專利名稱：粵藍鏈霉菌的制作方法
專利說明粵藍鏈霉菌 本發(fā)明涉及一種新的鏈霉菌，屬于微生物技術領域。近年來，無毒、無致畸病、穩(wěn)定性強的微生物產(chǎn)天然色素的開發(fā)研究越來越受到人們的重視。微生物來源的色素種類多，數(shù)量大，成本低廉，生產(chǎn)工藝簡單，具有植物色素和動物色素所不可比擬的優(yōu)勢。利用自然界中微生物發(fā)酵生產(chǎn)的色素種類較為豐富，但是國內(nèi)外生產(chǎn)的天然藍色色素種類卻較少，而用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的紫羅蘭藍色色素更是罕見。紫羅蘭藍色色素作為3個基本色素之一，具有很高的附加值，可與紅、黃品系的天然色素調(diào)配成多種色調(diào)，使天然色素更加豐富。因此，通過微生物發(fā)酵途徑來獲得天然紫羅蘭藍色色素一直是研究熱點。本發(fā)明的目的是提供一種能夠產(chǎn)生紫羅蘭藍色色素的新種鏈霉菌——粵藍鏈霉菌。
本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌系由越南的DφO Xong pha森林根際土中采集的土壤，經(jīng)分離培養(yǎng)獲得。該菌培養(yǎng)條件為(1)培養(yǎng)基采用高氏合成1號瓊脂培養(yǎng)基。具體配方為可溶性淀粉20.0g，硝酸鉀(KNO3)1.0g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.5g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化鈉(NaCl)0.5g，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0.01g，瓊脂20.0g，水1000ml；(2)pH7.2～7.4；(3)培養(yǎng)溫度28℃。該菌命名為粵藍鏈霉菌Streptomyces vietnamensis(viet.nam.en’sis.N.L.adj.)，編號為GIMV4.0001。該菌種已在國家知識產(chǎn)權局指定的保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心和國外菌種保藏單位日本IAM菌種保藏中心保藏，保藏日期分別為2005年12月9日和2006年2月16日，保藏登記號為CCTCCM No.205143和IAM15340。
本發(fā)明的粵藍鏈霉菌(Streptomyces vietnamensis)具有下述性質(zhì)1.形態(tài)特征在掃描電鏡下可見，孢子多，孢子鏈直，分支，孢子長柱形，表面有一層鞘。
2.在各種培養(yǎng)基上的特征在酵母精麥芽精瓊脂(ISP2)、燕麥粉瓊脂(ISP3)和高氏合成一號瓊脂培養(yǎng)基等不同的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征見表1。
表1粵藍鏈霉菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征
本發(fā)明的粵藍鏈霉菌在培養(yǎng)基上所產(chǎn)生的紫羅蘭藍色色素易溶于堿性溶液和甲醇，微溶于酸性溶液(酸性越強則溶解度越低)和乙醇等極性大的有機溶劑，不溶于丙酮、乙醚等極性小的有機溶劑；該色素在pH≤5的范圍內(nèi)，顏色比較穩(wěn)定；色素在紫外光下穩(wěn)定性較強，該色素熱穩(wěn)定性較好，能耐較高溫。
3.生理生化特征該菌株兼性厭氧，革蘭氏陽性，接觸酶陽性，產(chǎn)生黑色素和H2S，牛奶胨化，明膠液化快，能水解淀粉，能還原硝酸鹽。
4.碳源利用能利用蜜二糖、山梨糖、蔗糖、葡萄糖、D-果糖、木糖、D-半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖為碳源，但不能利用D-甘露醇。
5.其它性質(zhì)最適生長溫度28℃；細胞壁含有LL二氨庚二酸，屬細胞壁I型；細胞水解物中含有甘露糖、半乳糖和核糖。細胞壁脂肪酸含有十四酸、十六酸、油酸、十六碳一烯酸、亞油酸和十八酸。
本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌其形態(tài)特征與其他的鏈霉菌有顯著差異，與基因序列同源性達98％-99％的鏈霉菌相比，也完全不同。比基尼鏈霉菌(Streptomyces bikiniensis)與本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌16SrDNA序列同源性達99.4％，但形態(tài)特征完全不同，比基尼鏈霉菌孢子絲直、柔曲。孢子卵圓形、長圓形，表面光滑，在ISP培養(yǎng)基上無可溶性色素或跡量黃色；焦土(曉多)鏈霉菌(Streptomyces showdoensis)與本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌16SrDNA序列同源性達99％，但焦土(曉多)鏈霉菌(Streptomyces showdoensis)在ISP培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可溶性色素；Streptomyces viridobrunneus與本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌16SrDNA序列同源性達99％，但Streptomyces viridobrunneus產(chǎn)生綠色可溶性色素；其他的與本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌16SrDNA序列同源性達98％鏈霉菌種類也與粵藍鏈霉菌在某些方面有明顯的不同，Streptomyces tanashiensis，Streptomyces cinereoruber，Streptomyces filamentosus andStreptomyces venezuelae在ISP培養(yǎng)基上不產(chǎn)生色素(Shirling & Gottlieb，1968a，1968b，1969)；Streptomyces exfoliatus氣生菌絲粉紅色(Shirling & Gottlieb，1968a)；Streptomyces rubiginosohelvolus在ISP培養(yǎng)基上不產(chǎn)生或產(chǎn)生淺黃色可溶性色素(Shirling& Gottlieb，1968b)；Streptomyces crystallinus產(chǎn)生淺褐色或黑褐色可溶性色素(Williams，1989)。本發(fā)明的粵藍鏈霉菌與其同源性最高的鏈霉菌菌株微生物學特性的比較見表2，并與部分相關菌株依據(jù)16SrDNA序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，見附圖5。
表2粵藍鏈霉菌與其同源性最高的鏈霉菌菌株微生物學特性比較
注表中+表示陽性，-表示陰性，W表示反應弱，ND表示沒有測定。附

圖1本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌菌株的16SrDNA序列。
附圖2本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌產(chǎn)生色素的照片。
附圖3本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌孢子鏈的掃描電子顯微鏡照片，左圖2μm，放大10000倍；右圖10μm，放大2000倍。
附圖4本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌孢子的掃描電子顯微鏡照片(放大10000倍)。
附圖5本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌及部分相關菌株依據(jù)16SrDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。實施例1粵藍鏈霉菌的分離培養(yǎng)方法從越南Dφo Xongpha原始森林中采集植物根際0-30cm土樣，取10g土壤放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(帶玻珠)，在180rpm轉(zhuǎn)速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘后取上層液稀釋10倍后取0.1mL均勻涂布在高氏合成1號瓊脂培養(yǎng)基板上，翻轉(zhuǎn)平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，即可獲得本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌CCTCCM No.205143。
高氏合成1號瓊脂培養(yǎng)基可溶性淀粉20.0g，硝酸鉀(KNO3)1.0g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.5g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化鈉(NaCl)0.5g，硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0.01g，瓊脂20.0g，水1000ml，pH7.2～7.4。
培養(yǎng)溫度為28℃。
用本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌以高氏合成1號瓊脂培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)7天后，將其發(fā)酵液pH調(diào)至9，經(jīng)8000rpm離心5min后取上清夜，再用pH9的緩沖液將其稀釋25倍，在588nm下測得紫羅蘭藍色色素OD為0.5158，即該粵藍鏈霉菌發(fā)酵液中色素的色價為12.5。
實施例2粵藍鏈霉菌菌株16SrDNA的提取方法本發(fā)明還提供了該粵藍鏈霉菌(Streptomyces vietnamensis)CCTCCM No.205143的16SrDNA的提取及測序方法，具體按照下述操作進行1.所用試劑(1)5M NaCl(2)TE1(10mM Tris，25mM EDTA)pH8.0(3)TE2(10mM Tris，1mM EDTA)pH8.0(4)10％SDS
(5)氯仿∶異戊醇(24∶1)(6)異丙醇(7)CTAB/NaCl(8)蛋白酶K母液20mg/ml2.DNA提取方法(1)將菌絲轉(zhuǎn)移至滅過菌的研缽中，充分研磨。
(2)加567ulTE懸浮，并加入30uL 10％SDS，3uL 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫育1小時。
(3)加100ul 5mol/L NaCl，混勻。
(4)加80ul CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃溫育20分鐘。
(5)用等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，10,000rpm離心10分鐘，將上清液移至干凈離心管。
(6)用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干凈管中。
(7)加0.6倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止1小時，沉淀DNA。
(8)14,000rpm離心20分鐘，收集DNA沉淀。
(9)DNA沉淀加500uL 70％乙醇漂洗，自然風干。
(10)加50ul TE溶解DNA，-20℃保存。
3.PCR擴增方法本發(fā)明所述的粵藍鏈霉菌的16SrDNA的PCR擴增所用的通用引物正向引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1522R(5’-AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA)，引物序列的設計參照Edwards & Rogall(1989)的文章，引物由上海英駿公司合成。擴增所用的試劑盒購買于大連寶生物公司。
PCR擴增體系為成分 終濃度濃縮反應緩沖液 1×工作濃度dNTP混合物 各0.2mmol/LTaq DNA聚合酶 0.5～1.0U/50uL氯化鎂(MgCl2) 1.5mmol/L上游引物 1umol/L下游引物 1umol/L模板 102～105拷貝/50ul
無菌水將反應體積補足至50ulPCR反應程序 16SrDNA的序列測定委托上海英俊生物科技有限公司進行，在GenBank數(shù)據(jù)庫上的登錄號是DQ311081，測試結果見附圖1。
序列表<110>廣東省微生物研究所<120>粵藍鏈霉菌<140>200610034149.7<141>2006-03-07<160>1<210>1<211>1419<212>DNA<213>粵藍鏈霉菌(Streptomyces vietnamensis)<400>1GCAAGTCGAA CGATGAAGCC CCTCGGGGTG GATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG 60GGCAATCTGC CCTTCACTCT GGGACAAGCC CTGGAAACGG GGTCTAATAC CGGATACGAC 120CCGGGAAGGC ATCTTCCCGG GTGGAAAGCT CCGGCGGTGA AGGATGAGCC CGCGGCCTAT 180CAGCTTGTTG GCGGGGTAAC GGCCCACCAA GGCGACGACG GGTAGCCGGC CTGAGAGGGC 240GACCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA 300TATTGCACAA TGGGCGCAAG CCTGATGCAG CGACGCCGCG TGAGGGATGA CGGCCTTCGG 360GTTGTAAACC TCTTTCAGCA GGGAAGAAGC GCAAGTGACG GTACCTGCAG AAGAAGCGCC 420GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGGCG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT 480
TGGGCGTAAA GAGCTCGTAG GCGGCTTGTC ACGTCGGGTG TGAAAGCCCG GGGCTTAACC 540CCGGGTCTGC ATCCGATACG GGCAGGCTAG AGTGTGGTAG GGGAGATCGG AATTCCTGGT 600GTAGCGGTGA AATGCGCAGA TATCAGGAGG AACACCGGTG GCGAAGGCGG ATCTCTGGGC 660CATTACTGAC GCTGAGGAGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT 720CCACGCCGTA AACGTTGGGA ACTAGGTGTT GGCGACATTC CACGTCGTCG GTGCCGCAGC 780TAACGCATTA AGTTCCCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTAAAACTC AAAGGAATTG 840ACGGGGGCCC GCACAAGCAG CGGAGCATGT GGCTTAATTC GACGCAACGC GAAGAACCTT 900ACCAAGGCTT GACATATACC GGAAAGCATT AGAGATAGTG CCCCCCTTGT GGTCGGTATA 960CAGGTGGTGC ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG 1020AGCGCAACCC TTGTCCTGTG TTGCCAGCAT GCCCTTCGGG GTGATGGGGA CTCACAGGAG 1080ACCGCCGGGG TCAACTCGGA GGAAGGTGGG GACGACGTCA AGTCATCATG CCCCTTATGT 1140CTTGGGCTGC ACACGTGCTA CAATGGCCGG TACAAAGAGC TGCGATGCCG TGAGGCGGAG 1200CGAATCTCAA AAAGCCGGTC TCAGTTCGGA TTGGGGTCTG CAACTCGACC CCATGAAGTC 1260GGAGTTGCTA GTAATCGCAG ATCAGCATTG CTGCGGTGAA TACGTTCCCG GGCCTTGTAC 1320ACACCGCCCG TCACGTCACG AAAGTCGGTA ACACCCGAAG CCGGTGGCCC AACCCCTTGT 1380GGGAGGGAGC TGTCGAAGGT GGGACTGGCG ATTGGGACG 1419
權利要求
1.一種新的鏈霉菌，其特征是命名為粵藍鏈霉菌(Streptomyces vietnamensis)，該菌種已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期為2005年12月9日，保藏登記號為CCTCCMNo.205143。
2.權利要求1所述的粵藍鏈霉菌，其16SrDNA部分的序列如下GCAAGTCGAACGATGAAGCCCCTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACCCGGGAAGGCATCTTCCCGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATCCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGCGATGCCGTGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACG。
3.權利要求1或2所述的粵藍鏈霉菌，其生物學特征是兼性厭氧，革蘭氏陽性，接觸酶陽性，產(chǎn)生黑色素和H2S，牛奶胨化，明膠液化快，能水解淀粉，能還原硝酸鹽；在掃描電鏡下可見，孢子多，孢子鏈直，分支，孢子長柱形，表面有一層鞘。
4.權利要求1或2所述的粵藍鏈霉菌，具有產(chǎn)生大量紫羅蘭藍色色素的能力。
5.權利要求3所述的粵藍鏈霉菌，具有產(chǎn)生大量紫羅蘭藍色色素的能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領域，特別是涉及一種能夠產(chǎn)生紫羅蘭藍色色素的新的鏈霉菌菌種，本發(fā)明特征在于命名為粵藍鏈霉菌(Streptomyces vietnamensis)，現(xiàn)在國家知識產(chǎn)權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2005年12月9日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCCM No.205143。本發(fā)明在酵母精麥芽精瓊脂(ISP2)、燕麥粉瓊脂(ISP3)和高氏合成一號瓊脂等培養(yǎng)基上可產(chǎn)生大量可溶性紫羅蘭藍色色素，該色素在紫外光下穩(wěn)定性較強，該色素熱穩(wěn)定性較好，能耐較高溫，具有從中開發(fā)出新型、高效、無毒天然色素的巨大潛力。
文檔編號C12P1/04GK1944630SQ200610034149
公開日2007年4月11日 申請日期2006年3月7日 優(yōu)先權日2006年3月7日
發(fā)明者朱紅惠, 郭俊, 孫曉棠, 羊宋貞, 李燕旋, 陳美標 申請人:廣東省微生物研究所