專利名稱：層疊雜交熒光放大磁分離檢測(cè)dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)DNA的方法。
背景技術(shù)：
自1953年華特遜(Watson)和克瑞克(Crick)創(chuàng)立生物遺傳分子脫氧核糖核酸(DNA)的雙螺旋結(jié)構(gòu)和建立生物遺傳基因的分子機(jī)理以來，有關(guān)DNA分子的識(shí)別、測(cè)序一直為人們所關(guān)注。1990年美國(guó)制定了世界最龐大的基因研究計(jì)劃“人類基因組計(jì)劃”，隨著人類基因草圖的公布，人們正在深入開展后基因組計(jì)劃研究，為此，國(guó)際上掀起了有關(guān)生物芯片和生物傳感器的研究熱潮?；蚩刂浦祟惿纳喜∷肋^程，隨著對(duì)基因與癌癥及其它與基因有關(guān)病癥的了解，在分子水平上檢測(cè)易感物種及基因突變，對(duì)于疾病的治療及預(yù)后有著重要的意義。比如，歷史上許多災(zāi)難性的瘟疫(如霍亂、天花、麻疹等)，以及當(dāng)前對(duì)人類造成嚴(yán)重威脅與恐慌的流行性疾病(如SARS，禽流感)都是由相應(yīng)的病菌或病毒所引起的，因此及時(shí)盡早診斷出病源微生物的感染，是預(yù)防這類疾病的關(guān)鍵。對(duì)于許多基因疾病(如眾多癌癥、帕金森氏綜合癥、阿爾茨海默氏病等)，只有在發(fā)病的前期發(fā)現(xiàn)，才有治愈的希望。另外，人類的許多疾病都是以環(huán)境為載體進(jìn)行傳播的。當(dāng)環(huán)境中存在病原微生物或基因誘變劑時(shí)，就會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生極大的威脅。如果能及時(shí)發(fā)現(xiàn)環(huán)境中病原物的存在，就可以盡早進(jìn)行疾病預(yù)防，防止引起人體感染。因此，為實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的早期診斷乃至超前診斷，提高人類的生存質(zhì)量，加強(qiáng)對(duì)DNA檢測(cè)方法的研究和應(yīng)用開發(fā)，實(shí)現(xiàn)DNA的低濃度檢測(cè)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
在各種不同的基因檢測(cè)技術(shù)中，制約其發(fā)展和應(yīng)用的一個(gè)非常重要的因素是檢測(cè)靈敏度。比如，對(duì)于濾過性病毒感染，需要檢測(cè)的DNA量在10-15摩爾/升或10-18摩爾/升水平。為達(dá)到這樣低的檢測(cè)限，必須通過擴(kuò)增樣本量或?qū)で蠓糯髾z測(cè)信號(hào)的方法。目前，新型納米材料在生物分析中的應(yīng)用成為一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域。過去10年來，納米材料在生物大分子超靈敏識(shí)別分析和生物信息獲取方面的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究在國(guó)際上一直受到高度重視。研究的熱點(diǎn)主要集中在熒光材料標(biāo)記物、納米金、納米銀、氧化硅納米顆粒等納米材料的制備與應(yīng)用上，各種各樣的納米結(jié)構(gòu)決定了它們?cè)谏餀z測(cè)中的應(yīng)用特性。
在納米熒光標(biāo)記材料的研究中，分子信標(biāo)的研究是最新研究進(jìn)展之一。所謂分子信標(biāo)(molecular beacon)，是一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的新型熒光核酸探針。自由狀態(tài)時(shí)的分子信標(biāo)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時(shí)由于熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)靠得很近，熒光被猝滅；當(dāng)與靶序列結(jié)合后，分子信標(biāo)的空間構(gòu)型發(fā)生改變，熒光恢復(fù)。近年來人們對(duì)這種具有諸多優(yōu)良特性的寡核苷酸探針進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，對(duì)其結(jié)構(gòu)特性以及在各方面的應(yīng)用展開了廣泛而深入的研究，做出了許多改進(jìn)，使其在序列檢測(cè)、病原體偵測(cè)、藥物療效監(jiān)測(cè)、區(qū)分基因野生型和突變型、DNA-蛋白相互作用研究、定量聚合酶鏈擴(kuò)增(PCR)、以及體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)等眾多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。例如，可用分子信標(biāo)對(duì)活細(xì)胞中mRNA進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并應(yīng)用于DNA/RNA超小生物傳感器及蛋白質(zhì)實(shí)時(shí)檢測(cè)。隨著生物納米技術(shù)的發(fā)展，最近杜貝垂(Dubertret)等嘗試用1.4nm的納米金作為猝滅基團(tuán)。與常規(guī)猝滅基團(tuán)DABCYL相比，納米金可以在可見到近紅外的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，有效的猝滅各種熒光染料。而且金顆粒在較低的離子強(qiáng)度條件下吸收效果較好。納米金的引入，不僅可以降低分子信標(biāo)制備成本，而且研究結(jié)果表明，這種技術(shù)對(duì)單堿基錯(cuò)配序列更為敏感，特別適合于在眾多相似序列中高靈敏地檢測(cè)出靶序列。例如，可在競(jìng)爭(zhēng)性雜交陣列中高靈敏地檢測(cè)出單堿基突變。目前的問題是需要進(jìn)一步改善納米金與DNA之間結(jié)合的穩(wěn)定性，以免消除分子信標(biāo)過程中納米金掉下而影響猝滅效果。
在納米金的研究方面，近年取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。金納米粒子在水中形成的分散系俗稱膠體金，膠體金顆粒大小根據(jù)制備條件不同可以是幾納米至100納米以上。近年來，這方面的研究進(jìn)展很快，1997年澤貝(Zehbe)報(bào)道了用納米金作為信號(hào)報(bào)告分子的原位雜交技術(shù)，對(duì)組織中病毒核酸的檢測(cè)靈敏度提高到了一個(gè)拷貝；最近幾年，美國(guó)西北大學(xué)化學(xué)系和納米技術(shù)研究所默金(Mirkin)教授等人利用納米金在DNA片段作為組裝分子的引導(dǎo)下可形成超分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，建立了用巰基化寡核苷酸探針標(biāo)記納米金并檢測(cè)特定多核苷酸序列的新方法。2000年，他們?cè)诨蛐酒治鲋羞\(yùn)用納米金顆粒標(biāo)記與銀染顯色，有效地放大了雜交信號(hào)，并預(yù)期應(yīng)用該技術(shù)有可能免除PCR基因靶序列擴(kuò)增過程，避免PCR過程可能引起的假陰性和假陽(yáng)性。他們顯著提高了靈敏度和信噪比，比現(xiàn)有最靈敏的共聚焦誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方法靈敏100倍，而在靈敏溫度范圍內(nèi)，正配/單堿基錯(cuò)配信號(hào)強(qiáng)度差別非常明顯(信號(hào)強(qiáng)度比大于10)，實(shí)現(xiàn)了單堿基錯(cuò)配的識(shí)別。2002年。他們又在原來工作的基礎(chǔ)上引入了微電極檢測(cè)技術(shù)，使得正配/單堿基錯(cuò)配的信號(hào)強(qiáng)度比大大提高，達(dá)到了105∶1，而檢測(cè)靈敏度提高到了500摩爾/升。
關(guān)于氧化硅納米顆粒，人們已可制得一定尺寸范圍的實(shí)心或殼層納米顆粒。對(duì)于殼層納米粒子，可將熒光標(biāo)簽分子組裝在殼層內(nèi)，形成穩(wěn)定的核-殼納米顆粒。這種核-殼納米結(jié)構(gòu)，由于熒光標(biāo)簽分子被包裹或組裝在二氧化硅殼內(nèi)，不容易發(fā)生光漂白，因而保存壽命延長(zhǎng)。對(duì)于實(shí)心型的二氧化硅納米顆粒，熒光基團(tuán)是被鉚接在顆粒表面。無論是實(shí)心納米顆粒還是核-殼結(jié)構(gòu)納米顆粒，一個(gè)顆粒上所載有的熒光標(biāo)簽分子數(shù)目都可以很大，當(dāng)二氧化硅納米顆粒通過其表而修飾的功能基團(tuán)而與生物大分子結(jié)合時(shí)，相對(duì)與傳統(tǒng)方法來說，信號(hào)無疑可以大大放大，這種放大效果與單個(gè)納米顆粒上組裝的熒光標(biāo)簽分子數(shù)目多少有關(guān)。
在磁性納米顆粒方面，人們不僅將其應(yīng)用于生物樣品的富集分離，而且在磁標(biāo)記檢測(cè)、磁性納米顆粒熱療和藥物包埋靶向治療方面取得了可喜的研究成果。美國(guó)羅米雷克斯(Luminex)和依羅米那(Illumina)公司已將這種技術(shù)商業(yè)化，但分析系統(tǒng)價(jià)格昂貴。
上述情況表明，有關(guān)納米顆粒在生物大分子識(shí)別分析中的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究在國(guó)際上已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，國(guó)內(nèi)在這方面也取得了不少成績(jī)。中南大學(xué)研究小組在磁性納米顆粒包埋藥物治療肝癌領(lǐng)域處于國(guó)際先進(jìn)水平，東南大學(xué)在納米磁性顆粒的惡性腫瘤熱療方面取得了新的進(jìn)展；湖南大學(xué)在二氧化硅納米顆粒及分子信新標(biāo)的研究中也作出了具有自己特色的工作；第三軍醫(yī)大學(xué)將石英晶體傳感器表面組裝以納米金，成功地應(yīng)用于肝炎等重大疾病的免疫分析；東南大學(xué)還通過將分子信標(biāo)固定在水凝膠膜里，由于提供了類似于液相的反應(yīng)環(huán)境，顯著降低了固定化分子信標(biāo)的背景信號(hào)。
上述納米科學(xué)技術(shù)的發(fā)展無疑推動(dòng)了生物大分子超靈敏識(shí)別技術(shù)的發(fā)展，但整體來說還處于發(fā)展的初期，很多問題尚沒有解決，例如固載化分子信標(biāo)的高噪聲背景，就涉及到界面/表面化學(xué)的諸多問題納米顆粒的穩(wěn)定性、分子間的相互作用、界面對(duì)分子運(yùn)動(dòng)的影響、固定化標(biāo)簽分子的空間效應(yīng)和組裝密度及聯(lián)結(jié)分子/基團(tuán)長(zhǎng)度對(duì)生物大分子識(shí)別的影響等，都急需人們?nèi)ミM(jìn)行深入的探討。
綜上所述，在核酸大分子識(shí)別研究領(lǐng)域，人們往往借助PCR技術(shù)大量復(fù)制分析片段后再進(jìn)行分析。但由于需要一個(gè)擴(kuò)增過程，條件優(yōu)化較為煩瑣，受試劑質(zhì)量和環(huán)境的影響非常敏感，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，因此整體發(fā)展趨勢(shì)是既借助PCR技術(shù)，也在積極探索免PCR的高靈敏分析方法，其中納米顆粒的放大作用是研究人員的首選。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服了上述技術(shù)問題的不足，提供了一種操作簡(jiǎn)單、超靈敏的DNA檢測(cè)方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了快速現(xiàn)場(chǎng)采樣并快速而高靈敏地獲取樣本的生物學(xué)信息。
為了解決上述存在的技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案一種層疊雜交熒光放大磁分離檢測(cè)DNA的方法，其特征在于包括下列步驟在SiO2納米顆粒上同時(shí)標(biāo)記a，b兩種序列不同的DNA；在磁性納米顆粒表面標(biāo)記e序列的DNA；第一次三明治雜交靶DNA的一端與SiO2納米顆粒上b序列的DNA雜交，靶DNA的另一端與磁性納米顆粒上e序列的DNA雜交；另一種SiO2納米顆粒上同時(shí)標(biāo)記c，d兩種序列不同的DNA；另一種SiO2納米顆粒上c序列的DNA與熒光DNA雜交；第二次三明治雜交第一次三明治雜交后的SiO2納米顆粒上a序列的DNA與連接DNA的一端雜交，連接DNA的另一端與熒光雜交后的納米顆粒上d序列的DNA雜交；第二次三明治雜交后產(chǎn)物經(jīng)磁分離清洗后，去除多余的熒光分子和非特異性吸附；再將第二次三明治雜交后產(chǎn)物DNA變性，解鏈后的熒光DNA即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用目前最成熟的熒光檢測(cè)技術(shù)，將靶DNA的雜交信號(hào)直接轉(zhuǎn)移為放大的熒光信號(hào)，DNA變性后可立即進(jìn)行熒光檢測(cè)，省卻了在DNA變性后重新進(jìn)行“三明治”雜交然后再金標(biāo)銀染的漫長(zhǎng)過程；而且本發(fā)明應(yīng)用了納米顆粒的層疊放大技術(shù)，使熒光信號(hào)進(jìn)一步成指數(shù)級(jí)放大，確保了DNA的超低檢測(cè)限分析；本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了超靈敏的DNA檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了快速現(xiàn)場(chǎng)采樣并快速而高靈敏地獲取樣本的生物學(xué)信息。

圖1是層疊雜交熒光放大磁分離檢測(cè)DNA的方法示意圖；圖2是層疊雜交熒光放大磁分離檢測(cè)DNA方法的流程示意圖。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述層疊放大DNA檢測(cè)的原理圖見圖1、2。SiO2納米顆粒上同時(shí)標(biāo)記a，b兩種序列不同的DNA，其中序列a與連接DNA的一端完全正配，序列b與靶序列DNA的一端完全正配。序列a的標(biāo)記量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于序列b。磁性納米顆粒表面標(biāo)記另一種DNA序列e，其序列與靶DNA的另一端完全正配。兩種修飾有DNA的納米顆粒與靶DNA進(jìn)行第一次雜交，納米顆粒表面的序列b，e與靶序列形成”三明治”雜交結(jié)構(gòu)，此時(shí)的SiO2納米顆粒表面保留有大量的DNA單鏈a。另一種SiO2納米顆粒上同時(shí)標(biāo)記c，d兩種序列不同的DNA，其中序列c與熒光DNA的完全正配，序列d與連接DNA的另一端完全正配，序列c的標(biāo)記量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于序列d。序列c與熒光DNA雜交后，此SiO2納米顆粒表面留下DNA單鏈d。
將熒光雜交后的SiO2納米顆粒與前面第一次雜交后形成的”三明治”雜交結(jié)構(gòu)混合，加入連接DNA進(jìn)行第二次雜交，形成第二層次的“序列a-連接DNA-序列d”三明治雜交結(jié)構(gòu)。就整個(gè)雜交體系來說，呈層疊放大結(jié)構(gòu)。磁分離清洗后，去除多余的熒光分子和非特異性吸附，將”三明治”結(jié)構(gòu)進(jìn)行雜交變性，解鏈后的熒光DNA進(jìn)行熒光檢測(cè)。由于序列a的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于序列b，序列c的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于序列d，所以經(jīng)過兩次放大后，最終檢測(cè)的熒光信號(hào)成指數(shù)級(jí)放大。此方法靈敏度得到更大的提高，可發(fā)展成為一種免PCR的DNA超靈敏檢測(cè)方法(PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈反應(yīng)，是一種對(duì)特定DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。該方法一改傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)的模式，不通過活細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便。短時(shí)間內(nèi)能使幾個(gè)拷貝的模版序列，甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107～108倍，大大提高DNA的得率)。
我們可以直接從市場(chǎng)上得到納米顆粒，或者應(yīng)用溶膠-凝膠法制備納米顆粒材料。一般來講，納米顆粒因其具有很大的比表面，因此表面能很高，容易聚集。我們對(duì)新合成得到的納米粒子進(jìn)行表面修飾改性來調(diào)節(jié)粒子間的相互作用(相互排斥/相互吸引)，并通過調(diào)節(jié)納米粒子存在體系的介質(zhì)性質(zhì)來改變體系的電性質(zhì)和介質(zhì)與納米粒子間的相互作用，達(dá)到穩(wěn)定納米粒子和可以長(zhǎng)期保存的目的。
由于納米粒子表面需要進(jìn)行功能化才能進(jìn)行與生物大分子之間的特異性結(jié)合，以及粒子之間的層疊(Layer-by-layer)放大，因此，納米粒子的表面功能化具有重要意義。本發(fā)明中SiO2納米顆?？梢栽诒砻姘被柰榛蠼又Π被?，通過手臂分子戊二醛的連接作用，將末端帶氨基的DNA分子固定在顆粒表面；也可以在SiO2納米顆粒表面巰基硅烷化后接枝巰基，然后通過-SH/-S-S-交換反應(yīng)將末端帶二硫鍵的DNA固定在顆粒表面。磁性納米顆?？梢酝ㄟ^表面氨基硅烷化后，在EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)存在下與DNA的5’磷酸基形成氨基磷酸鍵；也可以在磁性納米顆粒表面固定親和素后與生物素標(biāo)記的DNA結(jié)合。
SiO2納米顆粒表面固定兩種序列不同的DNA分子，并要求一種DNA分子的固定量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于另一種DNA分子的固定量。
疾病樣本DNA經(jīng)過篩選，獲取需要的靶DNA。
權(quán)利要求
1.一種層疊雜交熒光放大磁分離檢測(cè)DNA的方法，其特征在于包括下列步驟(A)、在SiO2納米顆粒上同時(shí)標(biāo)記a，b兩種序列不同的DNA；(B)、在磁性納米顆粒表面標(biāo)記e序列的DNA；(C)、第一次三明治雜交靶DNA的一端與SiO2納米顆粒上b序列的DNA雜交，靶DNA的另一端與磁性納米顆粒上e序列的DNA雜交；(D)、另一種SiO2納米顆粒上同時(shí)標(biāo)記c，d兩種序列不同的DNA；(E)、另一種SiO2納米顆粒上c序列的DNA與熒光DNA雜交；(F)、第二次三明治雜交第一次三明治雜交后的SiO2納米顆粒上a序列的DNA與連接DNA的一端雜交，連接DNA的另一端與熒光雜交后的納米顆粒上d序列的DNA雜交；(G)、第二次三明治雜交后產(chǎn)物經(jīng)磁分離清洗后，去除多余的熒光分子和非特異性吸附；再將第二次三明治雜交后產(chǎn)物DNA變性，解鏈后的熒光DNA即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種層疊雜交熒光放大磁分離檢測(cè)DNA的方法。它的技術(shù)要點(diǎn)在于包括下列步驟在SiO
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101082583SQ20061003569
公開日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者聶立波, 賀全國(guó), 陳洪, 何農(nóng)躍 申請(qǐng)人:中山耐樂生物科技有限公司