專利名稱：奶牛皮膚冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種質(zhì)資源保存、轉(zhuǎn)基因、低溫冷凍保存、組織工程等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核移植技術(shù)的誕生對轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)和滅絕品種的恢復(fù)以及資源保存帶來了新的希望。核移植技術(shù)需要兩個細胞體系的支持，一是來自受體卵巢組織的卵母細胞，另一是來自供體的胚胎干細胞或體細胞。目前科學(xué)家們已經(jīng)成功地能將活體采樣得來的胎兒和成年動物的體細胞在體外培養(yǎng)，而卵母細胞的獲得常常受到母畜繁殖周期的制約，在臨床上會出現(xiàn)供與需時間不相一致的矛盾。目前卵巢組織和體細胞的冷凍保存已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用在包括人、鼠、兔、羊、牛、豬、絨猴和大象等物種的臨床研究和動物育種中。通?？勺鳛槔鋬霰Ｗo劑應(yīng)用的化學(xué)物質(zhì)有二甲基亞砜(DMSO)、甘油(GLY)、乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)、甲醇等。但它們對不同物種和不同細胞的適應(yīng)性差異較大。有關(guān)組織細胞對各類保護劑的耐受性和保存效果的研究僅見于人、牛卵巢組織和牛胎兒皮膚細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于發(fā)明一種奶牛皮膚冷凍保存方法，以建立冷凍保存體細胞的新方法。
本發(fā)明將奶牛皮膚組織置于冷凍保護液中，用干冰熏蒸法冷凍至保護液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。
具體方法可以有三種冷凍保護液是濃度為10％～30％的甘油，冷凍前，先在環(huán)境溫度為4℃條件下平衡20～25min。
或冷凍保護液是濃度為10％～30％的丙二醇，冷凍前，先在環(huán)境溫度為22℃條件下平衡20～25min。
或冷凍保護液是濃度為10％～30％的二甲基亞砜，冷凍前，先在環(huán)境溫度為4℃條件下平衡20～25min。
本發(fā)明研究了三種冷凍劑對奶牛皮膚生長能力的毒性和保護性，通過研究建立冷凍保存體細胞的新方法。通過以上述方法，可獲得解凍后成活率較高的奶牛皮膚冷凍組織。解凍后，皮膚組織能生長出成纖維細胞。本發(fā)明無需特殊的冷凍儀器要求，簡單容易操作，體細胞組織樣本的收集非常方便，用于奶牛種質(zhì)資源保存、克隆動物等，還適合于珍稀動物或珍貴細胞的長期保存。
具體實施例1、新鮮皮膚樣本的獲取用75％的酒精消毒牛耳，用取樣鉗迅速剪下1～2cm2大小的皮膚塊，將采集的樣本放在干冰中保存并在0.5～1h內(nèi)運到實驗室。首先用75％的酒精迅速消毒牛耳，再用無菌PBS漂洗多次，去毛，剝離皮膚表皮，收集皮下組織并切成2mm3大小的組織塊。
2、皮膚組織的毒性試驗取12～15塊奶牛皮膚組織，在4℃和室溫兩個不同條件下分別置于三個梯度濃度(10％、20％、30％)的三種不同冷凍保護劑甘油、丙二醇、二甲基亞砜中。分別在環(huán)境溫度為4℃和22℃條件下平衡20～25min后，預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)液分別漂洗三次。用EDTA-牛血漿貼附在25mm2培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上添加培養(yǎng)液直接進行培養(yǎng)，Hoechst熒光染料染色鑒定細胞生長情況。
毒性試驗結(jié)果顯示奶牛皮膚組織在各濃度之間以10％甘油(GLY)，20％丙二醇(PROH)生長效果最好，與其它濃度之間差異顯著(P＜0.05)?？傮w結(jié)果是在4℃條件下平衡的皮膚組織生長率比在22℃條件下平衡的好。但組織在4℃平衡條件下，暴露在甘油(GLY)和二甲基亞砜(DMSO)中的組織生長率高。在22℃平衡條件下，暴露在丙二醇(PROH)中的組織生長率較高。
3、皮膚組織的冷凍和解凍冷凍及解凍的過程如下隨機取3～5塊皮膚組織塊放入到事先裝有0.5ml不同濃度不同保護液的冷凍管中，然后分成四組進行處理。第一組在室溫下平衡20～25min，第二組未經(jīng)平衡作為對照。第三和第四組均在室溫下平衡20～25min。第三組經(jīng)平衡后在干冰上降溫并冷凍保存，而第四組則直接投入液氮中保存，之后撈取并保存在-80℃條件下。干冰降溫過程是將冷凍管放在干冰面上方支架上慢速降溫至培養(yǎng)液凍結(jié)后轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。經(jīng)過1～2周的低溫保存后，將冷凍管取出直接放到37℃的水浴中解凍1-1.5min。用含10％FCS的新鮮預(yù)熱的DMEM漂洗3次，去除冷凍保護劑。在經(jīng)過解凍后，將這些組織用EDTA-牛血漿貼附在25mm2培養(yǎng)瓶內(nèi)壁上添加培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
4、冷凍后皮膚組織的培養(yǎng)奶牛皮膚組織培養(yǎng)液組成為含10％FCS、2mM谷氨酰胺、0.1mM的β-巰基乙醇、1％非必需氨基酸、1％維生素、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。Hoechst染色鑒定細胞生長情況。
皮膚組織置培養(yǎng)瓶中，每天換新鮮的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
在培養(yǎng)11天相同時間內(nèi)，牛耳皮膚組織能生長出大量的細胞，容易擴展，生長率平均為65.6％。
奶牛皮膚組織冷凍后的生長情況用干冰降溫，10％GLY、20％GLY、10％PROH和20％PROH作為保護劑的生長情況與對照組和其它組之間存在顯著差異(p＜0.05)。用液氮降溫的組織均未見有組織生長。
權(quán)利要求
1.奶牛皮膚冷凍保存方法，其特征在于將奶牛皮膚組織置于冷凍保護液中，用干冰熏蒸法冷凍至保護液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置-80℃的冷凍器中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述奶牛皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述冷凍保護液是濃度為10％～30％的甘油，冷凍前，先在環(huán)境溫度為4℃條件下平衡20～25min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述奶牛皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述冷凍保護液是濃度為10％～30％的丙二醇，冷凍前，先在環(huán)境溫度為22℃條件下平衡20～25min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述奶牛皮膚冷凍保存方法，其特征在于所述冷凍保護液是濃度為10％～30％的二甲基亞砜，冷凍前，先在環(huán)境溫度為4℃條件下平衡20～25min。
全文摘要
奶牛皮膚冷凍保存方法，涉及種質(zhì)資源保存、轉(zhuǎn)基因、低溫冷凍保存、組織工程等領(lǐng)域。將奶牛皮膚組織置于冷凍保護液中，用干冰熏蒸法冷凍至保護液凍結(jié)后，轉(zhuǎn)移置－80℃的冷凍器中。本發(fā)明研究了冷凍劑對奶牛皮膚生長能力的毒性和保護性，通過研究建立冷凍保存體細胞的新方法。通過以上述方法，可獲得解凍后成活率較高的奶牛皮膚冷凍組織。解凍后，皮膚組織能生長出成纖維細胞。本發(fā)明無需特殊的冷凍儀器要求，簡單容易操作，體細胞組織樣本的收集非常方便，用于奶牛種質(zhì)資源保存、克隆動物等，還適合于珍稀動物或珍貴細胞的長期保存。
文檔編號C12N5/06GK1821390SQ200610038608
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者李碧春 申請人:揚州大學(xué)