專利名稱：一種治療或預(yù)防老年性癡呆的抗體及其表達(dá)載體和在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種治療或預(yù)防老年性癡呆的抗體，本發(fā)明還涉及該抗體的表達(dá)載體和它們在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年性癡呆，又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)退行性疾患，是老年期癡呆最常見的形式之一。AD患者主要表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知障礙和空間辨別能力缺失，在疾病晚期甚至出現(xiàn)運動和感覺功能障礙、癲癇發(fā)作等癥狀。目前全世界AD發(fā)病人數(shù)高達(dá)1200萬，并呈現(xiàn)逐年增長的態(tài)勢。目前在臨床上治療AD的方法主要有五種一是保護(hù)神經(jīng)使之免受損傷，二是應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑防止因腦內(nèi)核團(tuán)細(xì)胞障礙所引起的乙酰膽堿的缺失，三是非藥物干預(yù)和精神藥物的應(yīng)用以改善行為障礙，四是保健活動，五是對病人的關(guān)懷。然而所有這些方法均為改善病人癥狀，并非對因治療。
典型的AD病理標(biāo)志為大量的老年斑沉積于腦內(nèi)。這種老年斑的主要成分是β-淀粉樣多肽(Aβ)，由40～42個氨基酸組成，系β淀粉樣前體蛋白(APP)的酶解產(chǎn)物，其中以Aβ42更具細(xì)胞毒性。當(dāng)前認(rèn)為，Aβ的形成和積聚在AD發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。Aβ生成和沉積后，可繼發(fā)性引起神經(jīng)纖維纏結(jié)的生成、氧化和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、谷氨酸源性興奮毒性、炎癥反應(yīng)以及激活凋亡性細(xì)胞死亡的級聯(lián)反應(yīng)。所有這些繼發(fā)性反應(yīng)，進(jìn)一步放大了Aβ的毒性作用，因此也成為抗AD病因?qū)W療法的潛在靶點。但是顯而易見，治療AD真正有效的靶標(biāo)應(yīng)為降低腦內(nèi)的Aβ。
1999年，美國Elan公司的Schenk等人率先報告，向AD模型小鼠體內(nèi)直接注入Aβ1-42，可減少血漿β淀粉樣蛋白水平，抑制Aβ沉積在已有的斑塊上，清除腦內(nèi)的老年斑塊。以后又陸續(xù)有報告證實，用可溶性Aβ免疫小鼠后不僅能減輕中樞淀粉樣蛋白負(fù)荷，同時還有改善認(rèn)知的作用。Elan公司迅速開發(fā)了新型疫苗AN-1792，應(yīng)用于AD造型動物，效果顯著，并開始臨床實驗。但在II期臨床實驗中，6％的患者出現(xiàn)了嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)無菌性炎癥，AD疫苗治療試驗被迫終止。尸檢證實疫苗治療所致的無菌性腦膜腦炎主是由T細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)結(jié)果。
一般認(rèn)為Aβ接種機體后的治療作用主要通過抗體的橋梁作用予以實現(xiàn)外源性Aβ可刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，后者與Aβ結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，并通過單核-巨噬細(xì)胞Fc受體進(jìn)入細(xì)胞，使Aβ得到降解。既然如此，能否不注射Aβ、而向機體輸入Aβ抗體以達(dá)到同樣的治療效果？自2000年以來，先后有數(shù)個研究小組用抗Aβ抗體注射過度表達(dá)APP的轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)能明顯減輕Aβ負(fù)荷，使腦內(nèi)的淀粉樣蛋白斑塊得到清除，而且無論是外周靜脈注射或者腹膜內(nèi)注射都能收到明顯效果。
然而已有的報告多用鼠源性單抗，對人體來說是一種異種蛋白，能夠引起人的機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)，這在很大程度上限制了其在人體中的應(yīng)用。因為HAMA不僅可以使抗體的效價降低，增加鼠源性單抗的清除率，影響其治療效果，更嚴(yán)重的是可以引起變態(tài)反應(yīng)，威脅患者的生命安全。
近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程方法為抗體的制備研究開辟了一個全新的領(lǐng)域，這就是基因工程抗體。建立在PCR技術(shù)和噬菌體表面呈現(xiàn)(phage display)技術(shù)基礎(chǔ)上的噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)則可稱基因工程抗體領(lǐng)域的革命性進(jìn)展，該技術(shù)用細(xì)菌克隆取代B細(xì)胞克隆表達(dá)抗體，不經(jīng)細(xì)胞融合，甚至不經(jīng)免疫，就能較為方便地制備針對任何抗原的人源性抗體分子。它使得高特異性、高親和性的人源性抗體的獲得成為可能。用這種方法獲得的抗體分子為人源性的抗體，可直接用于人體治療，減少可能產(chǎn)生的毒副作用；同時又因其分子量較小，易于穿透各種生物屏障(如血腦屏障)，能夠到達(dá)病變部位直接發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療或預(yù)防老年性癡呆的抗體。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述抗體的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供該抗體、編碼該抗體的核苷酸及它們的表達(dá)載體在制藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明選擇Aβ作為靶標(biāo)，應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)，篩選得到抗Aβ的特異性噬菌體抗體，并表達(dá)獲得可溶性scFv抗體片斷，并用Western blot的方法鑒定其抗體活性，體外鑒定其生物活性和細(xì)胞保護(hù)作用。篩選獲得的抗Aβ抗體及其基因片段和表達(dá)載體，可用于制備免疫治療或預(yù)防老年性癡呆的新藥物。
本發(fā)明的目的是通過下列措施實現(xiàn)的一種治療或預(yù)防老年性癡呆的抗體，該抗體的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。
所述的抗體為單克隆抗體。
所述的抗體為可溶性scFv抗體片斷。
所述的抗體的表達(dá)載體，包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、大腸桿菌。
編碼上述所述抗體的核苷酸，其序列如SEQ ID No.1所述。
所述的核苷酸的表達(dá)載體，包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、大腸桿菌。
所述的抗體在制備治療或預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
所述的核苷酸在制備治療或預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
所述的表達(dá)載體在制備治療或預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過噬菌體抗體庫技術(shù)，篩選得到一個新型的抗β-淀粉樣多肽(Aβ)的人源性單鏈抗體(氨基酸序列如SEQ ID NO.2)。該抗體可以抑制和解除β-淀粉樣多肽的聚集，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。該抗體可作為老年性癡呆的一種治療性抗體，用于制備治療老年性癡呆的藥物。編碼該抗體的核苷酸以及它們的表達(dá)載體也可用于制備治療老年性癡呆的藥物。


圖1是單克隆噬菌體展示抗體的ELISA檢測結(jié)果。
圖2是本發(fā)明抗Aβ可溶性單鏈抗體SDS-PAGE結(jié)果。
其中M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)液上清和周質(zhì)腔提取物；2經(jīng)His-Trap親和層析的純化蛋白成分。
圖3是本發(fā)明抗Aβ可溶性單鏈抗體Western blot結(jié)果。
圖4是本發(fā)明抗Aβ可溶性單鏈抗體對Aβ聚集影響的電鏡照片。
其中A，B20μM的Aβ40在37℃孵育2周；C，D20μM E3單鏈抗體與20μMAβ40共同在37℃孵育2周；E，F(xiàn)20μM BSA與20μM Aβ40共同在37℃孵育2周。Bar(A，C，E)＝500nm，Bar(B，D，F(xiàn))＝100nm。
圖5是ThT熒光定量測定本發(fā)明抗Aβ可溶性單鏈抗體對Aβ聚集影響。
其中*P＜0.05，與各時間點的對照組熒光值比較；**P＜0.01，與各時間點的對照組熒光值比較。
圖6是本發(fā)明抗Aβ可溶性單鏈抗體解聚Aβ纖維的電鏡照片。
其中A成熟的Aβ40聚集纖維；B，C20μM Aβ40纖維單獨繼續(xù)37℃孵育10天；D.20μMBSA與20μM Aβ40纖維共同在37℃孵育10天；E，F(xiàn)20μM E3單鏈抗體與20μMAβ40纖維共同在37℃孵育10天。Bar(A，B，D，E)＝500nm，Bar(C，F(xiàn))＝1μm。
圖7是MTT測定不同濃度抗Aβ可溶性單鏈抗體條件下Aβ的細(xì)胞毒性作用其中*P＜0.05，與對照組相比；ΔP＜0.05，與Aβ20μM處理組相比。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實施例1制備方法及鑒定實驗(一)、人噬菌體抗體庫的擴(kuò)增1、將Griffin.1噬菌體展示人源性單鏈抗體庫(約1×1010克隆)接種到500ml2×TY-AMP-GLU培養(yǎng)基，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5(約1.5-2h)。
2、從中取25ml培養(yǎng)液(約1×1010個細(xì)菌)，用M13K07輔助噬菌體超感染。感染比例為1∶20(細(xì)菌數(shù)輔助噬菌體數(shù))。于37℃水浴中，靜置30min。
3、3300g，4℃離心10min，用30ml 2×TY-AMP-KAN培養(yǎng)基重懸沉淀。
4、將菌液添加到470ml預(yù)溫的2×TY-AMP-KAN培養(yǎng)基中，30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
5、10800g，4℃離心10min，棄沉淀。
6、收集上清，加入1/5上清體積的PEG/NaCl(20％聚乙二醇-2.5M NaCl，下同)溶液，徹底混合后4℃靜置1h或更長時間以沉淀噬菌體。
7、3300g，4℃離心30min，沉淀物重懸于40ml ddH2O和8ml PEG/NaCl溶液中。徹底混合后4℃靜置20min或更長時間。
8、3300g，4℃離心10min，吸棄上清。
9、簡單離心，吸除剩余的PEG/NaCl。
10、沉淀物用5ml PBS重懸，分裝到Eppendorf管(簡稱Ep管)中。
11、11600g，4℃離心10min，棄細(xì)菌碎片及雜質(zhì)，上清轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中。
12、噬菌體上清短期可保存于4℃。如需長期貯存，則加甘油至終濃度為15％，存于-70℃。
噬菌體滴度測定1、取1μl噬菌體上清加入1ml的PBS中(1∶103)2、取1μl轉(zhuǎn)化1ml指數(shù)生長期*(OD600約0.4-0.6)的E.coli TGl，37℃水浴30min(1∶106)3、取10μl加入990μl的2×TY培養(yǎng)基中(1∶108)4、取10μl加入990μ1的2×TY培養(yǎng)基中(1∶1010)5、取10μl加入990μl的2×TY培養(yǎng)基中(1∶1012)6、從1∶106、1∶108、1∶1010、1∶1012倍比稀釋的菌液中各取50μl，涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培養(yǎng)過夜。次日記數(shù)細(xì)菌克隆數(shù)以計算噬菌體滴度。
*噬菌體/噬菌粒(phage/phagemid)能夠感染性菌毛陽性(F+)的大腸桿菌，大腸桿菌必須在37℃培養(yǎng)至指數(shù)生長期(OD600約0.4-0.6)，這時細(xì)菌會產(chǎn)生性菌毛，從而具備較高的感染效率。在整個篩選以及鑒定的過程中，都需要制備這種狀態(tài)的大腸桿菌。
準(zhǔn)備步驟如下1、大腸桿菌劃M9平板，37℃培養(yǎng)至菌落可見。
2、從M9平板上挑單克隆，接種于5ml 2×TY培養(yǎng)基，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
3、次日，吸取過夜培養(yǎng)的菌液，以1∶100比例加入到新鮮的2×TY培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期(OD600約0.4-0.6)，可用于噬菌體的轉(zhuǎn)化。
4、感染前將菌液短時間置于冰上能夠增強感染效果，但如果超過30min，大腸桿菌的性菌毛就會丟失而不能被感染。
(二)、制備次級噬菌體抗體庫1、接(一)2步驟，剩余的475ml培養(yǎng)液繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)2h。
2、3300g，4℃離心30min，將細(xì)菌沉淀重懸于10ml 2×TY培養(yǎng)基中(含有15％的甘油)，分裝成10個Eppendorf管，每管1ml。
3、將次級噬菌體抗體庫保存于-70℃。再次使用前，用PCR的方法鑒定陽性克隆率及檢測噬菌體滴度。
(三)、篩選Aβ1-40(即由1-40位氨基酸組成的Aβ，簡稱Aβ40)特異性人源化抗體1、用戊二醛法包被抗原Aβ1-40(1)、用含有0.2％戊二醛(V/V)的100mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 5.0)處理Nunc免疫管4h。
(2)、用上述緩沖液洗滌Nunc管2次。
(3)、加入4ml用100mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)溶解的Aβ1-40(20μg/ml)，37℃反應(yīng)3h。
(4)、用0.9％NaCl溶液洗滌2次。
(5)、在Nunc管中加滿含2％脫脂奶粉的PBS(MPBS)，37℃封閉2h。
(6)、PBS洗滌3次。
2、篩選特異性人源性單克隆抗體(1)、每輪篩選在Nunc管中加入約1012t.u.(轉(zhuǎn)染后菌落形成單位)的噬菌體到4ml2％MPBS中。
(2)、將Nunc管置于旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤上，室溫下持續(xù)翻轉(zhuǎn)30min，再豎直放置，室溫下至少90min。棄上清中未結(jié)合的噬菌體。
(3)、第1輪篩選用PBS-T(含0.1％Tween-20)洗滌Nunc管10次，再用PBS洗滌10次。第2輪及以后每輪篩選均用PBS-T洗滌Nunc管20次，再用PBS洗滌20次。
(4)、加入1ml 100mmol/L的三乙胺，將Nunc管置于旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤上持續(xù)翻轉(zhuǎn)30min以洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。第2輪及以后每輪篩選中，先加入1ml 100mmol/L的三乙胺預(yù)洗脫10min，棄預(yù)洗脫液，加入新的1ml 100mmol/L的三乙胺洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。
(5)、洗脫過程中，在Ep管中預(yù)先準(zhǔn)備0.5ml 1.0mol/L的Tris-HCl(pH7.4)，用以快速中和洗脫的特異噬菌體。中和后的噬菌體短期可保存于4℃或用于轉(zhuǎn)染E.coli TG1。
(6)、取0.75ml洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)染4.25ml指數(shù)生長期的E.coli TG1，37℃水浴靜置30min。
(7)、取100μl倍比稀釋測定噬菌體的滴度取100μl加入900μl的2×TY培養(yǎng)基中(1∶10)取100μl加入900μl的2×TY培養(yǎng)基中(1∶102)取100μl加入900μl的2×TY培養(yǎng)基中(1∶103)
取100μl加入900μl的2×TY培養(yǎng)基中(1∶104)從1∶10、1∶102、1∶103、1∶104倍比稀釋的菌液中各取50μl，涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培養(yǎng)過夜。次日記數(shù)細(xì)菌克隆數(shù)以計算噬菌體滴度。
(8)、剩余感染的細(xì)菌3300g，4℃離心10min，用500μl 2×TY培養(yǎng)基重懸細(xì)菌沉淀。
(9)、將500μl菌液全部涂TYE-AMP-GLU平板數(shù)塊，30℃培養(yǎng)過夜或至菌落可見。
(10)、平板上加5-6ml 2×TY(含15％甘油)，用玻璃分選器輕刮下所有菌落，混勻。
(11)、從中取100μl加入100ml 2×TY-AMP-GLU，檢測其OD600≤0.1。剩余菌液可存于-70℃。
(12)、37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5(約2h)。
(13)、從中取10ml，用M13K07輔助噬菌體超感染。感染比例為1∶20(細(xì)菌數(shù)∶輔助噬菌體數(shù))。37℃水浴30min。
(14)、3300g，4℃離心10min，沉淀用50ml 2×TY-AMP-KAN培養(yǎng)基重懸。30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(15)、10800g，4℃離心菌液10min，棄沉淀。
(16)、收集上清，加入1/5體積的PEG/NaCl，冰徹底混合后4℃靜置1h以上。
(17)、10800g，4℃離心30min，沉淀重懸于40ml ddH2O和8ml PEG/NaCl溶液中。徹底混合后4℃靜置20min或更長時間。
(18)10800g，4℃離心10min，吸棄上清，簡單離心，吸除剩余的PEG/NaCl。
(19)、沉淀用2ml PBS重懸，分裝到2個Ep管中。11600g離心10min，棄細(xì)菌碎片及雜質(zhì)，上清轉(zhuǎn)移至新的Ep管中。其中1ml可保存于4℃。另1ml可用于下一輪篩選。
(20)、重復(fù)以上篩選步驟，共進(jìn)行五輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選。
(四)、單克隆噬菌體展示抗體的ELISA鑒定1、單克隆噬菌體抗體的制備(1)、用第5輪篩選中洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)染指數(shù)生長期的E.coli TG1，涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培養(yǎng)過夜。
(2)、取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100μl 2×TY-AMP-GLU。從過夜培養(yǎng)的平板上隨機挑選58個菌落接種到96孔板中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(3)、取另一96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200μl 2×TY-AMP-GLU，從第1塊板各孔中分別轉(zhuǎn)移5μl至第2塊板。37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)1h。板1可在每孔中加甘油至終濃度15％，-70℃凍存。
(4)、再在每孔中加入25μl 2×TY-AMP-GLU，其中含有1×109pfu的M13K07輔助噬菌體進(jìn)行超感染。
(5)、37℃靜置30min，繼續(xù)37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)1h。
(6)、1800g離心10min，吸除上清。
(7)、每孔中的沉淀分別用200μl 2×TY-AMP-KAN重懸，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(8)、1800g離心10min，取上清用于ELISA檢測。
ELISA檢測(1)、用含0.2％戊二醛(V/V)的100mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 5.0)處理ELISA反應(yīng)板4h。
(2)、用上述緩沖液洗滌ELISA反應(yīng)板2次。
(3)、每孔中加入100μl 20μg/ml的用100mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)溶解的Aβ1-40，對照組每孔中加入相同緩沖液溶解的，等濃度的BSA，37℃反應(yīng)3h。
(4)、用0.9％NaCl溶液洗滌2次。
(5)、每孔中加滿含2％MPBS，37℃封閉2h。
(6)、PBS洗滌3次。
(7)、每孔中分別加入20μl單克隆噬菌體上清，室溫下反應(yīng)3小時。
(8)、用含0.05％Tween-20的PBS-T清洗3次。
(9)、每孔中加入1∶4000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13抗體100μl，室溫下反應(yīng)3小時。
(10)PBS-T清洗3次。
(11)、每孔中加入100μl的TMB底物液，室溫下反應(yīng)10min。
(12)顯色清晰后每孔加入50μl 1mol/L的硫酸終止反應(yīng)。
(13)、測定每孔450nm的吸光值(A450)，陰性對照組用M13K07輔助噬菌體代替噬菌體抗體克隆。
(五)、噬菌體抗體DNA序列鑒定1、pHEN2噬菌粒的提取和純化參照大連寶生物公司質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒說明書操作。
2、1％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定質(zhì)粒抽提效果。
3、PCR反應(yīng)。
引物上游LMB35’-CAG GAA ABA GCT ATG AC-3’(SEQ ID No.3)下游Fd seql5’-GAA TTT TCT GTA TGA ACC-3’(SEQ ID No.4)反應(yīng)體系10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl25mmol/L MgCl21.5μl2mmol/L dNTPs1.5μl上游引物(10μM) 0.5μl下游引物(10μM) 0.5μl模板DNA 1μlTaq酶0.2μlddH2O 13μl總體積 20μl反應(yīng)條件 4、1％瓊脂糖凝膠電泳。
5、出現(xiàn)750bp左右條帶的陽性克隆，噬菌粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測定序列。
(六)、抗Ap可溶性ScFv的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
1、單克隆噬菌體轉(zhuǎn)化E.coli HB2151(1)、根據(jù)以上的鑒定結(jié)果，選擇陽性克隆，用前述的方法對單克隆噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，PEG/NaCl聚集。
(2)、用聚集的單克隆噬菌粒轉(zhuǎn)化指數(shù)增長期的E.coli HB2151后涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培養(yǎng)過夜。
2、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)抗Aβ可溶性scFv(1)、單克隆細(xì)菌(即步驟1制備的單克隆噬菌體轉(zhuǎn)化E.coli HB2151)接種于5ml2×TY-AMP-GLU培養(yǎng)基，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(2)、從中吸取200μl接種于20ml 2×TY-AMP-GLU培養(yǎng)基，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5(約2h)。
(3)、從中吸取10ml接種于1000ml 2×TY-AMP-GLU培養(yǎng)基，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.9(約3h)。
(4)、達(dá)到需要的OD值時，4℃，4500rpm，離心15min，棄培養(yǎng)液，細(xì)菌沉淀用等體積的新鮮2×TY-AMP培養(yǎng)液重懸。并加入IPTG至終濃度0.1mmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
(5)、20℃，220rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16-24h。
(6)、4500rpm，4℃離心30min，分別收集上清和細(xì)菌沉淀。
3、培養(yǎng)液組分蛋白濃縮(1)、將盛有1000ml培養(yǎng)液上清的燒杯置于冰上。邊規(guī)則溫和攪拌，邊徐徐加入561g硫酸銨，該步驟應(yīng)在5～10min內(nèi)完成；(2)、冰上繼續(xù)攪拌30min。
(3)、4500rpm，4℃離心30min。
(4)、棄上清，沉淀懸浮于1-2倍沉淀物體積的PBS中，殘留的不溶性物質(zhì)可能是變性蛋白，通過離心除去，得培養(yǎng)液上清組分。
4、細(xì)菌周質(zhì)組分提取(1)、重溶細(xì)菌沉淀(由步驟2(6)產(chǎn)生)于50ml 30mM Tris-HCl pH8.0 20％的蔗糖中。加入100μl 0.5M EDTA pH8.0(終濃度為1mM)。加入磁力攪拌棒，室溫下緩慢攪拌10min。
(2)、10000g 4℃離心10min收集細(xì)胞，去除上清液。
(3)、再50ml的冰凍的5mM的MgSO4徹底重溶沉淀，在冰上緩慢攪拌懸液10min。此時周質(zhì)蛋白被釋放入緩沖液中。
(4)、10000g 4℃離心10min，收集上清液(周質(zhì)部分)。
5、His-Trap親和層析柱純化抗AβscFv可溶性抗體(為表述方便，命名為E3scFv或E3單鏈抗體)參照His-Trap親和層析柱說明書操作。
(1)、將提取濃縮后的培養(yǎng)液上清組分和細(xì)胞周質(zhì)組分用結(jié)合緩沖液透析過夜。用0.45μm濾膜除菌，防止堵塞親和層析柱。
(2)、5ml去離子水加入親和層析柱。
(3)、0.5ml 0.1mol/L硫酸鎳注入柱中。
(4)、5ml去離子水洗親和層析柱。
(5)、10ml結(jié)合緩沖液平衡層析柱。
(6)、步驟(1)中的過濾樣品加入親和層析柱。流速為1ml/min。
(7)、10ml結(jié)合緩沖液加入親和層析柱，洗去非特異性結(jié)合蛋白。
(8)、含100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑的洗脫液各1ml，依次加入親和層析柱，洗去特異性結(jié)合的蛋白，500μl/管分段收集洗脫液。
(9)、10ml結(jié)合緩沖液加入親和層析柱。
(10)、5ml含0.05M EDTA的結(jié)合緩沖液加入層析柱，去除鎳離子。
(11)、10ml去離子水洗親和層析柱。
(12)5ml 20％乙醇加入親和層析柱，密封層析柱，4度保存。
6、SDS-PAGE初步鑒定抗Aβ可溶性抗體。
(1)凝膠配制

(2)、取方法5(8)各管洗脫液10μl+2×上樣緩沖液10μl混勻，沸水浴5min。
(3)、上樣，75V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠，110V恒壓電泳至溴酚藍(lán)完全消失。
(4)、考馬斯亮藍(lán)R250染色30min。
(5)、脫色液脫色至底色透明，觀察純化效果。
7、透析脫鹽。
(七)、可溶性ScFv抗體的Western blot鑒定1、Tricine SDS-PAGE電泳(1)、凝膠配方

(2)、取10μl樣品液和10μl 2×加樣緩沖液混勻，煮沸變性，1000rpm離心1min。每加樣孔中加入樣品蛋白(Aβ1-42或BSA)的量均為20μg。
(3)、拔去梳子，將板置于電泳槽中，加滿Tricine電泳緩沖液，依次上樣。100V恒壓電泳90min。
2、轉(zhuǎn)膜(1)、電泳完畢后，切去濃縮膠，將膠浸于蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10-20min，同時準(zhǔn)備一塊合適大小的PVDF膜。
(2)正確安放電轉(zhuǎn)盒，加入適量的蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，0.3A，55min。
(3)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜從電轉(zhuǎn)盒中取出，標(biāo)記方向，用PBS簡單洗滌。
3、封閉將膜浸于封閉液(MPBS)中，室溫孵育2小時，阻斷PVDF膜上的非特異性蛋白結(jié)合位點。
4、抗體孵育(1)、加1∶5稀釋的純化后的抗體上清，4℃搖動下過夜。
(2)、PBS-T洗膜5min×3次。
(3)、加抗c-myc抗體(1∶200稀釋)37℃孵育2h。
(4)、PBS-T洗膜5min×3次。去除多余的一抗反應(yīng)液和非特異性吸附的抗體。
(5)、加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶200稀釋)，37℃孵育2h。
(6)、PBS-T洗膜5min×3次。
5、ECL顯色臨用前將ECL顯色液A與B混合，均勻滴加在膜表面，避光曝片，顯影液、定影液中沖洗照片，觀察結(jié)果。
(八)、透射電子顯微鏡(TEM)觀測1、Aβ應(yīng)用液的準(zhǔn)備(1)、將Aβ多肽溶于1％的氫氧化鈉溶液中，配成濃度大于5mg/ml的Aβ儲存液。
(2)、BCA法蛋白定量工作液的配制取BCA蛋白定量檢測試劑盒(PIERCE公司)中的A液及B液，按1∶50(V/V)配制工作液。
將10μl稀釋的Aβ儲存液及0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml幾個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液分別加入酶標(biāo)板中，每孔加入工作液200μl，混勻，37℃溫育30min，CliniBio-128酶標(biāo)儀讀取波長562nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算Aβ儲存液濃度。
(3)、臨用前用包含0.02％NaN3的50mmol/L PBS稀釋，pH 7.5。Aβ0.5mg/ml，37℃連續(xù)孵育3天，可使其形成纖維聚集。
2、TEM觀測Aβ纖維(1)、實驗分組對照組Aβ20μM；scFv處理組Aβ20μM，E3scFv 20μM；BSA對照組Aβ20μM，BSA 20μM。
(2)、37℃靜置孵育2周。
(3)、孵育結(jié)束后，取10μl蛋白質(zhì)溶液滴到銅網(wǎng)的碳膜上，自然干燥。
(4)、2％(W/V)的醋酸鈾染色。
(5)、JEM-1010透射電子顯微鏡觀察，電鏡的工作電壓為100kY，放大率為15,000-50,000。
(九)、硫黃素T(ThT)熒光定量檢測1、實驗分組對照組Aβ20μM；E3(1∶1)組Aβ20μM，E3scFv 20μM；E3(1∶10)組Aβ20μM，E3scFv 2μM。
2、37℃孵育0、1、2周。
3、取25μl孵育后的樣品，與75μl 10μM ThT的稀釋液(溶于50mM PBS，pH6.5)混勻。(每組設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)立空白對照，即不含樣品的10μM ThT的稀釋液)。
4、37℃孵育10min，利用Spectra MAXGEMINI EM微板熒光定量儀測定熒光讀數(shù)。
(激發(fā)波長450nm，發(fā)射波長482nm)(十)、E3scFv(E3可溶性抗體)對SK-N-SH細(xì)胞Aβ毒性損傷的保護(hù)作用1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH Neuroblastoma cell)的培養(yǎng)SK-N-SH細(xì)胞接種于含10％小牛血清、100IU/ml慶大霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于飽和濕度、5％CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、細(xì)胞傳代和種板棄去培養(yǎng)液，以D-Hank’s液洗滌細(xì)胞2次，加0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合液覆蓋細(xì)胞表面，室溫作用2～3min，用倒置顯微鏡觀察見細(xì)胞收縮、邊緣清晰時，加入含10％小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中止胰酶活性，吹打瓶壁上的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml。100μl/孔種于96孔板中。置于飽和濕度、5％CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性測定在細(xì)胞接種24h后，換以含有15-30μM Aβ的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72h，然后加入5mg/ml MTT溶液10μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，加入DMSO 150μl/孔，輕輕震蕩10分鐘，溶解紫色結(jié)晶，在酶聯(lián)免疫測定儀上讀取波長490nm處吸光度，以此反映線粒體的呼吸功能。
4、E3可溶性抗體對SK-N-SH細(xì)胞Aβ毒性損傷的保護(hù)作用(1)、實驗分組及處理
對照組DMEM正常培養(yǎng)液；Aβ組含20μM Aβ的DMEM培養(yǎng)液；E3處理組含2-20μM E3scFv和20μM Aβ的DMEM培養(yǎng)液。
(2)、細(xì)胞接種24h后，根據(jù)上述分組換以不同的條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72h。
(3)、更換新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)液，加入5mg/ml MTT溶液10μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，加入DMSO 150μl/孔，輕輕震蕩10分鐘，溶解紫色結(jié)晶，在酶聯(lián)免疫測定儀上讀取波長490nm處吸光度，以此反映線粒體的呼吸功能。
結(jié)果(一)、篩選Aβ40特異性人源性抗體結(jié)果經(jīng)過五輪的親和篩選，隨機挑選58個克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)并收集噬菌體抗體，進(jìn)行ELISA檢測。檢測中，以M13K07輔助噬菌體代替噬菌體抗體作為陰性對照，消除噬菌體與Aβ多肽的非特異性結(jié)合。ELISA檢測結(jié)果見圖1。
(二)、噬菌體抗體的基因與蛋白質(zhì)序列E3單克隆噬菌體抗體經(jīng)基因測序儀測序獲得其具體的抗體基因片段，其中不含終止密碼子TAG、TAA、TGA。據(jù)此翻譯得知抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，利用NCBI(National Center for Biotechnology Information，www.ncbi.nlm.nih.gov)的免疫球蛋白BLAST數(shù)據(jù)庫比對得知該抗體的超變區(qū)和支架區(qū)氨基酸序列。如表1所示。
(三)、Western blot鑒定可溶性scFv抗體1、His-Trap親和層析柱純化抗Aβ可溶性單鏈抗體IPTG誘導(dǎo)2L E.coli HB2151表達(dá)可溶性抗體，取濃縮的培養(yǎng)液上清和周質(zhì)腔提取液，His-Trap親和層析，12％SDS-PAGE電泳，可見分子量約31kD的純化蛋白條帶，如圖2所示。
2、Western blot鑒定抗Aβ可溶性單鏈抗體Western blot檢測結(jié)果顯示，抗Aβ可溶性抗體可與合成的Aβ多肽結(jié)合，與BSA無交叉反應(yīng)。如圖3所示。
表1 E3單鏈抗體(E3 scFv)CDRs和FRs的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)與氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTQ V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C A V S GH-CDR1TACTCCATCAGCAGTGGTTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCY S I S S G Y Y W G W I R Q P P G K G L E W I G S IH-CDR2TATCATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGY H S G S T Y Y N P S L K S R V T I S V D T S K N QH-CDR3TTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAGATCTTGGTAGTTCTGTGF S L K L S S V T A A D T A V Y Y C A R D L G S S VLinkerAGTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGCAS W G Q G T L V T V S S G G G G S G G G G S G G S ACTTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGL D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I S C R ML-CDR1AGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCAS Q G I S N Y L A W Y Q Q K P G K V P K L L I Y A AL-CDR2TCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCS T L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S SL-CDR3CTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCTCGTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGL Q P E D V A T Y Y C Q K Y N S A L V T F G Q G T KCTGGAAATCAAACGTL E I K R(四)抗Aβ可溶性單鏈抗體對Aβ體外聚集的影響1、抗Aβ可溶性單鏈抗體抑制Aβ的聚集TEM觀測發(fā)現(xiàn)，20μM的Aβ40在37℃孵育2周，可聚集形成成熟的纖維。如圖4A，B所示，成熟的纖維可形成網(wǎng)狀。加入等摩爾濃度的E3單鏈抗體，與Aβ40共同在37℃孵育2周，可以明顯抑制Aβ40聚集形成纖維，Aβ40主要呈現(xiàn)無定形結(jié)構(gòu)，如圖4C，D。而加入等摩爾濃度BSA的對照組中，Aβ40依舊聚集形成成熟纖維，如圖4E，F(xiàn)。
ThT是一種熒光染料，它可以與淀粉樣物質(zhì)中交互的β-片層結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，可作為Aβ聚集的一個定量分析指標(biāo)。20μM的Aβ40經(jīng)過7-14天的37℃持續(xù)孵育，樣品的ThT熒光讀值明顯增高，如圖5所示。但與不同摩爾濃度的抗Aβ可溶性單鏈抗體共同孵育后，試驗組ThT熒光讀值明顯低于同時間點的對照組熒光值。如圖5所示。
2、抗Aβ可溶性單鏈抗體促Aβ成熟纖維解聚集20μM Aβ40聚集纖維與等摩爾濃度的抗Aβ可溶性單鏈抗體共同孵育1天后，Aβ纖維明顯減少。如圖6所示，相對于Aβ對照組和BSA處理組，E3單鏈抗體處理組的Aβ結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，視野中蛋白主要呈現(xiàn)無定形結(jié)構(gòu)，未見明顯的Aβ40聚集纖維。
(五)抗Aβ可溶性單鏈抗體抑制Aβ的細(xì)胞毒性作用MTT結(jié)果顯示，20μM聚集的Aβ蛋白可抑制SK-N-SH細(xì)胞的琥珀酸脫氫酶的活性，對細(xì)胞有明顯的毒性作用。而與抗Aβ可溶性單鏈抗體共同加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，Aβ蛋白對琥珀酸脫氫酶的活性抑制明顯減少。如圖7所示，抗Aβ可溶性單鏈抗體的毒性抑制作用呈明顯的濃度依賴性。
實施例2藥物組合物的制備將治療有效量的本發(fā)明抗體(SEQ ID No.2)或其表達(dá)載體(包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、大腸桿菌，下同)，或者編碼該抗體的核苷酸(SEQ ID No.1)或者其表達(dá)載體單獨或者相互混合后與藥學(xué)上允許的輔料組成藥物組合物，該藥物組合物可單獨使用，亦可與其他不影響該藥物組合物功能的藥物混合使用。這些藥物組合物的制劑可以是藥學(xué)上允許的任意劑型，包括但不限于片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、口服液或脂質(zhì)體。這些制劑的制備方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)。這些藥物組合物可以用于治療或預(yù)防老年性癡呆。
<110>南京醫(yī)科大學(xué)<120>一種治療或預(yù)防老年性癡呆的抗體及其表達(dá)載體和在制藥中的應(yīng)用<160>4<210>1<211>720<212>DNA<213>人工序列<400>
cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tct ggt tac tcc atc agc agt ggt 96Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30tac tac tgg ggc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp35 40 45att ggg agt atc tat cat agt ggg agc acc tac tac aac ccg tcc ctc 192Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu50 55 60aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc 240Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65 70 75 80ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tat tac tgt 288Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gca aga gat ctt ggt agt tct gtg agt tgg ggc caa ggt acc ctg gtc 336Ala Arg Asp Leu Gly Ser Ser Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110acc gtc tcg agt ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt 384Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125
agt gca ctt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca 432Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala130 135 140tct gta gga gac aga gtc acc atc agt tgt cgg atg agt cag ggc att 480Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser Gln Gly Ile145 150 155 160agc aat tat tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtt cct aag 528Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys165 170 175ctc ctg atc tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg 576Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg180 185 190ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc 624Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser195 200 205ctg cag cct gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa aag tat aac agt 672Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser210 215 220gcc ctc gtt acg ttc ggc caa ggg acc aag ctg gaa atc aaa cgt 720Ala Leu Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg225 230 235<210>2<211>239<212>PRT<213>人工序列<400>
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser65 70 75 80Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asp Leu Gly Ser Ser Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala130 135 140Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser Gln Gly Ile145 150 155 160Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys165 170 175Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg180 185 190Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser195 200 205Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser210 215 220Ala Leu Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg225 230 235<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>
caggaaabag ctatgac 17<210>4<211>18<212>DNA
<213>人工序列<400>
gaattttctg tatgaacc 18
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防老年性癡呆的抗體，該抗體的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于所述的抗體為單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于所述的抗體為可溶性scFv抗體片斷。
4.權(quán)利要求1所述的抗體的表達(dá)載體。
5.編碼權(quán)利要求1所述抗體的核苷酸，其序列如SEQ ID No.1所述。
6.權(quán)利要求5所述核苷酸的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體是質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、大腸桿菌。
8.權(quán)利要求1所述的抗體在制備治療或預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求5所述的核苷酸在制備治療或預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4或6所述的表達(dá)載體在制備治療或預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療或預(yù)防老年性癡呆的抗體及其表達(dá)載體和在制藥中的應(yīng)用。該抗體的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，編碼該抗體的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，該抗體是β－淀粉樣多肽的特異性抗體。該抗體、其核苷酸及表達(dá)載體可用于制備免疫治療或預(yù)防老年性癡呆的藥物。
文檔編號C12N15/13GK1803842SQ200610037930
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日
發(fā)明者陳琪, 樂珅, 李玥, 夏駿 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)