專利名稱：一種原核分泌表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程表達(dá)載體，具體的說，涉及一種原核分泌表達(dá)載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因工程中可通過真核或原核表達(dá)系統(tǒng)以獲得外源基因表達(dá)產(chǎn)物。原核表達(dá)是一類在E.coli等原核細(xì)胞中以發(fā)酵表達(dá)重組蛋白的方式，引起操作相對簡便，表達(dá)快速、高效而在實踐中被廣泛采用，是目前最成熟的表達(dá)系統(tǒng)。
原核表達(dá)大體可分為三類非融合表達(dá)、融合表達(dá)和分泌表達(dá)。以非融合方式表達(dá)外源基因時，所得到重組蛋白的氨基酸序列與目的產(chǎn)物一致。但此種方式對翻譯起始序列的二級結(jié)構(gòu)要求十分嚴(yán)格，不同的二級結(jié)構(gòu)表達(dá)量可相差幾個數(shù)量級，并且表達(dá)的多肽往往不能夠正確折疊，表達(dá)產(chǎn)物大部分歸于不具有任何生物活性的包涵體形式，及時通過繁瑣的包涵體復(fù)性處理后，活性產(chǎn)物的得率仍十分低。融合表達(dá)利用了一類特定的融合伴體與外源蛋白融合，協(xié)助外源蛋白的正確折疊，容易獲得較高水平的表達(dá)，同時表達(dá)產(chǎn)物的水溶性一般較好。但是在融合蛋白的純化過程中必須將融合伴體切除以獲得外源蛋白的單體。通常使用化學(xué)裂解或酶解法?；瘜W(xué)裂解(溴化氰等)產(chǎn)物難以得到蛋白的天然構(gòu)象；酶解法(凝血酶、胰蛋白酶等)切割效率低，產(chǎn)物的最終收率仍有待提高。
分泌表達(dá)是一種比較先進(jìn)的表達(dá)方式。通過將一段信號肽序列嵌合到目的基因上游，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位序列得以整合到表達(dá)產(chǎn)物新生肽的N端序列上，它們與細(xì)胞膜或質(zhì)膜的特異受體識別并結(jié)合，引導(dǎo)目的多肽分泌到細(xì)胞外周質(zhì)或培養(yǎng)基中，分泌完成后，信號肽被E.coli基因組編碼的信號肽酶切除。
然而，現(xiàn)有的分泌表達(dá)載體只注意到利用信號肽協(xié)助蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位，而不具有幫助蛋白質(zhì)正確折疊和裝配的能力。少數(shù)信號肽或引導(dǎo)肽(如DsbA/C)可能同時兼具有催化折疊的功能，但這些序列本身十分短小，在共翻譯運(yùn)輸?shù)哪Ｐ椭校铣傻男律腘端與膜上受體相結(jié)合，此時肽鏈形成天然構(gòu)象或亞基裝配成復(fù)合物之前，它們原來包埋在蛋白質(zhì)中心的疏水區(qū)瞬間會暴露而錯誤折疊或聚集形成不正確的產(chǎn)物，導(dǎo)致活性蛋白的表達(dá)量下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有分泌表達(dá)載體存在的不足，提供一種在表達(dá)外源基因時能有效提高表達(dá)產(chǎn)物的正確折疊率和水溶性的原核分泌表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述原核分泌表達(dá)載體在表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明通過信號肽將新生多肽引導(dǎo)到細(xì)胞周質(zhì)，在確保分泌型表達(dá)載體的高效率的前提下，利用分子伴侶能夠幫助蛋白質(zhì)正確裝配的特性，避免多肽鏈在胞內(nèi)細(xì)胞周質(zhì)錯誤折疊或聚集成包涵體，使新生肽保持輸出天然活性的構(gòu)象，同時，串聯(lián)的第二信號肽，加強(qiáng)目的蛋白的導(dǎo)引，更有利于其的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。最后，在轉(zhuǎn)運(yùn)完成后，伴體蛋白和信號肽序列可以在周質(zhì)中被切除，從而直接獲得所需要的外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明的原核分泌表達(dá)載體，含有一種特定的核苷酸片斷，該核苷酸片斷由啟動子和雙信號肽-伴體蛋白的復(fù)合裝置構(gòu)成。
雙信號肽-伴體蛋白的復(fù)合裝置的結(jié)構(gòu)如下5’(啟動子)信號肽序列-伴體蛋白-信號肽序列-多克隆位點(diǎn)3’所述信號肽序列為gene III。Gene II編碼pIII蛋白，一種來源于纖維狀噬菌體的外殼蛋白。pIII是由18個氨基酸組成N段信號序列，可以定位原核表達(dá)系統(tǒng)將重組蛋白引導(dǎo)到周質(zhì)空間(Boeke and Model，1982；Boeke et al.，1982；Davis et al.，1985；Rapoza and Webster，1993)。
所述伴體蛋白是大腸桿菌硫氧化還原蛋白(thioredoxin，Trx)。Trx是12kDa的小蛋白，構(gòu)象嚴(yán)密，熱穩(wěn)定性好，在胞內(nèi)可協(xié)助蛋白正確折疊，其保守序列(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys)中有兩個半胱氨酸殘基，可作為氫供體還原其他蛋白中的二硫鍵，調(diào)節(jié)靶蛋白巰基的狀態(tài)。Trx含量可占細(xì)菌總蛋白的40％而不被細(xì)菌蛋白酶降解，十分有利于驅(qū)動二硫鍵形成。二硫鍵對蛋白的可溶性起到重要的作用。需要注意的是，對于分泌表達(dá)而言，引導(dǎo)端是必須的，但并不足以使之運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)中。E.coli中蛋白跨膜運(yùn)輸?shù)脑砟壳吧胁煌耆宄?。然而，一個明顯的因素是空間運(yùn)輸取決于目的蛋白的成熟結(jié)構(gòu)域，它可被負(fù)責(zé)輸出的蛋白伴侶SecB所識別(Wickner et al，1991)。由此可見，一個分子內(nèi)伴侶Trx的存在可能同時增強(qiáng)了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的效率。
所述的啟動子可以是araBAD啟動子(包括araC元件)，也可以是其它啟動子如T7或T71ac等。
5’(araBAD啟動子)geneIII-Trx-gene III-多克隆位點(diǎn)3’的雙gene III-Trx復(fù)合裝置的分泌表達(dá)質(zhì)粒pGTG。該質(zhì)粒的分泌表達(dá)系統(tǒng)同時具有信號肽和分子內(nèi)伴侶的特征。3’端gene III編碼蛋白作為新生肽N段序列協(xié)助多肽鏈定位到膜上受體，Trx防止胞內(nèi)的錯誤折疊并幫助細(xì)胞質(zhì)內(nèi)二硫鍵的形成。當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)完成后，5’端gene III編碼蛋白被宿主菌信號肽酶切除，從而脫離外源蛋白。通過優(yōu)化多克隆位點(diǎn)與內(nèi)切酶的選擇，可使雙gene III-Trx復(fù)合裝置與外源基因之間的連接序列減到最低。
上述核苷酸片斷的核苷酸序列如下 ATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCACCATGGATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGTCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCAAGCTTCCCGGGGGGCCCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAG
CCATAGCACCATGGAGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA本發(fā)明的原核分泌表達(dá)載體還含有高拷貝復(fù)制原點(diǎn)，如pUC復(fù)制原點(diǎn)。
將rhEGF編碼基因插入到質(zhì)粒pGTG的多克隆位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化E.coli并誘導(dǎo)表達(dá)，便可實現(xiàn)rhEGF的高效分泌表達(dá)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明結(jié)合了融合表達(dá)和分泌表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，同時具備高表達(dá)效率、產(chǎn)物高正確折疊率、高水溶性、純化簡易的特征，免去了以往復(fù)性、切割等繁瑣步驟，一步獲得重組蛋白。該方法大大提高了重組蛋白或多肽表達(dá)的效率，降低了成本，尤其適用于如rhEGF等富含二硫鍵、水溶性較差的異源多肽和蛋白活性物質(zhì)的生產(chǎn)。


圖1為gene III-Trx復(fù)合裝置和多克隆位點(diǎn)的序列圖；圖2為融合表達(dá)載體pGTG的構(gòu)建示意圖；圖3為TOP10/pGTG-rhEGF的重組蛋白rhEGF表達(dá)的SDS-PAGE分析圖。
其中，圖3中，1為分子量標(biāo)準(zhǔn)；2為IPTG誘導(dǎo)空載體pET 32a；3為未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒；4為經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒。
具體實施例方式
實施例1 含雙gene III-Trx復(fù)合裝置的重組質(zhì)粒pGTG的構(gòu)建1、大腸桿菌Trx基因的PCR擴(kuò)增合成如下一對引物(SEQ ID NO2)(1)5’-CATGCCATGGATATGAGCGATAAAAATTATTCACCTGAC-3’
(2)5’-CCCCCGGGGGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3’以E.coli K12基因組為模版擴(kuò)增Trx基因。為方便克隆，在5’端引入NcoI酶切位點(diǎn)，在3’端引入XmaI酶切位點(diǎn)。
2、gene III信號肽的PCR擴(kuò)增合成如下一對引物(SEQ ID NO3)(1)5’-CCCCCCGGGATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTG-3’(2)5’-CATGCCATGGTGCTATGGCTATAGAACGGCACCACCAGCGGAAT-3’利用PCR技術(shù)擴(kuò)增gene III信號肽。為方便克隆，在5’端引入XmaI酶切位點(diǎn)，在3’端引入NcoI酶切位點(diǎn)。以上PCR反應(yīng)參照Sambook方法進(jìn)行。(Sambook，et al.1989.Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold springHarbor Laboratory Press.USA)3、雙gene III-Trx復(fù)合裝置的組裝經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的Trx基因和gene III信號肽通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，用NcoI和XmaI雙酶切，得到具有3’端XmaI粘端的Trx基因和具有5’端XmaI粘端的gene III信號肽基因。使用T4 DNA連接酶將二者同時插入到pBAD/gIII A(購自Invitrogen Corp.)的NcoI酶切位點(diǎn)，得到含雙重geneIII-Trx復(fù)合裝置的重組質(zhì)粒pGTG。gene III-Trx復(fù)合裝置和多克隆位點(diǎn)的序列結(jié)構(gòu)如圖1，融合表達(dá)載體pGTG的構(gòu)建如圖2。
實施例2 重組人表皮生長因子分泌表達(dá)載體pBAD-GTG-rhEGF的構(gòu)建與rhEGF的分泌表達(dá)1、設(shè)計四對引物，通過全基因合成，得到重組人表皮生長因子(rhEGF)編碼基因，將rhEGF基因插入pGTG的多克隆酶切位點(diǎn)中，得到重組人表皮生長因子分泌表達(dá)載體pGTG-rhEGF。
2、將分泌表達(dá)質(zhì)粒pGTG-rhEGF轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coli TOP10，篩選陽性克隆，接種20ml含Amp的培養(yǎng)液，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，把過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100接種于1L LB培養(yǎng)液中，加50mg/ml的Amp(1μl/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)5-6h，至OD600＝0.5-0.6。加2ml，0.02ml的誘導(dǎo)劑果糖(1mg/ml)，37℃培養(yǎng)4h。將表達(dá)后菌體溶于高滲液(含20mmol/L Tris(pH8.0)，2.5mmol/LEDTA，20％蔗糖)，4℃放置15min后，9000rpm離心10min，吸去上清，加入與高滲液等體積的4℃預(yù)冷的低滲液混勻，冰上放置30min，13000rpm離心10min，上清液為滲透休克釋放的蛋白。采用改進(jìn)的SDS-PAGE方法，設(shè)制0.46mol/LTris-0.047mol/Lglycine(pH 9.5)+1.0g/LSDS連續(xù)緩沖體系，在分離膠T＝15％(C＝3％)和濃縮膠T＝4％(C＝3％)時，分析目的蛋白表達(dá)部位和溶解性，結(jié)果見圖3，說明TOP10/pGTG-rhEGF的重組蛋白rhEGF表達(dá)能被信號肽引導(dǎo)而分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，絕大部分以水溶性的目的蛋白存在。
3、表達(dá)和純化后rhEGF的生物活性檢測純化后rhEGF可通過MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)微量酶反應(yīng)比色法測定其細(xì)胞增值活性。取生長旺盛的人結(jié)腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞用0.03％胰酶消化制細(xì)胞懸液，以含10％胎牛血清DEME/F12培養(yǎng)液稀釋成1×105個/ml，以每孔100μl加入96孔培養(yǎng)板。37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時，吸棄上清培養(yǎng)液，加入無血清的DEME/F12，培養(yǎng)24小時。每孔加入不同濃度并已經(jīng)millipole過濾除菌的rhEGF(終濃度為7，70，700，7000ng/ml)，每一濃度設(shè)三個復(fù)孔，并設(shè)對照孔(未加藥物)和空白孔(未加細(xì)胞)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，每孔加MTT(1mg/ml)100μl，37℃反應(yīng)4小時后經(jīng)板式離心，棄去培養(yǎng)液及未反應(yīng)MTT，每孔加入100μl二甲亞砜，反應(yīng)30分鐘后，測每孔570nm波長處A值(吸光度)。增殖促進(jìn)效果＝(添加因子組/未添加因子組)×100％。統(tǒng)計分析采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明rhEGF濃度為700～7000ng/ml對T84上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，與對照組相比，均有顯著的增殖作用，其中濃度為700ng/ml具有最大促增殖效果，見表1。
表1 不同濃度rhEGF對人結(jié)腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞增殖的作用

*P＜0.05，**P＜0.01
一種原核分泌表達(dá)載體及其應(yīng)用序列表SEQUENCE LISTING<110>中山大學(xué)<120>一種原核分泌表達(dá)載體及其應(yīng)用<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>519<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaaaaaac tgctgttcgc gattccgctg gtggtgccgt tctatagcca tagcaccatg 60gatgagcgat aaaattattc acctgactga cgacagtttt gacacggatg tactcaaagc120ggacggggcg atcctcgtcg atttctgggc agagtggtgc ggtccgtgca aaatgatcgc180cccgattctg gatgaaatcg ctgacgaata tcagggcaaa ctgaccgttg caaaactgaa240catcgatcaa aaccctggca ctgcgccgaa atatggcatc cgtggtatcc cgactctgct300gctgttcaaa aacggtgaag tggcgtcggc aaccaaagtg ggtgcactgt ctaaaggtca360gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc caagcttccc ggggggccca tgaaaaaact420gctgttcgcg attccgctgg tggtgccgtt ctatagccat agcaccatgg agctcgagat480ctgcagctgg taccatatgg gaattcgaag ctttctaga 519<210>2<211>
<212>DNA<213>引物<400>25’-CATGCCATGGATATGAGCGATAAAAATTATTCACCTGAC-3’5’-CCCCCGGGGGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3’<210>3<211>
<212>DNA<213>引物<400>35’-CCCCCCGGGATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTG-3’5’-CATGCCATGGTGCTATGGCTATAGAACGGCACCACCAGCGGAAT-3’
權(quán)利要求
1.一種原核分泌表達(dá)載體，其特征在于含有一種特定的核苷酸片斷，該核苷酸片斷由啟動子和雙信號肽-伴體蛋白的復(fù)合裝置構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的原核分泌表達(dá)載體，其特征在于所述雙信號肽-伴體蛋白的復(fù)合裝置的結(jié)構(gòu)如下所示5′信號肽序列-伴體蛋白-信號肽序列-多克隆位點(diǎn)3′。
3.如權(quán)利要求1所述的原核分泌表達(dá)載體，其特征在于所述啟動子是araBAD啟動子、T7啟動子或T7lac啟動子。
4.如權(quán)利要求2所述的原核分泌表達(dá)載體，其特征在于所述信號肽是geneIII序列。
5.如權(quán)利要求2所述的原核分泌表達(dá)載體，其特征在于所述伴體蛋白是硫氧化還原蛋白。
6.如權(quán)利要求1所述的原核分泌表達(dá)載體，其特征在于所述核苷酸片斷的核苷酸序列如下所示 ATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCACCATGGATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGTCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCAAGCTTCCCGGGGGGCCCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCACCATGGAGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA
7.如權(quán)利要求1所述的原核分泌表達(dá)載體，其特征在于還包括高拷貝復(fù)制原點(diǎn)。
8.如權(quán)利要求7所述的原核分泌表達(dá)載體，其特征在于所述高拷貝復(fù)制原點(diǎn)為pUC復(fù)制原點(diǎn)。
9.權(quán)利要求1所述原核分泌表達(dá)載體在表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述外源基因是指重組人表皮生長因子編碼基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種原核分泌表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明的原核分泌表達(dá)載體含有雙信號肽－伴體蛋白的復(fù)合裝置，araBAD強(qiáng)啟動子和pUC高拷貝復(fù)制原點(diǎn)。利用兩個gene III信號肽序列和一個硫氧化還原蛋白序列，該載體能供在高效表達(dá)外源基因的同時有效提高表達(dá)產(chǎn)物的正確折疊率和水溶性，一步即可得到具生物活性的單體蛋白。本發(fā)明適用于重組蛋白的大量生產(chǎn)，對表達(dá)二硫鍵多、水溶性差的活性蛋白尤其適用。
文檔編號C12N15/63GK1908175SQ20061003714
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月22日
發(fā)明者張擎, 洪明晃, 張文澤, 賴文珊, 羅東華, 胡質(zhì)毅, 謝駿, 陳 峰, 王倩倩, 王平 申請人:中山大學(xué)