專利名稱：特異檢測牛皰疹病毒ⅰ型的lux熒光引物和核酸擴增方法
技術領域：
本發(fā)明提供牛皰疹病毒I型(BHV-1)病毒特異的熒光核酸擴增引物并建立一種快速、準確檢測BHV-1病毒的新型實時熒光核酸擴增方法，適用于進出口動物檢疫、動物傳染病疫情防控、診斷和流行病學調查領域對BHV-1病毒感染引起的傳染病的快速檢測、監(jiān)控和防治。
背景技術：
牛皰疹病毒I型(BHV-1)可感染牛引起牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovinerhinotracheitis，IBR)和牛傳染性膿皰性外陰陰道炎(Infectious pustularvulvovaginitis，IPV)，是一種急性、接觸性病毒性傳染病，在臨床上表現(xiàn)為鼻氣管炎、、角膜結膜炎等癥狀，引起牛生長發(fā)育不良、產乳量和生殖力下降、流產、死亡率和淘汰率增高，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經濟損失。IBR/IPV被國際動物組織(OIE)列為B類疫病，被我國列為二類動物檢疫疫病。在活牛和牛遺傳物質(精液、胚胎)的國際貿易和我國的進出口檢疫中，均要求對IBR/IPV進行嚴格檢疫，我國進口活牛的主要輸出國澳大利亞和新西蘭均是IBR/IPV高發(fā)區(qū)。該病在國內的傳播感染范圍也較廣，對我國養(yǎng)牛業(yè)生產、活牛和牛產品貿易造成較嚴重威脅。
在本發(fā)明方法之前，國內外在進出口動物檢疫和疾病監(jiān)控中采用的檢測BHV-1感染的方法。長期以來，由于缺乏快速、有效的檢測方法，OIE在國際動物和動物產品貿易中推薦采用血清中和試驗和病毒分離進行IBR診斷。這兩種方法前者檢測的是抗體，后者檢測病毒，均需要進行細胞培養(yǎng)，操作繁瑣，耗時長，需要1-2周時間，且敏感性不理想，其中，牛精液和胚胎的檢驗只能采用病毒分離方法。除這兩種方法外，國內外還采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法(ELISA)檢測抗體，由于致病因子感染動物后產生抗體需要1-2周時間，抗體檢測方法不利于IBR病毒(BHV-1)急性感染或早期感染情況的診斷，并且ELISA方法特異性不理想。國內外還報道了檢測IBR病毒的常規(guī)核酸擴增(Polymerase chain reaction，PCR)方法，這種方法檢測的是病毒核酸，比上述方法的特異性和敏感性均有顯著提高，但常規(guī)PCR方法需要通過凝膠電泳判定結果，費時費力，且易造成PCR產物污染環(huán)境引起假陽性反應，不利于方法推廣應用，目前這種方法主要應用于實驗室研究或少量樣品的檢測。
本發(fā)明采用LUX(Light Upon Extension)新型實時熒光核酸擴增技術原理，設計篩選了BHV-1特異的LUX熒光PCR引物，建立了快速準確檢測BHV-1的LUX熒光PCR方法，該方法可通過電腦實時監(jiān)控檢測結果，不需要對反應產物進行凝膠電泳等操作，操作簡便快速，適合推廣應用。LUX技術的原理是通過構建一個單標記的具有自身淬滅熒光性能的引物-LUX熒光引物，即在PCR的一個引物上引入發(fā)夾結構，并標記上熒光基團，在PCR反應過程中，引物與靶序列配對后，其熒光就會恢復產生可檢測的光信號，從而達到實時監(jiān)測反應過程的目的。
LUX熒光PCR技術的關鍵是特異引物的設計，對于不同的檢測目標基因，需要設計不同的特異LUX引物和根據引物的核苷酸組成性質設置不同的反應條件。
目前常用的實時熒光核酸擴增技術主要有采用雙標記的寡核苷酸探針和采用雙鏈DNA結合染料兩種，前者成本高，后者易產生假陽性反應。LUX熒光PCR技術的特異性和敏感性與雙標記探針技術相當，但由于采用的是單標記的自身淬滅熒光引物，可顯著降低檢測成本，有利于方法的推廣應用和商業(yè)化試劑盒開發(fā)。
實時熒光核酸擴增技術已廣泛應用于人和動植物病原體的快速檢測研究和臨床診斷，禽流感、口蹄疫等傳染病的實時熒光PCR試劑盒已實現(xiàn)商業(yè)化，但均為采用雙標記寡核苷酸探針技術或核酸染料技術，未見采用LUX熒光PCR技術。另一方面，由于國內養(yǎng)牛業(yè)和乳業(yè)生產近年來呈持續(xù)快速增長的勢頭，近幾年均從國外大量引進優(yōu)質種牛，對IBR等相關傳染病的快速檢測技術需求迫切。因此，本發(fā)明所建立的方法有開發(fā)商業(yè)化檢測試劑盒的價值。迄今，除本發(fā)明外，國內外均未有報道BHV-1特異的LUX熒光PCR檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了BHV-1特異的LUX熒光引物并建立了一種能快速、準確檢測BHV-1病毒的分子生物學方法-LUX實時熒光PCR方法。內容包括1、通過專用軟件設計BHV-1特異的LUX自身淬滅熒光引物和對應的配對引物。
引物的靶序列來源于BHV-1 gpC基因序列。通過專業(yè)軟件針對gpC基因的保守區(qū)設計引物，選取軟件生成的多對引物序列，應用blast軟件進行分析，從中篩選出特異性和檢測范圍滿足要求的一對LUX自身淬滅熒光引物和配對引物序列，其中反向引物為LUX熒光引物，含有發(fā)夾結構并標記FAM熒光基團。應用blast軟件進行核酸序列同源性分析表明，所選取的兩條引物序列均與公開數(shù)據庫中所有BHV-1 gpC基因的對應序列完全相符合，未發(fā)現(xiàn)與其它動物病毒的核酸序列有相關性，分析結果證實所設計的引物為BHV-1特異。引物的核酸序列見序列表。
2、對LUX實時熒光PCR退火溫度和時間、引物濃度、鎂離子濃度進行優(yōu)化，建立了適合LightCycler(Roche)熒光核酸擴增儀的優(yōu)化反應條件，包括反應液體系和循環(huán)反應條件。
為取得最佳的檢測效果，本發(fā)明進行一系列試驗，對不同的實時熒光PCR退火溫度和時間、引物濃度、鎂離子濃度進行檢測效果測試，最終將在LightCycler(Roche)熒光核酸擴增儀上的反應條件優(yōu)化為65℃退火20秒、采用0.5μM引物濃度和4mM鎂離子濃度。
反應液體系，采用20μl反應體積，組成如下Quantitative PCR SuperMix-UDG10μl50mM MgCl20.4μl
熒光標記引物(10μM)1μl配對引物(10μM)1μl牛血清白蛋白(5mg/mL) 1μlTaq DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μl滅菌雙蒸水 4.1μl模板核酸 2μl擴增循環(huán)條件，在熒光PCR儀上設定熒光F1程序選擇擴增分析模式定量UDG處理50℃ 2min；變性95℃ 2min；循環(huán)(40次)94℃ 5s，65℃ 20s(采集信號)。
3、建立了熔解曲線結果判定方法，比常規(guī)采用Ct值及擴增曲線的判定標準更為準確和敏感。以在熔解曲線上90-93℃出現(xiàn)明顯吸收峰定為陽性反應。
對于實時熒光PCR反應的結果判定，可采用在定量分析模式下出現(xiàn)S型擴增曲線和有效Ct值作為陽性結果的判定依據；也可采用熔解曲線判定方法，即以在熔解曲線的特定溫度區(qū)域是否出現(xiàn)吸收峰作為陽性結果的判定依據。本發(fā)明比較了兩種判定模式，發(fā)現(xiàn)采用熔解曲線判定模式可提高檢測的敏感性和特異性。
熔解曲線分析條件，在熒光PCR儀上設定程序選擇熔解曲線分析模式熔解曲線溫度條件(在擴增反應結束后進行)95℃ 0s，72℃ 20s，95℃ 0s(0.1℃/s)。
4、將LUX實時熒光PCR方法與常規(guī)凝膠PCR方法進行比較試驗，表明可顯著提高檢測敏感性。
將濃度為11800μg/ml的BHV-1病毒核酸樣品進行10倍倍比系列稀釋，分別用LUX實時熒光PCR方法和常規(guī)凝膠PCR方法進行檢測試驗，結果前者的檢測敏感性為108稀釋度，后者僅能檢測到104稀釋度，表明LUX實時熒光PCR方法的檢測敏感性比常規(guī)凝膠電泳PCR方法可提高達104。
5、本發(fā)明方法的具體步驟
(1)設計合成引物。
(2)、采集樣品，提取核酸。本發(fā)明可檢測體外細胞培養(yǎng)病毒樣品、動物活體采集的樣品如血液、唾液、呼吸道分泌物、精液、陰道拭子等，以及通過剖檢采集的組織樣品，如呼吸道粘膜、神經組織等。采用QIAGEN DNA KIT技術從上述樣品中提取核酸。
(3)、加樣。按上述反應液體系，在反應管中分別加入反應液和核酸，記錄樣品編號和對應管號。
(4)、上機檢測。在熒光PCR儀上，按上述擴增循環(huán)條件和熔解曲線分析條件設定反應參數(shù)，放入反應管，開機檢測。
(5)、分析、判定結果。在定量分析模式和熔解曲線模式下分別分析反應結果，根據熔解曲線最終判定結果。
全過程可在2小時內結束。
6、本發(fā)明特點。
單標記的熒光引物特異性強，成本低，操作簡便，檢測結果監(jiān)控和分析自動化，適合大批量樣品的檢測。檢測敏感性和特異性比現(xiàn)有方法顯著提高，檢測結果可靠，適合推廣應用。
7、檢測試驗。
(1)、對BHV-1疫苗株和分離株的檢測結果。
將BHV-1疫苗株Barta/Nu和分離株4027分別接種MDBK細胞，產生細胞病變后，分別取樣提取核酸進行LUX實時熒光PCR檢測，取正常MDBK細胞提取核酸作為陰性對照，并以滅菌雙蒸水作為模板設空白對照，同時進行檢測。結果如附

圖1，Barta/Nu疫苗株和4027分離株樣品的熔解曲線均在90-93℃出現(xiàn)吸收峰，MDBK細胞陰性對照和空白對照均未形成吸收峰。
(2)、對BHV-1病毒精液樣品的檢測試驗。
取BHV-1疫苗株Barta/Nu的細胞病毒液5μl、10μl、20μl、50μl分別與195μl、190μl、180μl、150μl陰性精液樣品混合制備一組體積為200μl的病毒精液樣品，分別提取核酸后進行LUX實時熒光PCR檢測，取陰性精液樣品200μl提取核酸同時進行檢測，結果如附圖2。四個混合了病毒液的精液樣品對應的熔解曲線均出現(xiàn)特征吸收峰，陰性精液樣品未出現(xiàn)吸收峰。
(3)、特異性試驗。
將BHV-1病毒核酸和其它四種常見的牛病毒(牛病毒性腹瀉-粘膜病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、牛白血病病毒)核酸樣品同時進行LUX實時熒光PCR檢測，結果見附圖3。僅BHV-1病毒核酸樣品對應的熔解曲線出現(xiàn)特征吸收峰。
(4)、敏感性試驗。
取接種MDBK細胞增殖產生的BHV-1病毒液(毒價為10-7.5TCID50/ml)200μl提取核酸，然后用滅菌雙蒸水進行10倍系列倍比稀釋，取10-1到10-7樣品同時進行LUX實時熒光PCR檢測。結果如附圖4，10-1到10-6樣品對應的熔解曲線均出現(xiàn)特征吸收峰，檢測敏感性可達10-6稀釋度，10-7稀釋度和滅菌雙蒸水對照樣品沒有出現(xiàn)特征吸收峰。
附圖1、對BHV-1病毒疫苗株和分離株的檢測試驗。
1BHV-1疫苗株Barta/Nu； 2BHV-1分離株4027；3MDBK細胞陰性對照；4滅菌雙蒸水空白對照。
附圖2、對BHV-1病毒精液樣品的檢測試驗。
1-4分別為含50、20、10和5μl病毒液的精液樣品5陰性精液樣品對照。
附圖3、BHV-1 LUX實時熒光PCR檢測特異性試驗。
1BHV-1病毒核酸；2-5其他四種牛病毒核酸。
附圖4、BHV-1 LUX實時熒光PCR檢測敏感性試驗。
1-6分別為10-1-10-6稀釋度的病毒核酸樣品；7-8分別為10-7稀釋度病毒核酸樣品和滅菌雙蒸水對照樣品。
具體實施例方式
。
1、引物設計在Genebank中下載BHV-1目標基因gpC序列，采用在線LUX熒光引物設計軟件(http://www.invitrogen.com/lux)設計BHV-1病毒特異的LUX熒光引物和配對引物，采用Blast軟件分析引物序列的特異性。采用權力要求書中的引物。引物序列見序列表。
2、檢測樣品采集牛鼻腔或生殖道拭子、呼吸道、眼分泌物、血液、牛精液、唾液、體外細胞培養(yǎng)物等樣品。拭子樣品應懸浮在PBS緩沖液中。
3、核酸提取采用QIAGEN DNA KIT提取核酸。步驟簡要如下(1)、在1.5ML離心管中加入20μl QIAGEN蛋白酶或蛋白酶K，加入200μl樣品，若樣品體積不足200μl，則加PBS補足體積。
(2)、加200μl AL緩沖液，用渦旋振蕩器混勻15s。
(3)、在56℃溫浴10min。
(4)、加入200μl無水乙醇，用渦旋振蕩器混勻15s。
(5)、把所有液體移入QIAamp離心柱，套入收集管，蓋上蓋子，放入臺式微量離心機，6000×g離心1min。
(6)、把離心柱放入新的收集管，加入500μl AW1洗滌液，蓋上蓋子，6000×g離心1min。
(7)、把離心柱放入新的收集管，加入500μl AW2洗滌液，蓋上蓋子，用最高轉速(16,000-20,000×g)離心3min。
(8)、把離心柱放入新的1.5ML滅菌離心管，加入100μlAE洗脫液，室溫(15-25℃)靜置1分鐘，6000×g離心1min。
(9)、所提取的核酸樣品可直接進行LUX實時熒光PCR檢測，也可置-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 4、LUX實時熒光PCR檢測反應(1)、儀器LightCycler(Roche)(2)、加樣試劑除引物外，可從invitrogen公司購買。采用20μl反應體積，1個樣品的反應液體系如下Quantitative PCR SuperMix-UDG10μl50mM MgCl20.4μl熒光標記引物(10μM) 1μl配對引物(10μM) 1μl牛血清白蛋白(5mg/mL) 1μlTaq DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μl滅菌雙蒸水 4.1μl總體積 18μl進行多個樣品檢測時，將上述各試劑的量乘以樣品數(shù)。每次檢測均設至少1管陽性對照和1管陰性對照。
在滅菌反應管中依序按比例加入上述試劑，用微量移液器混勻，注意避免產生氣泡，按18μl/管分裝加入LightCycler(Roche)毛細管。
在毛細管中每管加入2μl核酸樣品，記錄樣品和反應管編號，蓋好，700×g離心10秒，把毛細管小心放到LightCycler(Roche)儀器中。
(4)、上機檢測在LightCycler(Roche)儀器的反應界面，按以下參數(shù)設定擴增反應和結果分析條件擴增循環(huán)條件熒光設F1；程序選擇擴增；分析模式定量。
UDG處理50℃ 2min；變性95℃ 2min；循環(huán)(40次)94℃ 5s，65℃ 20s(采集信號)。
熔解曲線制備條件程序選擇熔解曲線；分析模式熔解曲線溫度條件(在擴增反應結束后進行)95℃ 0s，72℃ 20s，95℃ 0s(0.1℃/s)。
條件設定好后，對樣品進行編輯，按儀器指示儲存檢測程序和試驗數(shù)據文件，開機開始檢測反應。
(5)、在反應過程中，可通過電腦實時觀察各樣品熒光信號的變化情況。
5、結果判定反應結束后，可在定量分析模式下，察看各樣品的擴增曲線和Ct值，陽性對照應出現(xiàn)典型s型擴增曲線，Ct值應小于35，陰性對照的擴增曲線應平坦，應無Ct值。
檢測結果的最終判定在熔解曲線模式下進行，陽性對照應在90-93℃出現(xiàn)明顯吸收峰，陰性對照應在相應區(qū)域不出現(xiàn)吸收峰。在對照成立的條件下，樣品在90-93℃出現(xiàn)吸收峰的判為陽性，與陰性對照一致不出現(xiàn)上述特征吸收峰的判為陰性。
BHV-1序列表<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心<120>特異檢測牛皰疹病毒I型的LUX熒光引物和核酸擴增方法<160>2<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>該序列含有可形成發(fā)夾結構的核苷酸<400>1cacgaggtaa cgggcgggtc gtg 23<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2cgacgctacg ccagagga 18
權利要求
1.牛皰疹病毒I型(BHV-1)病毒特異的LUX熒光核酸擴增引物和配對引物。兩條引物根據BHV-1病毒gpC基因序列，應用專業(yè)軟件設計和篩選得到，用于建立LUX實時熒光PCR方法快速、準確檢測BHV-1病毒。其中，反向引物為LUX熒光引物，除gpC基因序列外，還含有能形成發(fā)夾結構的核苷酸序列，并標記FAM熒光基團。兩條引物的序列如下正向引物5’CGACGCTACGCCAGAGGA 3’反向引物5’CACGAGGTAACGGGCGGGTCGTG 3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了牛皰疹病毒I型(BHV－1)特異的LUX(Light Upon Extension)熒光PCR引物序列和實時熒光PCR檢測方法。本發(fā)明以BHV－1病毒的gpC基因為目標基因，設計和篩選BHV－1特異的單標記自身淬滅LUX熒光引物和對應的配對引物。采用BLAST軟件對引物序列的分析結果表明，兩條引物序列與數(shù)據庫中的所有BHV－1病毒對應序列完全吻合，與其他動物病毒序列無明顯相關性。本發(fā)明對實時熒光擴增反應退火溫度和時間、鎂離子濃度、引物濃度進行優(yōu)化，采用優(yōu)化的反應條件和熔解曲線結果判定方法，進行了特異性和敏感性試驗，證實方法特異、敏感?？稍?小時內準確檢測到拭子、呼吸道、眼分泌物、血液、精液、體外細胞培養(yǎng)物等樣品中的BHV－1病毒，檢測敏感性比常規(guī)凝膠PCR方法可提高達10
文檔編號C12Q1/68GK1952174SQ20061003405
公開日2007年4月25日 申請日期2006年3月7日 優(yōu)先權日2006年3月7日
發(fā)明者陳茹 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心