專利名稱：木霉菌轉化子的限制性內(nèi)切酶介導基因整合化構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種木霉菌轉化子的限制性內(nèi)切酶介導基因整合化構建方法，通過限制性內(nèi)切酶介導的基因整合(REMI)轉化技術，對生物防治真菌-木霉菌(Trichoderma harzianum，Trichoderma atroviride)的菌株分子進行改良，獲得優(yōu)良生物防治木霉菌突變株，用于防治植物病害。
背景技術：
木霉菌作為國際公認的一類環(huán)境友好防治各種植物病害的生物防治真菌，是創(chuàng)制多功能生物農(nóng)藥的重要微生物和基因資源。然而目前生產(chǎn)上應用的木霉菌主要是自然篩選獲得的，無論在病害防治水平、穩(wěn)定性和抗逆性度等方面尚不理想，因此急需應用生物技術進行改良，為創(chuàng)制高效生物農(nóng)藥提供源源不斷的優(yōu)良菌株資源。目前改良木霉菌的技術主要有理化誘變育種，原生質體融合、插入突變和基因轉化等。Papavizas等曾用紫外線誘變木霉菌，獲得了對苯菌靈等類殺菌劑有抗性的菌株，從而制備出木霉菌和苯菌靈殺菌劑復合制劑。Harman(1986)等通過原生質體融合技術選出比親本菌株防治病害效果更好的融合子(Trichoderma harzianum strain T22。Limon等(1998)利用amS基因及其木霉菌幾丁質酶基因chit33共轉化哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)CECT2413得到了幾丁質酶基因超量表達的轉化菌株，與野生型菌株相比，對Rhizoctonia solani的抑菌活性明顯提高。然而無論要篩選高效生物防治菌株，還是克隆新的生物防治相關基因均需要創(chuàng)造大量的突變株，然后進行篩選。目前創(chuàng)造突變的方法主要以理化誘變法為主，該方法誘變效率低，需要從大量的菌株中通過單個克隆來篩選突變體，同時要探明影響突變體的營養(yǎng)和形態(tài)的變化，需用圖譜等方法克隆突變基因，費工費時。限制性內(nèi)切酶介導的基因整合化技術的插入突變是在限制性內(nèi)切酶介導下通過質粒DNA的異源隨機插入而使基因突變，從而直接獲得突變株和基因標記。研究表明，此技術應用于生物防治木霉菌菌株進行分子改良，一方面可篩選出優(yōu)良突變株直接用于防治植物病害生物農(nóng)藥制備，另一方面可以利用標簽質粒DNA序列和單拷貝插入的特點，高效分離生物防治相關基因。但目前尚未見有公開報道的相關技術。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種木霉菌轉化子的限制性內(nèi)切酶介導基因整合化構建方法，得到比親本菌株拮抗譜更廣，防治效果更高、更好的優(yōu)良木霉菌菌株，以增強木霉菌的生防效果及穩(wěn)定性。
為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明以生物防治真菌-木霉菌為原始出發(fā)菌，將提取質粒DNA與制備的木霉菌原生質體混合，在限制性內(nèi)切酶的作用下，使外源線性質粒pV2片段插入木霉菌染色體組誘導插入突變，獲得轉化子，然后對突變的轉化子進行篩選，得到比親本生物防治病害效果更好的優(yōu)良木霉菌突變株，從中可篩選到對番茄灰霉病和黃瓜枯萎病等防治效果顯著高于野生菌株的轉化子。
本發(fā)明的方法具體包括以下步驟1.木霉菌菌株原生質體的制備本發(fā)明采用生物防治效果明顯的木霉菌制備原生質體。首先將木霉菌在PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)上培養(yǎng)產(chǎn)孢后，用無菌水洗下木霉菌孢子，然后將木霉菌孢子加入PDB液體培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基)中，在25-30℃下，100-150轉/分搖床培養(yǎng)18-22小時，用布氏漏斗過濾收集菌絲，再用0.7摩爾/升NaCl溶液沖洗菌絲。
將崩潰酶用0.7摩爾/升NaCl溶液配制濃度為13-20毫克/毫升的酶液，將上述得到的菌絲放入離心管中，再將配制好的崩潰酶酶液以菌絲2倍體積的量加入到盛有菌絲的離心管中，將離心管放在搖床上，在25-30℃下以120-150轉/分振蕩培養(yǎng)3-4小時，然后過濾，并用0.7摩爾/升NaCl溶液沖洗菌絲，收集原生質體于離心管中，在4℃下4000轉/分離心15分鐘，倒掉上清液，向離心管中加入山梨糖醇緩沖液沖洗原生質體沉淀，并在4℃下4000轉/分離心15分鐘，倒掉上清液，得到原生質體沉淀。重復用山梨糖醇緩沖液沖洗原生質體沉淀、離心、去上清共2-3次。再根據(jù)得到的原生質體的量向管中加入山梨糖醇緩沖液，調節(jié)原生質體濃度至107-108個/毫升。
本發(fā)明所述山梨糖醇緩沖液的組分為山梨醇316.256克、PH7.5的1摩爾/升Tris-Hcl 10毫升、CaCl21.11g，加水定容到1000ml。
2.質粒提取與DNA消化吸取含有質粒PV2的冷凍保存的菌種100微升，加到含有50微克/毫升的氨芐青霉素的100毫升的LB液體培養(yǎng)基上，37℃140-200轉/分搖床培養(yǎng)12-16小時，取已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的1.5毫升細菌培養(yǎng)液放于1.5毫升的離心管中，5000轉/分離心5分鐘。棄上清，向留有沉淀的離心管中加入100微升含有50毫摩爾/升葡萄糖，10毫摩爾/升乙二胺四乙酸，25毫摩爾/升Tris HCl的溶液I進行懸浮沉淀，冰浴5-10分鐘，再加入200微升含200毫摩爾/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分鐘使質粒DNA變性后，再加入150微升含3摩爾/升醋酸鉀，pH4.8的溶液III，混勻，冰浴5-10分鐘。向離心管中加入450微升的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，10000轉/分離心10分鐘。吸取上清于另一離心管中，向其中加入與上清等體積的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，重復此抽提步驟2-3次。最后小心吸取上清于另一離心管中，向管中加入上清液的2倍體積的預冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鐘左右，10000轉/分離心10分鐘，倒掉上清，向管中沉淀加入30-50微升10毫摩爾/升Tris.Hcl，1毫摩爾/升乙二胺四乙酸配置的緩沖液，得到了含有少量RNA的DNA溶液。向此溶液中加入無DNA的RNase A，使其終濃度達10-20微克/毫升左右，37℃溫育30-60分鐘，去除RNA得到質粒DNA。
所述LB培養(yǎng)基的組分為10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去離子水中，調節(jié)pH值到7.0，每瓶100毫升分裝滅菌后備用。
3.轉化在50毫升離心管中加入質粒40微克、濃度為10個單位/微升限制性內(nèi)切酶HindIII10微升、山梨醇緩沖液200微升，配制成酶-質粒混合液，然后向離心管中加入100-200微升原生質體懸浮液，并使其與酶-質?；旌弦夯靹颍帽?5-20分鐘，緩慢向管中加入2毫升聚乙二醇，冰浴20-25分鐘，然后將離心管取出在28℃下放置10-20分鐘，加入5毫升預冷的山梨醇緩沖液，4℃下2000轉/分離心15分鐘，棄上清，加入3毫升液體再生培養(yǎng)基，25-30℃下放置6小時。將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，然后加入約15毫升預先熔化好的，并且冷卻至50℃左右的固體再生培養(yǎng)基，盡快搖晃使培養(yǎng)液與培養(yǎng)基混勻，使其冷卻干燥，熔化水瓊脂，并冷卻至50℃左右，加入潮霉素至濃度為300微克/毫升，快速倒入平板中，在培養(yǎng)基表面鋪滿一層為止，每個平板約需10毫升，在28-30℃下，培養(yǎng)4-5天，將能夠抗潮霉素的菌落轉移到預先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固體PDA培養(yǎng)基上進行二次篩選，第二次篩選得到的木霉菌即為所要得到的轉化體。
根據(jù)抗潮霉素基因序列，設計引物進行PCR檢測，以pV2為模板和潮霉素和氨芐青霉素的基因序列為探針，轉膜印跡檢測轉化子。經(jīng)PCR和Southern blot檢測為突變株的轉化子經(jīng)繼代培養(yǎng)，將確定為可以穩(wěn)定遺傳的轉化子的菌株制成硅膠粒在-20℃冰箱中保存，用于優(yōu)良生物防治菌株篩選。
所述液體再生培養(yǎng)基的組分為(NH4)2SO42.8克、尿素600毫克、磷酸鉀4克、葡萄糖40克、蔗糖100克、CaCL2600毫克、MgSO4.10H2O 200毫克、FeSO4.7H2O 10毫克、ZnSO4.7H2O 1.8毫克、MnSO4.H2O 3.2毫克、CoCL2.6H2O4毫克。
所述固體再生培養(yǎng)基的組分在液體再生培養(yǎng)基組分的基礎上，再加入瓊脂17-20克。
本發(fā)明利用限制性內(nèi)切酶介導的基因整合轉化技術，已經(jīng)證明此技術可以使轉化頻率和單拷貝整合事件明顯提高。此外，此技術的另一個優(yōu)點是便于快速、有效地分離目的基因。在這種插入突變體中，轉化DNA自然標記了插入位點附近的DNA，因此，插入誘變流程可通過回收帶有兩側側翼片段的質粒而大大加速各個基因的克隆。轉化后，可以獲得很多表型和基因型有差異的突變子，從中篩選目標轉化子用于進一步的研究。通過本發(fā)明可以得到大量的木霉菌轉化子，比一般質粒轉化方法可顯著提高真菌的轉化效率20-60倍，并可從中篩選到對番茄灰霉病和黃瓜枯萎病等防治效果顯著高于野生菌株的轉化子，為擴大菌種資源，克隆生物防治基因資源，獲得多功能生物防治菌株奠定基礎。
具體實施例方式
以下結合具體的木霉菌轉化子的生物防治效果實施例對本發(fā)明作進一步的說明。以下實施例不構成對本發(fā)明的限定。
實施例1 防治番茄灰霉病木霉菌轉化子的構建1.原生質體的制備在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)木霉菌T21約3～4天，收集孢子于無菌水中，孢子懸浮液的濃度大約為107個孢子/毫升。將得到的孢子懸浮液1毫升加入到100毫升的PDB液體培養(yǎng)基中，25℃、110轉/分振蕩培養(yǎng)20小時后得到木霉菌菌絲，無菌條件下收集菌絲于無菌的50毫升的離心管中，并確定其重量。
將崩潰酶用0.7摩爾/升NaCl溶液配制濃度為13毫克·毫升-1的酶液，加入到盛有菌絲的離心管中，加入量為菌絲重的2倍。將離心管放在搖床上，28℃下130轉/分振蕩培養(yǎng)3小時。過濾除去菌絲碎片，并用0.7摩爾/升NaCl溶液沖洗菌絲，收集原生質體溶液于50毫升離心管中。將離心管在4℃下以4000轉/分鐘離心15分鐘，倒掉上清液，再向管中加入5毫升山梨糖醇緩沖液沖洗原生質體沉淀，并在4℃下4000轉/分離心15分鐘，倒掉上清液，收集原生質體，重新用山梨醇緩沖液反復洗滌原生質體2～3次。最后根據(jù)得到的原生質體的量向管中加入山梨糖醇緩沖液，調節(jié)原生質體濃度至107-108個/毫升。
所述PDA培養(yǎng)基的組分馬鈴薯200g，葡萄糖17-20克，瓊脂條15-20克，加水定容到1000毫升，分裝滅菌后備用，用于木霉菌產(chǎn)孢。
所述PDB培養(yǎng)基的組分馬鈴薯200克，葡萄糖17-20克，酵母膏15克，加水定容到1000毫升，分裝滅菌后備用，用于培養(yǎng)木霉菌菌絲。
所述山梨糖醇緩沖液的組分山梨醇316.256克、PH7.5的1摩爾/升Tris-Hcl 10毫升、CaCl21.11g，加水定容到1000ml。
2.pV2質粒的提取與DNA消化質粒pV2由中國農(nóng)業(yè)大學彭友良教授提供。
吸取含有質粒PV2的冷凍保存的菌種100微升，加到100毫升的LB液體培養(yǎng)基中，再向其中加入氨芐青霉素使其終濃度達到50毫克/毫升，37℃140轉/分搖床培養(yǎng)14小時，取已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的1.5毫升細菌培養(yǎng)液放于1.5毫升的離心管中，5000轉/分離心5分鐘。棄上清，向留有沉淀的離心管中加入100微升含有50毫摩爾/升葡萄糖，10毫摩爾/升乙二胺四乙酸，25毫摩爾/升Tris HCl的溶液I進行懸浮沉淀，冰浴5-10分鐘，再加入200微升含200毫摩爾/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分鐘使質粒DNA變性后，再加入150微升含3摩爾/升醋酸鉀，pH4.8的溶液III，混勻，冰浴5-10分鐘。向離心管中加入450微升的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，10000轉/分離心10分鐘。吸取上清于另一離心管中，向其中加入與上清等體積的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，重復此抽提步驟2-3次。最后小心吸取上清于另一離心管中，向管中加入上清液的2倍體積的預冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鐘左右，10000轉/分離心10分鐘，倒掉上清，向管中沉淀加入30微升由10毫摩爾/升Tris.Hcl，1毫摩爾/升乙二胺四乙酸配置的緩沖液中，得到了含有少量RNA的DNA溶液。向此溶液中加入無DNA的RNase A，使其終濃度達10-20微克/毫升左右，37℃溫育30分鐘，去除RNA得到質粒DNA。
所述LB液體培養(yǎng)基的組分為10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去離子水中，調節(jié)pH值到7.0，每瓶100毫升分裝滅菌后備用。
3.轉化取1.5毫升的離心管，加入定量的pV2質粒40微克，10個單位/微升的介導酶HindIII 10微升，200微升的山梨醇緩沖液，配制成酶-質?；旌弦?，置冰上備用。取100微升調好濃度的原生質體懸浮液于50毫升離心管中，再加入已配好的酶-質?；旌弦海靹蚝?，置冰上15分鐘。逐滴緩慢向管中加入2毫升聚乙二醇，置冰上20分鐘后，然后將離心管取出在28℃下放置10分鐘，再向離心管中加入5毫升冰預冷的山梨醇緩沖液，然后于4℃下2000轉/分鐘離心15分鐘，棄上清。加入3毫升液體再生培養(yǎng)基，28℃下放置6小時。將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，然后加入約15毫升預先熔化好的，并且冷卻至50℃左右的固體再生培養(yǎng)基，盡快搖晃使培養(yǎng)液與培養(yǎng)基混勻，使其冷卻干燥，熔化水瓊脂，并冷卻至50℃左右，加入潮霉素至濃度為300微克/毫升，快速倒入平板中，在培養(yǎng)基表面鋪滿一層為止，每個平板約需10毫升，在28℃下，培養(yǎng)4天，將能夠抗潮霉素的菌落轉移到預先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的PDA培養(yǎng)基上進行二次篩選，第二次篩選得到的木霉菌即為所要得到的轉化體。
根據(jù)抗潮霉素基因序列，設計引物進行PCR檢測，以pV2為模板和潮霉素和氨芐青霉素的基因序列為探針，轉膜印跡檢測轉化子。經(jīng)PCR和Southern blot檢測為突變株的轉化子經(jīng)繼代培養(yǎng)，將確定為可以穩(wěn)定遺傳的轉化子的菌株制成硅膠粒在-20℃冰箱中保存，用于優(yōu)良生物防治菌株篩選。
生物防治活性鑒定根據(jù)離體接種的結果選擇抑病效果好的轉化子Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55的孢子懸浮液噴霧接種，每處理10株，30株噴孢子懸浮液150毫升，置于人工氣候室中生長。濕度保持在90％以上，24小時后接種灰霉病菌，7天后調查發(fā)病情況。結果表明，轉化子Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55防病效果明顯高于出發(fā)菌株T21和對照。其中轉化子Ttrm31對番茄灰霉病的防效比出發(fā)菌提高20％。
實施例2 防治黃瓜枯萎病的木霉菌轉化子的構建1.原生質體的制備在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)木霉菌T21約3～4天，收集孢子于無菌水中，孢子懸浮液的濃度大約為107個孢子/毫升。將得到的孢子懸浮液1毫升加入到100毫升PDB液體培養(yǎng)基中，30℃、130轉/分振蕩培養(yǎng)22小時后得到木霉菌菌絲，無菌條件下收集菌絲于無菌的50毫升的離心管中，并確定其重量。
將崩潰酶用0.7摩爾/升NaCl溶液配制濃度為15毫克/毫升的酶液，加入到盛有菌絲的離心管中，加入量為菌絲重的2倍。將離心管放在搖床上，30℃下150轉/分振蕩培養(yǎng)4小時。過濾除去菌絲碎片，并用0.7摩爾/升NaCl溶液沖洗菌絲，收集原生質體溶液于50毫升離心管中。將離心管在4℃下以4000轉/分鐘離心15分鐘，倒掉上清液，再向管中加入5毫升山梨糖醇緩沖液沖洗原生質體沉淀，并在4℃下4000轉/分離心15分鐘，倒掉上清液，收集原生質體，重新用山梨醇緩沖液反復洗滌原生質體2～3次。最后根據(jù)得到的原生質體的量向管中加入山梨糖醇緩沖液，調節(jié)原生質體濃度至107-108個/毫升。
2.pV2質粒的提取與DNA消化吸取含有質粒PV2的冷凍保存的菌種100微升，加到含有50微克/毫升的氨芐青霉素的100毫升的LB液體培養(yǎng)基上，37℃200轉/分搖床培養(yǎng)15小時，取已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的1.5毫升細菌培養(yǎng)液放于1.5毫升的離心管中，5000轉/分離心5分鐘。棄上清，向留有沉淀的離心管中加入100微升含有50毫摩爾/升葡萄糖，10毫摩爾/升乙二胺四乙酸，25毫摩爾/升Tris HCl的溶液I進行懸浮沉淀，冰浴5-10分鐘，再加入200微升含200m摩爾/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分鐘使質粒DNA變性后，再加入150微升含3摩爾/升醋酸鉀，pH4.8的溶液III，混勻，冰浴5-10分鐘。向離心管中加入450微升的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，10000轉/分離心10分鐘。吸取上清于另一離心管中，向其中加入與上清等體積的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，重復此抽提步驟2-3次。最后小心吸取上清于另一離心管中，向管中加入上清液的2倍體積的預冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鐘左右，10000轉/分離心10分鐘，倒掉上清，向管中沉淀加入50微升10毫摩爾/升Tris.Hcl，1毫摩爾/升乙二胺四乙酸配置的緩沖液，得到了含有少量RNA的DNA溶液。向此溶液中加入無DNA的RNase A，使其終濃度達10-20微克/毫升左右，37℃溫育30分鐘，去除RNA得到質粒DNA。
3.轉化取1.5毫升的離心管，加入定量的pV2質粒40微克，10個單位/微升的介導酶HindIII 10微升，200微升的山梨醇緩沖液，配制成酶-質?；旌弦海帽蟼溆?。取100微升調好濃度的原生質體懸浮液于50毫升離心管中，再加入上步已配好的酶-質?；旌弦海靹蚝?，置冰上20分鐘。逐滴向管中緩慢加入2毫升聚乙二醇，置冰上25分鐘后，然后將離心管取出在28℃下放置10分鐘，再向離心管中加入5毫升冰預冷的山梨醇緩沖液，然后于4℃下2000轉/分鐘離心15分鐘，棄上清。加入3毫升液體再生培養(yǎng)基，28℃下放置6小時。將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，然后加入約15毫升預先熔化好的，并且冷卻至50℃左右的固體再生培養(yǎng)基，盡快搖晃使培養(yǎng)液與培養(yǎng)基混勻，使其冷卻干燥，熔化水瓊脂，并冷卻至50℃左右，加入潮霉素至濃度為300微克/毫升，快速倒入平板中，在培養(yǎng)基表面鋪滿一層為止，每個平板約需10毫升，在28℃下，培養(yǎng)4天，將能夠抗潮霉素的菌落轉移到預先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固體PDA培養(yǎng)基上進行二次篩選，第二次篩選得到的木霉菌即為所要得到的轉化體。
根據(jù)抗潮霉素基因序列，設計引物進行PCR檢測，以pV2為模板和潮霉素和氨芐青霉素的基因序列為探針，轉膜印跡檢測轉化子。經(jīng)PCR和Southern blot檢測為突變株的轉化子經(jīng)繼代培養(yǎng)，將確定為可以穩(wěn)定遺傳的轉化子的菌株制成硅膠粒在-20℃冰箱中保存，用于優(yōu)良生物防治菌株篩選。
生物防治活性鑒定不同木霉菌轉化子防治黃瓜枯萎病的效果明顯不同。TC6、TD5、TF1、TK1轉化子的防治效果優(yōu)于出發(fā)菌株T23，其中TD5和TK1的防治效果最好，防效分別比出發(fā)菌(親本菌株)提高15％和25％。
權利要求
1.一種木霉菌轉化子的限制性內(nèi)切酶介導基因整合化構建方法，其特征在于包括如下具體步驟(1)木霉菌菌株原生質體的制備首先將木霉菌在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢后，用無菌水洗下木霉菌孢子，然后將木霉菌孢子加入PDB液體培養(yǎng)基中，在25-30℃下，100-150轉/分搖床培養(yǎng)18-22小時，過濾收集菌絲，再用0.7摩爾/升NaCl溶液沖洗菌絲；將崩潰酶用0.7摩爾/升NaCl溶液配制濃度為13-20毫克/毫升的酶液，將上述得到的菌絲放入離心管，再將配制好的崩潰酶酶液以菌絲2倍體積的量加到離心管中，在25-30℃下以120-150轉/分振蕩培養(yǎng)3-4小時，然后過濾，并用0.7摩爾/升NaCl溶液沖洗菌絲，收集原生質體于離心管中，將離心管得到的原生質體溶液離心、去上清；然后重復向離心管中加入山梨糖醇緩沖液沖洗原生質體沉淀、離心、去上清2-3次；再根據(jù)得到的原生質體的量向離心管中加入山梨糖醇緩沖液，調節(jié)原生質體濃度至107-108個/毫升；其中，所述山梨糖醇緩沖液的組分為山梨醇316.256克、PH7.5的1摩爾/升Tris-Hcl 10毫升、CaCl21.11g，加水定容到1000ml；(2)質粒提取與DNA消化吸取含有質粒PV2的冷凍保存的菌種100微升，加到含有50微克/毫升的氨芐青霉素的100毫升的LB液體培養(yǎng)基上，37℃140-200轉/分搖床培養(yǎng)12-16小時，取已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的1.5毫升細菌培養(yǎng)液放于1.5毫升的離心管中，5000轉/分離心5分鐘，棄上清，向留有沉淀的離心管中加入100微升含有50毫摩爾/升葡萄糖，10毫摩爾/升乙二胺四乙酸，25毫摩爾/升Tris-HCl的溶液I進行懸浮沉淀，冰浴5-10分鐘，再加入200微升含200毫摩爾/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分鐘使質粒DNA變性后，再加入150微升含3摩爾/升醋酸鉀，pH4.8的溶液III，混勻，冰浴5-10分鐘；向離心管中加入450微升的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，10000轉/分離心10分鐘；吸取上清于另一離心管中，向其中加入與上清等體積的按體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進行抽提，重復此抽提步驟2-3次；最后吸取上清于另一離心管中，向管中加入上清液的2倍體積的預冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鐘，10000轉/分離心10分鐘，倒掉上清，向管中沉淀加入30-50微升10毫摩爾/升Tris.Hcl，1毫摩爾/升乙二胺四乙酸配置的緩沖液，得到含有RNA的DNA溶液；向此溶液中加入無DNA的RNase A，使其終濃度達10-20微克/毫升，37℃溫育30-60分鐘，去除RNA得到質粒DNA；其中，所述LB培養(yǎng)基的組分為10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去離子水中，調節(jié)pH值到7.0，每瓶100毫升分裝滅菌后備用；(3)轉化在50毫升離心管中加入質粒40微克、濃度為10個單位/微升限制性內(nèi)切酶HindIII10微升、山梨醇緩沖液200微升，配制成酶-質?；旌弦?，然后向離心管中加入100-200微升原生質體懸浮液，并使其與酶-質?；旌弦夯靹颍帽?5-20分鐘，緩慢向管中加入2毫升聚乙二醇，冰浴20-25分鐘，然后將離心管取出在28℃下放置10-20分鐘，加入5毫升預冷的山梨醇緩沖液，4℃下2000轉/分離心15分鐘，棄上清，加入3毫升液體再生培養(yǎng)基，25-30℃下放置6小時；然后將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，加入15毫升預先熔化并冷卻至50℃的固體再生培養(yǎng)基，混勻后冷卻干燥，熔化水瓊脂，并冷卻至50℃，加入潮霉素至濃度為300微克/毫升，快速倒入平板中，在28-30℃下，培養(yǎng)4-5天，將能夠抗潮霉素的菌落轉移到預先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固體PDA培養(yǎng)基上進行二次篩選，能夠繼續(xù)生長的菌落為得到的木霉菌轉化體；其中，所述液體再生培養(yǎng)基的組分為(NH4)2SO42.8克、尿素600毫克、磷酸鉀4克、葡萄糖40克、蔗糖100克、CaCL2600毫克、MgSO4.10H2O 200毫克、FeSO4.7H2O 10毫克、ZnSO4.7H2O 1.8毫克、MnSO4.H2O 3.2毫克、CoCL2.6H2O 4毫克；所述固體再生培養(yǎng)基的組分是在液體再生培養(yǎng)基組分的基礎上，再加入瓊脂17-20克。
2.根據(jù)權利要求1的木霉菌轉化子的限制性內(nèi)切酶介導基因整合化構建方法，其特征在于根據(jù)抗潮霉素基因序列，設計引物進行PCR檢測，以pV2為模板和潮霉素和氨芐青霉素的基因序列為探針，轉膜印跡檢測轉化子；經(jīng)PCR和Southern blot檢測為突變株的轉化子經(jīng)繼代培養(yǎng)，將確定為可以穩(wěn)定遺傳的轉化子的菌株制成硅膠粒在-20℃冰箱中保存，用于優(yōu)良生物防治菌株篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種木霉菌轉化子的限制性內(nèi)切酶介導基因整合化構建方法，首先通過產(chǎn)孢、菌絲培養(yǎng)以及采用崩潰酶酶液和山梨糖醇緩沖液處理，得到木霉菌菌株原生質體，然后將提取質粒DNA與制備的木霉菌原生質體混合，在限制性內(nèi)切酶的作用下，使外源線性質粒片段插入染色體組誘導插入突變，最后對突變的轉化子進行篩選，得到比親本生防效果更好的優(yōu)良生物防治木霉菌突變株。本發(fā)明利用限制性內(nèi)切酶介導的基因整合化技術可以得到大量的木霉菌轉化子，并可從中篩選到對番茄灰霉病和黃瓜枯萎病等防治效果顯著高于野生菌株的轉化子，為擴大菌種資源，克隆生物防治基因資源，獲得多功能生物防治菌株奠定基礎。
文檔編號C12R1/885GK1916177SQ20061003090
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月7日 優(yōu)先權日2006年9月7日
發(fā)明者陳捷, 劉限, 黃玉茜, 管麗萍 申請人:上海交通大學