專利名稱：一種通過cyp1a1基因檢測肺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用亍檢測疾病易感性的試劑盒，尤其楚一種檢測肺癌易感性的試劑盒，通過檢測對細 胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450， family 1， subfamily A, polypeptide 1 ， CYPl Al)的單核苷酸多態(tài) 性位點來預(yù)測個體對肺癌的易感性。
背景技術(shù)：
.原發(fā)性支氣管肺癌，簡稱肺癌，為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴重威脅人民健康和 生命的疾病。腫瘤細胞源于支氣管粘膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，早期常有剌激性咳嗽、痰 中帶血等呼吸道癥狀，病情進展速度與細胞的生物特性有關(guān)。半個世紀以來，世界各國肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高趨勢。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年報告 1997年全世界死于惡性腫瘤的共706.5萬人，占死亡人數(shù)的12.6%,其中肺癌占惡性腫瘤死亡的19%，居 惡性腫瘤死因的第一位。我國19卯 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫瘤死亡中，肺癌由原來的 第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的也是肺癌。云南錫礦的肺癌發(fā)病率在1954 1959年間為28.02/10 萬，1%0 1969年間為197. 87/10萬，1970 1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見的。英 國著名腫瘤學(xué)家R.Peto預(yù)言如果我國不及時控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年肺癌將超過100 萬，成為世界第一肺癌大國。病因和發(fā)病機制迄今尚未明確。 一致認為肺癌的發(fā)病與下列因素有關(guān)①吸煙(包括主動吸煙和被動 吸煙)；②職業(yè)致癌因子，己被確認的致人類肺癌的職業(yè)因素包括石棉、無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及 其化合物、鎳、氡、芥子氣、氯乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等；③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染)；④電離輻射； 飲食與營養(yǎng)，美國紐約和芝加哥開展的前瞻性人 群觀察的結(jié)果說明，食物中天然維生素A類、P胡蘿卜素的攝入量與十兒年后癌癥的發(fā)生呈負相關(guān)，其中 最突出的是肺癌； 其他，美國癌癥學(xué)會將結(jié)核列為肺癌的發(fā)病因素之一。有結(jié)核病者患肺癌的危險性是 止常人群的10倍。其主要組織學(xué)類型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲霉)、機體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對肺癌的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些癌基閎的活化及抑癌基因的失活密切相關(guān)。己經(jīng)證明的幾個癌基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、機制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基因p53、 pl6和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細胞肺癌中均有過度表達。 非小細胞肺癌中則?？梢妑as族基因的過度表達。這些深入的研究將為基因預(yù)防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。CYP1A1基因位f第15號染色體15q22-q24位置，全長6.0kb， mRNA全長2601bp,共有7個外顯子， 編碼513aa的細胞色素P4501A1。P4501A1是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類,被激活的CYP1A1 能將多種環(huán)境中的有機物質(zhì)如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多環(huán)芬芳碳氫化合物轉(zhuǎn)化為細胞 毒素或其他致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生的危險。國內(nèi)外的眾多研究顯示CYP1A1的多態(tài)與野生型相比有 更高的酶接觸反應(yīng)活性和可誘導(dǎo)性，從而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的危險度。細胞色素P450酶(CYP450)是細胞內(nèi)重要的I相代謝酶，在致癌物的活化和解毒過程中起著重要的 作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類。CYP1A1作為一種微神經(jīng)元體細胞酶與一 些致癌物質(zhì)的生物激活有關(guān)，例如benzo[a]pyrene。同時，CYP1A1易于被TCDD和多環(huán)的芳香族化合物 所誘變，包括3-甲基膽蒽等實驗室用致癌物質(zhì)。目前的動物實驗表明，CYP1A1的表達與芳基碳氫化合物 受體(AhR)禾UArnt (AhR Nuclear Translocator)的激動劑，以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor)的 拮抗劑有關(guān)。同時，CYP1A1通過C2羥基化作用參與雌激素的代謝活動。SNP(single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性標記，是一類基于單堿基變異引起的DM 多態(tài)性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因纟且中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標記，占 大約90%。這些基閔組齊列變異可以導(dǎo)致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是復(fù)雜疾病的易感性、和對環(huán)境因素、藥物反應(yīng)的差異。rsl048943是位于CYP1A1基因上的一個A/G多態(tài)，位于第7外顯子462號氨基酸由He轉(zhuǎn)化為Val。 目前NCBI公布的世界人口頻率A:G為0.896:0.104,雜合度0.186。世界人群的關(guān)聯(lián)分析表明，CYP1A1 Ue462Val位點ValVal和Vallle基因型在肺癌病例組中的頻率明顯高于對照組，在女性中風(fēng)險度尤其突出。 基于多個中國人群肺癌發(fā)病與CYP1A1 Ue462Val位點的關(guān)聯(lián)分析研究，上千例肺癌個體與健康對照個體的 分析，顯示CYPlAlIle462Val這種位于酶蛋白的血紅素結(jié)合區(qū)的變異，是中國人群中重要的肺癌遺傳易感 因素之--，在女性中尤為突出。酶動力學(xué)研究表明，3種基因型表達的酶活性存在差異。Val/Val活化毒物 的能力最強，Ue/Val次之，而lle/Ile最弱。研究顯示，CYPlAlValVal基因型是中國人群中重要的肺癌遺 傳易感因素之一，rsl048943位點攜帶G型即為食管癌易感型。發(fā)明內(nèi)容基于CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點可用來評估個體對肺癌的易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供 一種用于檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A基因SEQ ID NO: 1中第161位SNP的特異性引物對及特異性熒光探針、 Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增 出SEQ ID NO: 1中包含第161位SNP位點的DNA片段的引物對。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對。特異性引物對可用常規(guī) 的合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光 定量PCR技術(shù)特異性檢測出該SNP位點肺癌易感基因型的探針。設(shè)計這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易 完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的Tacpan探針。特異性熒光探針可用常規(guī)的 合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這條探針，所有可用于 熒光定量PCR檢測SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 "I 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液， 0. lul 25mM dNTP混合液， 0.6nl 25raM MgCh溶液， 0.025fil (5units/jxl) Taq DNA聚合酶， 20nM特異性引物對(兩條)各O. 225^1, lOpM特異性熒光探針O. 25nl， 去離子水5. 575nl。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢測肺癌易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針 有義引物5' - GTGTTAAGTGAGAAGGTGAT -3， (SEQ ID NO: 2) Tm值為56。C 反義引物5' - AGGATAGCCAGGAAGAGMA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為58。C 熒光探針5' - TATCGGTGAGACCGTTGCCC-3' (SEQ ID NO: 4) Tm值為64。C熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積10nl,包含濃度為20ng/nl的DNA模板2pl、 lpl 10 X熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0. 25mM d證混合液、0. 6pl 25mM MgCl2溶液、0. 025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 2(HiM的有義引物和反義引物各0.225pl、 10nM的熒光探針0.25^,去離子水5. 575^1。在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5CTC、 2分鐘，95°C、 10分鐘，進行60個循環(huán)的 95X;、 30秒，6(TC、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。 步驟3: SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針最終的熒光信號明顯高于正 常對照，說明被檢測DNA的CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點基因型攜帶為G型，為肺癌易感型。實施例2.指導(dǎo)人們主動預(yù)防肺癌的服務(wù)目前在上海主健生物工程有限公司已經(jīng)開展了這項服務(wù)。 步驟l: DNA提取對被檢測者進行服務(wù)前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。 步驟2:基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點進行熒光定量 PCR檢測，確定該SNP位點的基因型。步驟3:指導(dǎo)人們主動預(yù)防肺癌通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導(dǎo)報吿。基因檢 測報告詳細說明了被檢測者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。個體化健康指導(dǎo)報告以被檢測者的 基函分型檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査結(jié)果，評估被檢測者肺癌遺傳易感的相對風(fēng)險。 同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習(xí)慣、生活方式上的改進建議等，并 為被檢測者普及預(yù)防肺癌的健康知識。
序歹U表<110>上海主健生物丁.程有限公司<120〉 一種通過CYP1A1基因檢測肺癌易感性的試劑盒<160〉 4<210〉 1 〈211〉 300 <212> DNA <213>人屬，人種(Homo sapiens, human)< 1gccacttcagacctgaacggtatctttggctctcttcctgggacatgaccctgtctccct ctggttacag gaagctatgg gtcaacccat ctgagttcct 60tttctcaccc ctgatggtgc tatcgacaag gtgtt卿tg卿aggtgat 120atgggcaagc ggsagtgtat cggtg卿cc attgcccgct ggg3ggtctt 180gctatcctgc tgcsacgggt gg33ttcagc gtgccactgg gcgtga鄉(xiāng)t 240ccc3tct3tg ggctaaccat g幼gc8tgcc tgctgtg3gc acttccaaat 300<210> 2 .<211> 20 <212>艦 〈213〉人工序列<220〉<223〉引物<400〉 2gtgttaagtg agaaggtgat20<210> 3 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223>引物<柳〉3agptagcca ggaagagaaa20
〈210〉 4 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>探針 〈400〉 4tateggtgag accgttgccc 20
權(quán)利要求
1.一種肺癌易感性檢測試劑盒，其特征在于包括檢測CYP1A1基因SEQ ID NO1中第161位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在T:所述的特異性引物對是指針對SEQIDNO: 1中第161 位SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位點的咖A片段的引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對SEQ ID NO: l中第 161位SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測出該SNP位點肺癌易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在T:所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: 2和3所 示序列的引物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在P:所含的特異性熒光探針選自具有SEQ IDNO: 4所示 序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括lpl IOX熒光定量PCR反 應(yīng)緩沖液，0. lul 25mM dNTP混合液，0. 6^1 25mM MgCl2溶液，0. 025fil (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20pM特異性引物對(兩條)各0.225^1， 10nM特異性熒光探針0.25fil，去離子水5.575^1。本試劑盒供 一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2(TC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肺癌易感性檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP1A1基因SEQ ID NO1中第161位SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測分析個體的CYP1A1基因上SNP位點基因攜帶型來預(yù)測個體對肺癌的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101130813SQ200610030388
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司