專利名稱：一種食管癌易感性檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢糖用的試劑盒，尤其是一種檢糖食管痛易接性的試自，通過iNtlx射線交糖互補(bǔ)修復(fù)基因l (X-ray repair cross~ complementing gene 1, XRCC1)的單核苷敏多態(tài)性(SNP)位 點(diǎn)來預(yù)測個(gè)體對(duì)食管痛的易感性。背豕技術(shù)食蟹痛是原發(fā)于食管的M腫癍，以麟狀上皮痛多見，是世界一些頃家和地區(qū)的鄰見病，tt^上以進(jìn)行性吞嚼困難為康典型的癥狀。中國是世界上食管痛的離發(fā)國家，也是世界上^r痛爽死亡率^ft家之一，*￥均死亡率為14.59/10萬，食管痛的流行病學(xué)有以下特點(diǎn)(Dlfe區(qū)性分布，如在我讎北方發(fā)鏑率可達(dá) 1 /10萬，而美國僅為5/10萬；而且在同一省的不同地區(qū)存在週然不同的紫病情況，離發(fā)與低發(fā)區(qū)之 間的發(fā)病率相差數(shù)十倍到二三百倍②男性布于女性，其比例為1.3 3: I:③食管痛中老年易患，我國拍 ,的息者發(fā)病在50歲以后,髙發(fā)地區(qū)人群發(fā)病和死亡比低發(fā)地區(qū)提前10年，食管痛的確切病因目前尚不清楚，其發(fā)生與該地區(qū)的生活條件、飲食習(xí)慣、存在理致痛物、缺乏一些 自因素及有遺傳易感性等有關(guān).亞硝胺是被公認(rèn)的化學(xué)致癌物，在離發(fā)區(qū)的糧食和飲水中，含量顯著場 離，且與當(dāng)?shù)厥彻馨┖褪彻苌掀ぶ囟人幕疾÷食收嚓P(guān)，各種霧變食物能產(chǎn)生S^f物質(zhì)，tt刀菌、白 地霧苗、黃曲S菌和黑曲霧菌等真菌不但能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，并能増加二級(jí)胺的含貴，促進(jìn)亞硝胺 的合成?；I菌與亞硝胺協(xié)同致癌.食物粗糙、進(jìn)食過燙，咀 檳梅或煙絲等習(xí)憤，造成對(duì)食管粘鵬的慢性 理化刺激，可致局限性或彌漫性上皮增生，形成食管痛的痛前期病變，慢性食管疾病如腐蝕性食管灼傷和 狹窄、胃食管反流病、食管賁門失弛緩癥或食管憩室等患者食管癌發(fā)生率埔商，可能是由于食管內(nèi)容物滯 苗而致慢性刺激所致，飲食缺乏動(dòng)物蛋白、新鮮蔬菜和水果，攝入的維生素A、 B2和C缺乏，是食管癌 的危險(xiǎn)因素*流行病學(xué)調(diào)査表明，食物、飲水和土壤內(nèi)的元素鉬、硼、鋅、鎂和鐵含量較低，可能與食管 Ml的發(fā)生間接相關(guān)。食管痛的發(fā)病常表現(xiàn)家族性聚集現(xiàn)象。在我國離發(fā)地區(qū)，本病有陽性家族史者達(dá)25 % 50%,其中父系最高，母系次之，旁系最低。食管痛離發(fā)家族的外周血淋巴細(xì)胞染色體疇變率較高， 可能是決定高發(fā)區(qū)的食管痛易感性的遺傳因素。環(huán)境和遺傳等多因素引起食管痛的發(fā)生，其涉及的分子生物學(xué)基礎(chǔ)是癌基困激活或抑痛基因失活一組 基因變化所致，研究已證實(shí)的有Rb、 p53等抑癌基因失活，以及環(huán)境等多因素使屎痛基因H-ras、 C-mys 和hsl-l等激活有關(guān)。XRCCl位于第19號(hào)染色體lql3.2-13.3位置，全長32.3欣，mRNA全長2鵬7bp,共有17個(gè)外顯子， m634個(gè)氨基酸的蛋白。XRCC1繍碼的蛋白對(duì)因電離輾射和烷基化物弓l起的DNA^4t斷裂i^到有效 的睡復(fù)作用.XRCCl編碼的蛋白與DNA連接ilIII、聚合酶e、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)^K交互作用，參與DMA 賺基切除條復(fù)(Base Excision Repair, BER)通路。XRCC1參與的DNA修霣通路繊傳性或獲得性缺 陷將破壞基因的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)變，從而影響個(gè)體對(duì)腫癯疾病的易li^。眾多研究顯示，XRCC1 gi話上部分位點(diǎn)的多態(tài)性，與痛癥發(fā)生有密切的關(guān)系。與XRCC1相關(guān)的癌癥主要有乳臁痛、頭頸部鑽 糊胞痛、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰鵬、肺痛等。SNP(single nucleotide polymorphi柳)，即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記*主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性, ^括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占 大約90%,這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾癇，特別是復(fù)雜疾病的易感 性、和對(duì)環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。rsl799782是位于第19號(hào)染色體XRCC1基因上的一個(gè)CYT多態(tài)，引起XRCC1基因編碼的蛋白第194 個(gè)氨基酸由Aig變?yōu)門rp。在世界人群中的該多態(tài)的頻率分布，C占0.8752， T占0.125左右。中理人群中 的分布C為0.72, T為0.28。國內(nèi)研究表明，攜帶XRCCl"npTip基因型的個(gè)體患食管痛的風(fēng)險(xiǎn)度為其他 人群的2倍左右，因此rel799782位點(diǎn)攜帶T型即為食管痛易感型
發(fā)明內(nèi)容
基于XRCC1基因上的rsl799782號(hào)SNP位點(diǎn)可用來評(píng)估個(gè)體對(duì)食蟹痛的易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明襯 供一種檢擁食管痛易感性的試劑盒，該試劑盒包括檢擁XRCC1基因SEQ ID NO: 1中第146位SNP的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、 Taq瞎、dNTP混合液、MgCh溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性弓l物對(duì)是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第1站位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增 出SEQ ID NO: 1中包含第146位SNP位點(diǎn)的咖A片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本鎮(zhèn)域技術(shù)人員能夠 輕易完成的.優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī) 的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對(duì)引物，本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過熒光 定量PCR技術(shù)特異性檢測出這個(gè)SNP位點(diǎn)食管癌易感基因型的探針。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫咖探針。特異性熒光探針可用常 規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成.本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這條探針，所有可 用于熒光定量PCR檢測SEQ ID NO: 1中第l站位SNP位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi).本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 ljil 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液， 0. 25nM dNTP混合液， 0.6)il 25mH UgCl,溶液， 0.025|il (5units/pl) T叫DNA榮合酶， 加一特異性引物對(duì)(兩條)各0.225^1, 10叫特異性熒光探針0.25jil, 去離子水5. 575jil。本試劑盒供一人份檢擁應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20lC。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通 照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件，^Mi例l.檢測試劑盒的使用 步漏l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢擁食管痛易感性的熒光定量PCR檢淵試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針有義引物5' - TTAGAAGGTCACAGTCACCA -3'(SEQ ID NO: 2) Tm值為561C反義引物5' - TCTCAACCCTACrCACTCA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為561C熒光探針5' - GCTCTCTTCTTCAGCTGGATC -3' (SEQ ID NO: 4) Tm值為641C熒光定麓PCR反應(yīng)體系為總體積10|U,包含濃度為20ng/fil的DNA模板2{U、 10 X熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0.1^1 25nH dNTP混合液、0.6fil 25nM MgCl:溶液、0.025^1 (5units/fi1〉 Taq DNA聚合,、 2QMll的有義引物和反義引物各0.225pl、 10jiM的熒光探針0.25nl，去離子水5. 575^1.在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為501C、 2分鐘，訴1C、 10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的 訴1C、 30秒，601C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光童，
步賽3: SNP基因型分析
將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光貴和正常對(duì)照相對(duì)比，熒光探針最終的熒光信號(hào)明顯髙于正 常對(duì)照，說明被檢測DNA的XRCC1基因上rsl799782號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有T型，為食管痛易感型，
，例2.指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防食管痛的甩務(wù)
目前在上海主健生物工程有限公司已經(jīng)開展了這項(xiàng)服務(wù)。 步驟l: DNA提取對(duì)被檢測者進(jìn)行服務(wù)前咨詢，由被檢淵者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査表，依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)激的DNA油提，步驟2:基因分型檢湄使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測者咖A的XRCC1基因上的rsl799782號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定童 PCR檢測，確定該SNP位點(diǎn)的基因型。步爽3:指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防食管癌通過對(duì)被檢獮者SNP基因型的分析，出具基因分型檢擁報(bào)告和被檢測者個(gè)體化健lft指導(dǎo)報(bào)吿，基因檢 旨吿詳細(xì)說明了被檢測者食管癌易感程度的商低以及患病的概率大小。個(gè)體化鎮(zhèn)康指導(dǎo)報(bào)吿以被檢擁者 的基因分型檢SI結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査結(jié)果，評(píng)估被檢瀾者食管痛逮傳易感的相對(duì)風(fēng) 險(xiǎn)*同時(shí)制定出針對(duì)于被檢測者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，方案包括在飲食習(xí)慣、生活方式上的改進(jìn)建議等， 并為被檢淵者普及預(yù)防食管癌的健康知識(shí)。 序列表<110>上海主健生物工程有限公司 <120>—種食管痛易感性檢測試劑盒<歸4<210>1<211>300<212>鵬A<213>人厲，人種(Homo sapiens, human)<柳> 1ctccaccccc acctgccagc agcccaccta t幼tactgac cttgcgg辟c cttagaa辟t 腳agtgacc aagcttggcc agttccgtgt gaagg鄉(xiāng)ag gatgagagcg ccaactctct gQggccgggg gctctcttct tcagccggat caac幼gaca tccccaggtg agctcggaca apgtgggtcc tgagtgagta鵬ttg卿c ctagactcgt gggtctg郷gtag叫g(shù)鵬 ctg鵬ctca gattcctggg tct鵬ggag g鄉(xiāng)gtagtg gagtcctgga ctcctgggtc60120180240300<210> 2 <211> 20 <212>鵬A <213>人工序列<220><223>引物<柳> 2ttagoaggtg acagtgacca 20<210> <211> <212> <213>319DNA人工序列<咖><幼3>引物<柳> 3tctcaaccct actcactca 19
<210> 4 <211> 21 <212>腿 <213>人工序列<卿><2 3>探針 <勸0> 4gctctcttct tcagctggat c 21,
權(quán)利要求
1.一種用于檢測食管癌易感性的試劑盒，其特征在于包括檢測XRCC1基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是嫩對(duì)STOIDNO: 1中第146 位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)堆出包含SEQ ID NO: 1中第146位SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQIDNO: l中第 146位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過熒光定豕PCR技術(shù)特異性檢擁出該SNP位點(diǎn)食管痛易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在干所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQIDNO: 2和3所 示序列的引物對(duì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO: 4所示 序列的Taqman探針，
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括IOX熒光定量PGR反 自沖液，O.l(il 25nM dNTP混合液，0.6|il 25rnM MgCl,溶液，0.025)il (5units/(il) T叫DNA聚合糖， 20MM特異性引物對(duì)(兩條)各0.225fU, IOjiM特異性熒光探針0. 25(U,去離子水5. 575jil。本試劑盒供 —人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20TC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測食管癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測XRCC1基因SEQ ID NO1中第146位SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測分析個(gè)體的XRCC1基因上SNP位點(diǎn)基因攜帶型來預(yù)測個(gè)體對(duì)食管癌的易感性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101131359SQ20061003038
公開日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司