專利名稱：一個(gè)與彌漫大b型淋巴瘤易感性密切相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)與彌漫大B型淋巴瘤密切相關(guān)的易感基因位點(diǎn)以及基于該多態(tài)位點(diǎn)突變特性的篩選彌漫大B型淋巴瘤高危人群的方法。屬于生物技術(shù)的基因領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是原發(fā)于淋巴結(jié)或淋巴結(jié)外組織或器官的一種惡性腫瘤，是常見的十大腫瘤之一，世界總的排序位于第9位。根據(jù)臨床和病理特點(diǎn)不同，ML分為兩個(gè)大類，即霍奇金病(Hodgkin disease，HD)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)。與西方國(guó)家不同，在我國(guó)NHL占ML的95.6％，而其中大部分(68.07％)又為彌漫大B型淋巴瘤(《惡性淋巴瘤病理診斷學(xué)》，朱梅剛，廣東科技出版社)。因此確定彌漫大B型淋巴瘤的病因，建立有效的防治方法是迫切需要解決的問(wèn)題。
化療是腫瘤治療的有效方法之一，而多藥耐藥(multidrug resistence，MDR)一直是化療成功的最主要障礙。BCRP是目前研究最多的多藥耐藥蛋白之一，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG基因亞科，位于染色體4q22，全長(zhǎng)超過(guò)66kb，包含16個(gè)外顯子。它在細(xì)胞膜上表達(dá)，以分子泵的形式將底物泵出細(xì)胞外。BCRP不僅在腫瘤耐藥株中有表達(dá)，在胎盤，肝臟，腦，腎等正常組織中也有表達(dá)。其底物除了一些化療藥物以外還包括一些毒素，因此認(rèn)為在正常組織中表達(dá)的BCRP具有防止毒素侵害的作用。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代遺傳標(biāo)記已得到飛速發(fā)展，是疾病易感性、外顯性、抵抗性、以及藥物反應(yīng)性等生物學(xué)性狀差別的重要基礎(chǔ)，很多疾病與基因突變或基因多態(tài)有關(guān)。
目前已對(duì)90個(gè)不同種族的人群的BCRP基因進(jìn)行系統(tǒng)的SNP篩選，在啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)40多個(gè)同義和非同義SNP(Zamber et al.，2003)。兩個(gè)非同義SNPG34A和C421A最近已被證實(shí)能改變轉(zhuǎn)運(yùn)功能，改變對(duì)部分抗癌藥物的敏感性以及破壞蛋白質(zhì)的表達(dá)(Mizuarai，Aozasa，& Kotani，2004)。最近研究表明底物的個(gè)體差異與BCRP的基因型有關(guān)(Sparreboom et al.，2004)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利檢索，至今未見有BCRP基因多態(tài)性位點(diǎn)與淋巴瘤相關(guān)性報(bào)道，也未見BCRP基因與疾病易感性的相關(guān)性研究。
本發(fā)明建立的二等位基因特異的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)，與傳統(tǒng)的等位基因特異的PCR(ARMS)相比，具有更簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的ARMS需要兩次PCR反應(yīng)才能檢測(cè)出兩個(gè)等位基因型，而Bialelic-ARMS在同一反應(yīng)管中便可檢測(cè)出兩個(gè)等位基因型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是揭示與彌漫大B淋巴瘤易感性密切相關(guān)BCRP基因多態(tài)位點(diǎn)；目的之二是通過(guò)該易感基因位點(diǎn)遺傳特性提出一種判定彌漫大B型淋巴瘤易感人群的方法，有利于指導(dǎo)彌漫大B型淋巴瘤的預(yù)防和治療。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明首先通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得BCRP基因的全序列和外顯子信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出第二(BCRPE2)、五(BCRPE5)外顯子.具體序列信息如下BCRPE2aa tctcatttat ctggactatc aacttactat39241 tgcttttctg tctgcagaaa gataaaaact ctccagatgt cttccagtaa tgtcgaagtt39301 tgtcacaagg aaacaccaat ggcttccccg cgacagcttc caatgacctg39361 aaggcattta ctgaaggagc tgtgttaagt tttcataaca tctgctatcg agtaaaactg39421 aagagtggct ttctaccttg tcgaaaacca gttgagaaag aaatattatc gaBCRPE5tcattat gtctcattaa aatgctattt gccttaagga48061 tgatgttgtg atgggcactc tgacggtgag agaaaactta cagctcttcg48121 gcttgcaaca actatgacga atcatgaaaa aaacgaacgg attaacaggg tcattcaaga48181 gttaggtctg gataaagtgg cagactccaa ggtaatgtgg aaaaactgaa agcatcatga48241 tcagcataag taggactttc cctgtgtgg用單鏈構(gòu)像多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)并結(jié)合測(cè)序的方法各檢測(cè)出一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別為G34A(位于第二外顯子，纈氨酸/蛋氨酸，rs2231137，BCRPE2所示序列第102位)，C421A(位于第五外顯子，谷胺酰氨/賴氨酸，rs2231142，rs12721641，rs28365035，BCRPE5所示序列第78位)。-上面兩段序列中用方框標(biāo)出的即為多態(tài)所在位點(diǎn)。
針對(duì)以上兩個(gè)位點(diǎn)，我們檢測(cè)了354個(gè)正常人和152個(gè)彌漫大B型淋巴瘤患者的血液標(biāo)本的基因型，用SPSS軟件分析發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，C421A位淋巴瘤患者多為AA或CA基因型，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.03，表1)。進(jìn)一步的年齡、性別分組分析表明在≤40歲的男性組中其差別也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.006，表2)，而在其他年齡性別分組中差別沒(méi)有意義。這些結(jié)果表明BCRP基因C421A位點(diǎn)上攜帶A等位基因的個(gè)體為彌漫大B型淋巴瘤易感人群，特別是攜帶A等位基因的40歲以下的男性對(duì)彌漫大B型淋巴瘤更易感。A等位基因是產(chǎn)生彌漫大B型淋巴瘤的一個(gè)危險(xiǎn)等位位點(diǎn)。等位基因比較也進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)結(jié)論(P＝0.045，0.024表3，4)。
表1淋巴瘤患者與正常對(duì)照組BCRP基因421位基因型分布比較

表2≤40歲男性組中淋巴瘤患者與正常對(duì)照BCRP基因421位基因型分布比較

表3淋巴瘤患者與正常對(duì)照BCRP基因421位等位基因分布比較

表4≤40歲男性組中淋巴瘤患者與正常對(duì)照BCRP基因421位等位基因分布比較

另外，本發(fā)明還根據(jù)C421A位點(diǎn)提供了一種判定彌漫大B型淋巴瘤易感人群的方法-二等位基因特異的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)。其特征包括如下步驟
1)用常規(guī)酚氯仿方法從人的血液中提取DNA，濃度校正至25ng/ul，作為DNA模板；2)設(shè)計(jì)寡核苷酸引物序列，包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的兩條特異性反向引物以及一對(duì)外周擴(kuò)增引物，反應(yīng)原理如圖1所示，在附圖后面具體引物序列如表5所示。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，所得的PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶大小不同可以判斷該SNP位點(diǎn)的基因型(見圖2)。
表5BCRP基因421位Bialelic-ARMS引物序列及PCR條件

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的彌漫大B型淋巴瘤易感位點(diǎn)可以引起其編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的變化，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能的缺損或改變，這對(duì)闡明彌漫大B型淋巴瘤遺傳學(xué)機(jī)制，建立基因診斷方法，指導(dǎo)彌漫大B型淋巴瘤預(yù)防、開發(fā)新型治療藥物具有重要意義。本發(fā)明建立的Bialelic-ARMS方法，可以快速有效的篩選淋巴瘤高危人群，并指導(dǎo)臨床上對(duì)抗癌藥物種類及劑量的選擇；該方法具有簡(jiǎn)單、高效、敏感及特意的特點(diǎn)，適用于自動(dòng)化批量檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)基于遺傳學(xué)背景的個(gè)體化藥物治療奠定了十分重要的基礎(chǔ)，并將帶來(lái)十分可觀的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。


圖1.二等位基因特異的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)原理；圖2.二等位基因特異的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。值得注意的是，以下實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
1.技術(shù)路線第一步 樣品選取和DNA的抽提淋巴瘤患者血液標(biāo)本由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供，收集2003年8月至2005年4月入院的彌漫大B型淋巴瘤患者152例；正常對(duì)照樣品由廣州市中心血站和中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院提供，共收集354例。年齡和性別分布在患者和正常對(duì)照兩組標(biāo)本中沒(méi)有顯著的差異(表6)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。
表6病例-對(duì)照群體性別、年齡分布

用常規(guī)酚氯仿方法從人的血液中提取DNA，濃度校正至25ng/ul，作為DNA模板。
第二步 設(shè)計(jì)寡核苷酸引物序列，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增引物如下(均為5’-3’方向)第二號(hào)外顯子正向引物AATCTCATTTATCTGGACTATCAAC反向引物TCGATAATATTTCTTTCTCAACTG 退火溫度54℃第五號(hào)外顯子正向引物TCATTATGTCTCATTAAAATGCTAT反向引物GGACACAGGGAAAGTCCTAC 退火溫度53℃PCR反應(yīng)體系20ul，在PTC-100或PTC-200型PCR儀進(jìn)行，具體反應(yīng)成分如下(表7)表7BCRP基因第二、五、九外顯子PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件(1)94℃ for 4min，1 cycle(2)94℃ for 1min，annealing temp.for 30sec，70℃ for 45see，35 cycles，(3)70℃ for 6min，1 cycle擴(kuò)增后得到BCRP基因外顯子區(qū)域的DNA序列。
第三步 SSCP跑膠并測(cè)序?qū)⒌诙剿玫腜CR產(chǎn)物取2ul，加入甲酰胺加樣緩沖液10ul，95℃變性8min。在arc∶bis為37.5∶1的PAGE膠上5W跑8h，每個(gè)樣品加樣4ul，跑出不同帶型樣品各取其一，純化測(cè)序，找出SNP位點(diǎn)。
2.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析BCRP基因多態(tài)性位點(diǎn)在病人和正常人的頻率分布信息見表8表8BCRP基因的SNP及基因型頻率分布

建立SPSS SNP基因分型數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，并進(jìn)行年齡性別分層分析，發(fā)現(xiàn)含有等位基因A的基因型(CA和AA)的個(gè)體比帶CC純合型個(gè)體更易感染彌漫大B型淋巴瘤(表1)，特別40歲以下的男性個(gè)體這種易感性表現(xiàn)更顯著(表2)，提示A等位基因是彌漫大B型淋巴瘤的危險(xiǎn)等位基因。對(duì)等位基因頻率進(jìn)行卡方分析，也得出同樣的結(jié)論，即A等位基因是彌漫大B型淋巴瘤的易感等位基因(表3，4)3.基于Bialelic-ARMS方法的檢測(cè)試劑盒制備檢測(cè)彌漫大B型淋巴瘤患者易感性的試劑盒，其中包括表4所示的兩對(duì)引物，PCR反應(yīng)所需試劑(10*buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶)，PCR反應(yīng)之后只要跑一個(gè)瓊脂糖凝膠就可以輕易檢測(cè)出C421A位基因型。
本發(fā)明具有實(shí)用性的例證1)所建立的方法可以簡(jiǎn)便快速地檢測(cè)位于4q22區(qū)域BCRP基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C421A的基因型，通過(guò)A等位基因的有無(wú)來(lái)輔助診斷彌漫大B型淋巴瘤患者并對(duì)個(gè)體是否具有彌漫大B型淋巴瘤的易感性進(jìn)行評(píng)判，從而有利于疾病的預(yù)防、早期診斷和治療。
2)可以利用本發(fā)明所介紹的方法以及上述1)所述，把C421A的A等位位點(diǎn)作為藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)來(lái)進(jìn)行藥物篩選，促進(jìn)新的抗彌漫大B型淋巴瘤藥物的出現(xiàn)。
3)采用本發(fā)明提供的彌漫大B型淋巴瘤相關(guān)基因及多態(tài)位點(diǎn)的核酸序列，構(gòu)建對(duì)彌漫大B進(jìn)行遺傳學(xué)診斷的試劑盒。
4)采用本發(fā)明提供的引物序列可以特異、高效地檢測(cè)出G34A和C421A位點(diǎn)的基因型。
5)本發(fā)明公布的G34A位點(diǎn)在漢族人群中未顯示與彌漫大B型淋巴瘤相關(guān)，但它可能引起其他疾病的發(fā)生，是潛在的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。
此外，C421A是一個(gè)錯(cuò)義突變的單核苷酸位點(diǎn)，它的變化會(huì)造成氨基酸序列由谷胺酰氨(中性氨基酸)到賴氨酸(堿性氨基酸)的改變，使得乳腺癌抗性蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)BCRP基因第五外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于其包括步驟(a)確定在人BCRP基因第五外顯子的BCRPE5所示序列的第78位的核苷酸；(b)檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的單核苷酸多態(tài)性是在第78位存在A。
3.一種分離的核酸，其特征在于它具有BCRPE5所示序列，且第78位是A。
4.BCRPE5所示序列的等位基因特異性的核酸引物，其特征在于該核酸引物包括BCRPF、BCRPR、BCRPAF、BCRPCR所示核苷酸序列。
5.一種彌漫大B淋巴瘤的診斷試劑盒，其特征在于其包括(a)權(quán)利要求4所述的核酸引物；(b)PCR反應(yīng)所需要的試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)與彌漫大B型淋巴瘤易感性密切相關(guān)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)C421A(位于第五外顯子，谷胺酰氨/賴氨酸，rs rs2231142，rs12721641，rs28365035)。此位點(diǎn)上攜帶A等位基因的個(gè)體為彌漫大B型淋巴瘤易感人群，特別是攜帶A等位基因的40歲以下的男性對(duì)彌漫大B型淋巴瘤更易感。此多態(tài)位點(diǎn)及其編碼的蛋白對(duì)闡明彌漫大B型淋巴瘤遺傳學(xué)機(jī)制，建立基因診斷方法，指導(dǎo)彌漫大B型淋巴瘤預(yù)防、開發(fā)新型治療藥物具有重要意義。本發(fā)明還基于臨床有意義的SNPs位點(diǎn)，建立二等位基因特異的多重PCR方法(Bialelic－ARMS)，以便快速有效的篩選淋巴瘤高危人群，并指導(dǎo)臨床上對(duì)抗癌藥物種類及劑量的選擇。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1896277SQ20061003260
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2006年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月9日
發(fā)明者莊詩(shī)美, 胡麗莉, 程家森, 楊金娥, 張宴 申請(qǐng)人:中山大學(xué)