專利名稱：一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種能快速分解纖維質(zhì)有機(jī)物的木霉屬菌株(Trichoderma sp.)。
背景技術(shù)：
在農(nóng)作物栽培過(guò)程中使用生物制劑為現(xiàn)今栽培所使用的新技術(shù)，其中生物制劑的種類包括(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)者，如菌根菌、固氮菌及根圈有益微生物群；(2)病蟲(chóng)害生物防治者，如蘇力菌、木霉菌及枯草桿菌；(3)改善農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境者，如溶磷菌。生物制劑的功用主要在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增加產(chǎn)量及減少病蟲(chóng)害，而其它功能尚包含促進(jìn)植物激素產(chǎn)生、誘發(fā)植物抗病反應(yīng)、延緩?fù)寥浪峄?、減低土壤鹽類累積及誘使其它有益微生物產(chǎn)生。這些生物制劑近年來(lái)已有相當(dāng)多的研究投入。
生物制劑的定義如以廣泛的生物種類區(qū)分，除包含農(nóng)作物本身外，尚包含與農(nóng)作物發(fā)生反應(yīng)/作用的各種生物。如僅以微生物制劑而言，則生物制劑只包含微生物體本身或其相關(guān)代謝產(chǎn)物。微生物制劑施用在農(nóng)作物生長(zhǎng)上的效益可粗分為直接效益及間接效益。具直接效益的微生物包括亞科共生根瘤菌(Rhizobium)、與森林作物共生的放線菌(Frankia)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的固氮細(xì)菌、囊叢枝菌根菌(vesicualar-arbuscularmycorrhizal fungi)及外生菌根菌(ectomycorrhizal fungi)，其皆能直接促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)吸收。而具間接效益的微生物包括對(duì)植物病原菌、植物害蟲(chóng)及雜草競(jìng)爭(zhēng)的生物控制作用者，其具有減輕影響農(nóng)作物生長(zhǎng)的不良環(huán)境因子作用的間接機(jī)制。無(wú)論該機(jī)制為何，這些微生物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均能顯現(xiàn)促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)潛能，取代無(wú)機(jī)肥料及化學(xué)殺蟲(chóng)劑，降低生產(chǎn)成本及減少環(huán)境污染，并能確保農(nóng)作物產(chǎn)量。
一般農(nóng)業(yè)廢棄物均兼具污染性及資源性。利用微生物可妥善處理農(nóng)業(yè)廢棄物，將其適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)化為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所需的養(yǎng)分源(如氮、磷及鉀)及能量源(如碳)。若能將農(nóng)業(yè)廢棄物回歸于農(nóng)田，則不僅合乎資源再利用的自然法則，并且亦是現(xiàn)今處理大量有機(jī)廢棄物的重要方向。
微生物在堆肥發(fā)酵過(guò)程中擔(dān)任有機(jī)物分解與堆肥穩(wěn)定化的角色。接種適當(dāng)?shù)奈⑸锟杉铀俣逊拾l(fā)酵。為達(dá)到有效率的堆肥化作用，除添加適當(dāng)?shù)奈⑸锿猓诙逊e環(huán)境中，維持適合微生物生長(zhǎng)的條件使其能充分活動(dòng)與繁殖，更能加速堆肥的發(fā)酵與分解。堆肥發(fā)酵用的微生物的繁殖可利用自然堆肥法，即依照堆肥化條件，于木屑、豆粕堆肥材料中，調(diào)整適當(dāng)?shù)牟牧洗笮?、水分含量及通氣性等，再進(jìn)行堆積腐熟，使自然界中微生物滋生于該堆肥材料中，最后該腐熟堆肥中即含有多種能分解有機(jī)物的微生物菌種。該等微生物菌種可作為下一批堆肥制作的微生物菌種。但為了增進(jìn)堆肥材料發(fā)酵的分解效率，針對(duì)不同有機(jī)物的特性，添加適當(dāng)?shù)奈⑸锞N將是堆肥制作過(guò)程中的重要步驟。其中有關(guān)利用微生物菌種的關(guān)鍵機(jī)制應(yīng)包括篩選適當(dāng)?shù)奈⑸锞N、建立有效率的菌種培養(yǎng)及繁殖方法以及應(yīng)用于堆肥材料中的接種方法等。
已發(fā)現(xiàn)木霉菌(Trichoderma sp.)除可拮抗某些植物病原菌(諸如猝倒病菌(Pythium sp)及立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)等)以減少農(nóng)作物死亡外，其部分菌株尚可與農(nóng)作物根系共生以克服環(huán)境逆境，達(dá)到保護(hù)其根系、增進(jìn)養(yǎng)份吸收、促進(jìn)生長(zhǎng)及提高產(chǎn)量等效果。利用基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)可將抗病基因?qū)胫参矬w內(nèi)而達(dá)到抗病功能。由于木霉菌有諸多功能上的優(yōu)點(diǎn)，目前已有將該菌開(kāi)發(fā)成生物防治用的生物制劑。常用的木霉菌包括T.virens、T.harzianum、T.atroviride及T.asperellum，且應(yīng)用的農(nóng)作物包括蔬菜、果樹(shù)、花卉及草皮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株。
本發(fā)明的木霉菌株的特征為分生孢子柄具有復(fù)數(shù)的側(cè)生枝，每一分枝可分岔，較常形成對(duì)生小分枝；每一小枝上可產(chǎn)生2～3個(gè)輪生或?qū)ι帕械漠a(chǎn)孢細(xì)胞；產(chǎn)孢細(xì)胞為瓶梗形，其型態(tài)多為直立，部分稍微彎曲，中間較寬狀似葫蘆形，大小為6.9～11.8×1.5～3.11μm；分生孢子為近球形至寬橢圓形，部分稍微呈卵形，大小為3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈綠色；成熟孢子表面平滑至粗糙，具不明顯刺狀飾物；孢子壁表面飾物在掃描電子顯微鏡下呈尖塔形或梯形平臺(tái)狀，分布于整個(gè)孢子表面。
本發(fā)明提供的一種纖維分解能力強(qiáng)的木霉菌株，該菌株可于堆肥反應(yīng)的初期即能快速擴(kuò)散至整個(gè)堆肥材料，以使堆肥材料等有機(jī)物在堆肥發(fā)酵過(guò)程中迅速分解，并可作為有機(jī)堆肥材料酸酵添加劑使用。
本發(fā)明篩選出的木霉菌株對(duì)有機(jī)堆肥具有高分解力，且可以加速堆肥腐熟，減少堆肥化時(shí)程，降低堆肥制作成本。


圖1是為本發(fā)明的木霉菌株在25℃于含2％麥芽萃取物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)第七天的菌落形態(tài)圖；圖2是為本發(fā)明的木霉菌株在25℃時(shí)于馬鈴薯葡萄糖-洋菜培養(yǎng)基中生長(zhǎng)第七天的菌落形態(tài)圖；圖3是為本發(fā)明的木霉菌株的產(chǎn)孢區(qū)域在63倍放大倍率下呈現(xiàn)苞狀突起的外觀形態(tài)圖；圖4是為本發(fā)明的木霉菌株的分生孢子柄及分枝在200倍放大倍率的外觀形態(tài)圖；圖5是為本發(fā)明的木霉菌株的分生孢子柄及分枝在200倍放大倍率的另一外觀形態(tài)圖；圖6是為本發(fā)明的木霉菌株的分生孢子柄及分枝在1000倍放大倍率的外觀形態(tài)圖；以及圖7是為本發(fā)明的木霉菌株的分生孢子柄在2000倍放大倍率的外觀形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的木霉菌株可分離自天然來(lái)源，例如土壤、農(nóng)作物根系及農(nóng)家自制的堆肥，其中利用2％水瓊脂(Wateragar，W.A.)洋菜平板法進(jìn)行微生物分離。經(jīng)土壤分離者，稱取1g土壤置于10c.c.無(wú)菌水中，經(jīng)振蕩后取出濾液進(jìn)行平板劃線分離。對(duì)農(nóng)作物根系分離者采用根段分離法，將根段洗凈后切取0.5公分小段，將其中5小段置于水瓊脂中；將各堆肥材料先細(xì)分成0.5公分后，取其中5小段置于水瓊脂中，以上每種材料準(zhǔn)備5個(gè)培養(yǎng)皿，經(jīng)于28℃培養(yǎng)箱中不照光培養(yǎng)三天后，挑取片段菌絲尖端，將其移至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)7天后觀察各菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，由其中挑取木霉菌菌絲形態(tài)的菌株，經(jīng)二次純系分離后，切取0.5cm2的菌絲塊置于5c.c.無(wú)菌水的螺旋試管中保存；各分離菌株經(jīng)馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)七天后，切取菌絲塊，置于10g培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察各個(gè)菌株的菌絲纏繞及生長(zhǎng)情形，并觀察其產(chǎn)孢情形，據(jù)以挑選能快速纏繞稻谷培養(yǎng)基并能產(chǎn)孢的菌株。
經(jīng)挑選出可適用于牛糞堆肥的菌株經(jīng)BCRC鑒定后是為Trichodermaasperellum(TCT301)，其特征為分生孢子柄具有復(fù)數(shù)的側(cè)生枝，每一分枝可分岔，較常形成對(duì)生小分枝；每一小枝上可產(chǎn)生2～3個(gè)輪生或?qū)ι帕械漠a(chǎn)孢細(xì)胞(如圖3至圖5所示)，產(chǎn)孢細(xì)胞為瓶梗形，其型態(tài)多為直立，部分稍微彎曲，中間較寬狀似葫蘆形，大小為6.9～11.8×1.5～3.1μm；分生孢子為近球形至寬橢圓形，部分稍微呈卵形，大小為3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈綠色；成熟孢子表面平滑至粗糙，具不明顯刺狀飾物；孢子壁表面飾物于掃描式電顯下呈尖塔形或梯形平臺(tái)狀，分布于整個(gè)孢子表面(如圖6及圖7所示)。
以下是測(cè)試所得木霉菌于不同生長(zhǎng)條件下的菌株特性。
將前述菌株接種于MA2培養(yǎng)基(含2％麥芽萃取物的培養(yǎng)基)，置于25℃下生長(zhǎng)快速，3～4天后菌絲可擴(kuò)展至整個(gè)9公分培養(yǎng)皿(如圖1所示)；產(chǎn)孢細(xì)胞于培養(yǎng)皿外圍形成束狀小叢，為粉狀或顆粒狀；成熟孢子團(tuán)呈現(xiàn)深綠色；菌落背面呈白色。
將前述菌株接種于麥芽萃取物洋菜培養(yǎng)基(MEA)中，置于25℃下生長(zhǎng)快速，3天后菌絲可擴(kuò)展至整個(gè)9公分培養(yǎng)皿(如圖1所示)，菌落平展，產(chǎn)孢濃密，產(chǎn)孢細(xì)胞散生分布于整個(gè)培養(yǎng)皿，為粉狀或顆粒狀；成熟孢子團(tuán)呈現(xiàn)暗綠色；菌落背面呈白色至乳黃色。
將前述菌株接種于馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基(PDA)中，置于25℃下生長(zhǎng)快速，3天后菌絲可擴(kuò)展至整個(gè)9公分培養(yǎng)皿(如圖2所示)，菌落平展，產(chǎn)孢濃密，產(chǎn)孢細(xì)胞散生分布于整個(gè)培養(yǎng)皿，為粉狀或顆粒狀；成熟孢子團(tuán)呈現(xiàn)橄欖綠至深綠色；菌落背面呈白色至乳黃色。
本發(fā)明的木霉菌株可以是分離自天然來(lái)源的木霉菌株的變異體，例如經(jīng)紫外線(UV)照射、甲磺酸乙脂處理或亞硝酸處理所得到的變異體，亦可以是利用細(xì)胞融合或重組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)技術(shù)經(jīng)基因工程改造所產(chǎn)生的重組菌株。
以下實(shí)施例是用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并非限于下述的實(shí)施例實(shí)施例1.使用木霉菌制作堆肥的溫度效應(yīng)牛糞有機(jī)堆肥材料的各成分干物重用量比例依序?yàn)?牛糞1000kg、稻殼500kg、米糠100kg)；將堆肥材料混合均勻后再取用適量本發(fā)明所述的木霉菌(菌數(shù)約1×1012spore/ml)，先加水稀釋200倍成菌懸液，再將菌稀釋液混入堆肥材料中，最后將堆肥材料水分含量調(diào)整至60％，堆積高度維持約1.5～2.0m，爾后立即進(jìn)行堆積制作，堆肥腐化期間約5～7日利用鏟裝機(jī)每日翻堆乙次，持續(xù)至堆肥腐熟為止。
在接種木霉菌的牛糞堆肥材料制作堆積的第0-5日，堆肥體溫度上升到60℃以上，最高可達(dá)到67℃，此高溫期(＞60℃)維持至約第15日，爾后溫度逐漸降低，約第31～35日，堆肥溫度降低至約44℃，約第36～45日，堆肥溫度可降低至約41℃；未接種木霉菌的牛糞堆肥，在堆積制作第6～10日，堆肥體溫度上升到60℃以上，最高可達(dá)61℃，約第36-35日，堆肥溫度約48℃，約第36～45日，堆肥溫度才降低至約44℃，顯示接種木霉菌處理的牛糞堆肥可以促進(jìn)堆肥高溫(＞60℃)，最后提早4～6日達(dá)到腐熟階段。
使用木霉菌制作堆肥的溫度效應(yīng)如表一所示表一、接種木霉菌對(duì)牛糞堆肥材料溫度的影響

單位(℃)實(shí)施例2.使用木霉菌對(duì)堆肥養(yǎng)分含量的影響堆肥制作同實(shí)施例1，由牛糞堆肥的養(yǎng)分含量分析結(jié)果顯示如下表二，利用木霉菌接種的牛糞堆肥氮含量約2.51％、磷含量約1.27％、鉀含量約2.70％、鈣含量約1.59％、鎂含量約1.67％、有機(jī)質(zhì)含量約60.7％、鋅含量約85ppm、銅含量約32ppm、木霉菌數(shù)6.2×105spore(孢子)/g。
未接種木霉菌的牛糞堆肥氮含量約2.44％、磷含量約1.25％、鉀含量約2.62％、鈣含量約1.39％、鎂含量約1.61％、有機(jī)質(zhì)含量約64.7％、鋅含量約84ppm、銅含量約30ppm、木霉菌數(shù)1.1×102spore(孢子)/g。
顯然有接種木霉菌的牛糞堆肥的氮、磷、鉀、鈣、鎂、鋅及銅等含量均略高于未接種處理，且其養(yǎng)分含量較穩(wěn)定。有接種木霉菌菌種于堆肥制作過(guò)程中，以及牛糞堆肥等制成品中，均可分離出所添加的菌種，分離率約為1×105至1×106spore/g，顯示所添加的木霉菌菌種可在堆肥化過(guò)程及堆肥成品中存活。
表二、接種木霉菌對(duì)牛糞堆肥溫度的影響

本發(fā)明的實(shí)施方法已詳述于前述實(shí)施例中，該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本案的專利范圍中。
綜上所述，本發(fā)明篩選出的木霉菌株對(duì)牛糞堆肥材料配方具高分解力，且可以加速堆肥腐熟，減少堆肥化時(shí)程，降低堆肥制作成本。
權(quán)利要求
1.一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，該菌株的特征為分生孢子柄具有復(fù)數(shù)的側(cè)生枝，每一分枝可分岔，較常形成對(duì)生小分枝；每一小枝上可產(chǎn)生2～3個(gè)輪生或?qū)ι帕械漠a(chǎn)孢細(xì)胞，產(chǎn)孢細(xì)胞為瓶梗形，其型態(tài)多為直立，部分稍微彎曲，中間較寬狀似葫蘆形，大小為6.9～11.8×1.5～3.1μm；分生孢子為近球形至寬橢圓形，部分稍微呈卵形，大小為3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈綠色；成熟孢子表面平滑至粗糙，具不明顯刺狀飾物；孢子壁表面飾物于掃描電子顯微鏡下呈尖塔形或梯形平臺(tái)狀，分布于整個(gè)孢子表面。
2.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述的木霉菌株接種于含2％麥芽萃取物的培養(yǎng)基并置于25℃時(shí)可生長(zhǎng)快速，3～4天菌絲可擴(kuò)展至整個(gè)9公分培養(yǎng)皿；產(chǎn)孢構(gòu)造于培養(yǎng)皿外圍形成束狀小叢，為粉狀或顆粒狀；成熟孢子團(tuán)呈現(xiàn)深綠色；菌落背面呈白色。
3.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述的木霉菌株接種于麥芽萃取物洋菜培養(yǎng)基培養(yǎng)基并置于25℃時(shí)可生長(zhǎng)快速，3天菌絲可擴(kuò)展至整個(gè)9公分培養(yǎng)皿，菌落平展，產(chǎn)孢濃密，產(chǎn)孢構(gòu)造散布于整個(gè)培養(yǎng)皿，為粉狀或顆粒狀；成熟孢子團(tuán)呈現(xiàn)暗綠色；菌落背面呈白色至乳黃色。
4.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述的木霉菌株接種于馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基，置于25℃，生長(zhǎng)快速，3天后菌絲可擴(kuò)展至整個(gè)9公分培養(yǎng)皿，菌落平展，產(chǎn)孢濃密，產(chǎn)孢構(gòu)造散布于整個(gè)培養(yǎng)皿。
5.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述產(chǎn)孢構(gòu)造為粉狀或顆粒狀。
6.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述成熟孢子團(tuán)呈現(xiàn)暗橄欖綠至深綠色。
7.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述菌落背面呈白色至乳黃色。
8.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述木霉菌株是分離自天然來(lái)源的木霉菌株的變異體。
9.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述木霉菌株是經(jīng)紫外線(UV)照射、甲磺酸乙脂處理或亞硝酸處理所得到的變異體。
10.按權(quán)利要求1所述的一種能將動(dòng)物性的有機(jī)堆肥材料分解發(fā)酵的木霉菌株，其特征在于所述木霉菌株是利用細(xì)胞融合或重組脫氧核糖核酸技術(shù)經(jīng)基因工程改造所產(chǎn)生的重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于一種能將富含纖維質(zhì)的有機(jī)堆肥(諸如牛糞)分解發(fā)酵的木霉菌株，該菌株的特征為分生孢子柄具有復(fù)數(shù)的側(cè)生枝，每一分枝可分岔，較常形成對(duì)生小分枝；每一小枝上可產(chǎn)生2～3個(gè)輪生或?qū)ι帕械漠a(chǎn)孢細(xì)胞；產(chǎn)孢細(xì)胞為瓶梗型，其型態(tài)多為直立，部分稍微彎曲，中間較寬狀似葫蘆形，大小為6.9～11.8×1.5～3.1μm；分生孢子為近球形至寬橢圓型，部分稍微呈卵形，大小為3.1～4.6×2.4～3.7μm，呈綠色；成熟胞子表面平滑至粗糙，具不明顯刺狀飾物；孢子壁表面飾物于掃描式電顯下呈尖塔形或梯形平臺(tái)狀，分布于整個(gè)孢子表面。
文檔編號(hào)C12R1/885GK101050425SQ200610034868
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2006年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者蕭松溪 申請(qǐng)人:蕭松溪