型半胱氨酸血癥的服務(wù) 目前在上海主健生物..[程有限公司已經(jīng)開展了這項服務(wù)。步驟l: DNA提取對被檢測者進(jìn)行甩務(wù)前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)ft問雄，蜜表.依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)班油DNA抽提， 步驟2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的CBS基因上的rs5742恥5號ShB 位點進(jìn)行熒光定働PCR 檢糖，確定該SNP位點的基因型。步驟3:指導(dǎo)人們主動預(yù)防高同型半胱氨酸血癥通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具基因分型檢測報吿和被檢測者^H^4ii報導(dǎo)報吿.基因檢 測報吿詳細(xì)說明了被檢測者商同型半胱第酸血癥易感程度的高低以及患病的概率大小、.個體化健m導(dǎo)報 告以被檢劂者的基因分型檢測縛果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査結(jié)果，評估被檢謝者離勝氨酸尿 癥通傳易感的相對風(fēng)險。同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習(xí)懊、生活 方式上的改進(jìn)建議等，并為被檢測者普及預(yù)防高同型半胱氨酸血癥的健康知識。序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120>離同型半胱氨酸血癥易感性檢測試劑盒<柳> 4<210> <211> <212〉 <213>1240 DNA 人屬,人種(H咖o sapiens, h咖助)<柳> 1tcctgc鄉(xiāng)accatcacgggt扭tcccgacctacgaggtgtgt辟tggg幼gctg辟ca tgctggtggc. ttcagtgggc acgggcggca 60cattgcc鄉(xiāng)幼gctgaagg agaagtgtcc tggatgcagg atcattg鵬 120鄉(xiāng)gtccatc ctcgcagagc cg腳辟gct gaaccagacg gagc鄉(xiāng)caa 180gg卿g辟tc ggctacgact tcatccccac ggtgctggac aggac肪tgg 240<210> <211> <212> <213>218DNA人工序列<220〉<223>引物<400> 2爛ctggaca tgct辟tg18<210> <211> <2!2> <213>319DNA人工序列<220><223>引物<柳> 3ttgtctgctc cgtctggtt19<210> 4 <211> 20 <212> DNA 〈213>人工序列<2加〉<223>探針 <柳〉4atcaatgggg tggatccga
權(quán)利要求
1.一種用于檢測高同型半胱氨酸血癥易感性的劑盒，其特征在于包括檢測CBS基因SEQ ID NO1中第115位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對S印IDNO: 1中第115 位SNP位點而設(shè)計，能特異性擴(kuò)增出包含SEQ ID NO: 1中第115位SNP位點的DNA片段的引物對，
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是旨對S抑ID NO: 1中第 115位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定愛PCR技術(shù)特異性檢測出該SNP位點離同型半胱氨酸血癥易感基因 型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO: 2和3所 示序列的引物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO: 4所示 序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含Jt包括l(il IOX熒光定置PCR反 應(yīng)級沖液，0. lpl 25mH dNTP混合液，0.6|U 25oM MgCl2溶液，0.025^1 (5卯its/fi1〉 T叫咖A聚合瞎， 2(HiM特異性引物對(兩條)各0.225ji1, 10jiM特異性熒光探針0.25ji1，去離子水5.575jU。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-加ic。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測高同型半胱氨酸血癥易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測CBS基因SEQ IDNO1中第115位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測分析個體的CBS基因上SNP位點基因攜帶型來預(yù)測個體對高同型半胱氨酸血癥的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101130810SQ20061003038
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司