專利名稱：一種雞精原細(xì)胞分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因、珍稀物種的保存和組織與細(xì)胞工程等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精原細(xì)胞是雄性生殖細(xì)胞的母細(xì)胞，在動物一生中精原細(xì)胞一方面能自我更新產(chǎn)生新的干細(xì)胞以維持自身數(shù)量的恒定，一方面能夠在自身基因或外來信號的調(diào)節(jié)下增殖分化為各階段的精細(xì)胞直至精子。它是雄性成體干細(xì)胞中唯一與下一代遺傳背景密切相關(guān)的細(xì)胞，由于這些潛在的價值，精原細(xì)胞日益成為許多研究轉(zhuǎn)基因?qū)W者關(guān)注的對象。但精原細(xì)胞在人和動物的睪丸細(xì)胞中所占比率極小，有資料表明，每只睪丸中約有108個細(xì)胞，其中約有2×104干細(xì)胞，僅占細(xì)胞總數(shù)的0.02％左右。因此，精原細(xì)胞分離純化方法的選擇就顯得尤為重要。1977年，Bellve等首次利用牛血清白蛋白(BSA)和單位重力速度沉淀法從未成年小鼠睪丸中獲得A型精原細(xì)胞組份可達(dá)到90％的純度。1986年，Bucci等采用組合酶消化法對大鼠的睪丸細(xì)胞進(jìn)行分離，也獲得純度為76％的精原細(xì)胞。但這些試驗不是消耗了大量的實驗動物材料就是獲得的精原細(xì)胞總數(shù)較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實驗的需要。經(jīng)過幾十年細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，精原細(xì)胞的分離純化技術(shù)也有了很大的進(jìn)步。2000年，F(xiàn)ariborz等使用組合酶消化法并結(jié)合貼壁培養(yǎng)和Percoll梯度離心，從牛的睪丸中獲得的A型精原細(xì)胞純度達(dá)到了80％以上。張學(xué)明等，俞作仁等分別利用Percoll密度梯度離心法和BSA重力沉降法，并結(jié)合貼壁培養(yǎng)對小鼠和長白豬的睪丸細(xì)胞進(jìn)行分離純化，獲得的精原細(xì)胞純度達(dá)到了68.8％和94.2％。但這些研究僅在哺乳動物上有所報道。目前，國內(nèi)外尚未見到雞精原細(xì)胞分離純化的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于為人們提供一種高純度、高成活率的雞精原細(xì)胞分離純化方法。
本發(fā)明包括以下步驟1)分離雞精原細(xì)胞無菌收集出雛后3～15日齡公雞睪丸，置于預(yù)熱的無Ca2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖液中，去除附睪、脂肪墊及白膜，將組織分成小塊，在磷酸鹽緩沖液中吹打，靜置后去上清液，沉淀的組織塊用1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶三步消化或1mg/ml膠原酶+1.5mg/ml透明質(zhì)酸酶/0.25％胰蛋白酶二步消化或1mg/ml膠原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶二步消化后，制成單細(xì)胞懸液。
2)Percoll分離、貼壁純化將單細(xì)胞懸液滴加到Percoll梯度上層，離心，將形成的細(xì)胞條帶置于另一試管中，加入磷酸鹽緩沖液稀釋Percoll，用離心方法去除上清液，將試管中的沉淀物用DMEM培養(yǎng)液懸起，最后將細(xì)胞吹打均勻后，接種到用0.1％明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)板中，在37℃±2℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h～36h后，棄去舊的培養(yǎng)液；然后用磷酸鹽緩沖液清洗1～2次，最后再加入新鮮DMEM。
上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’S medium液)，即杜貝克氏改良的恩格氏培養(yǎng)液。
本發(fā)明首次對不同時期雞胚的睪丸，比較以組合酶和Percoll介質(zhì)梯度的分離方法，并依據(jù)睪丸細(xì)胞不同貼壁特性進(jìn)行純化，以探索合適的雞精原細(xì)胞分離方法、時期、及精原細(xì)胞純化的可能性。通過從雞睪丸組織中分離出精原細(xì)胞，并經(jīng)過Percoll梯度離心和貼壁純化方法進(jìn)一步對雞精原細(xì)胞進(jìn)行純化，能制備出睪丸細(xì)胞數(shù)和存活率都較高的生精上皮細(xì)胞懸液，而且還能確保去除睪丸中其它體細(xì)胞成份。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于1、方法簡單易行，可重復(fù)性強(qiáng)，在普通實驗室即可進(jìn)行。
2、運(yùn)用該技術(shù)獲取的精原細(xì)胞純度極高，能夠滿足一般試驗的需要。
3、為禽類精原細(xì)胞的分離純化提供了依據(jù)，同時也為今后雞精原細(xì)胞進(jìn)行的一系列研究提供了方法和途徑。
4、該技術(shù)也適用于其它卵生動物的精原細(xì)胞的分離與純化，可用于珍貴物種的利用與開發(fā)。
為進(jìn)一步提高精原細(xì)胞純度，可收集出雛后6日齡公雞睪丸進(jìn)行分離提純。
具體實施例方式
1、雞精原細(xì)胞分離方法的確定無菌收集出雛后3-6日齡公雞兩側(cè)睪丸，置于預(yù)熱的無Ca2+、Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)中，用尖頭鑷子去除睪丸的附睪，脂肪墊及其白膜，之后將組織分成1mm3左右的小塊，在PBS中輕輕吹打1-2min，靜置后去上清液，沉淀的組織塊用以下3種方法進(jìn)行消化處理方法11mg/ml膠原酶+1.5mg/ml透明質(zhì)酸酶/0.25％胰蛋白酶二步消化方法21mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶三步消化方法31mg/ml膠原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶二步消化睪丸組織經(jīng)方法1、方法2和方法3消化后獲得的平均細(xì)胞存活率分別為90.6％，94.4％和89.3％；每睪平均活細(xì)胞數(shù)則分別為2.20×105個，3.24×105個和2.80×105個。
綜合比較這3種方法，方法2獲得的平均細(xì)胞存活率比方法1高出3.8％，比方法3高出5.1％；平均每睪活細(xì)胞數(shù)比方法1多1.04×105個，比方法3多0.44×105個。在細(xì)胞存活率方面，方法1與方法3沒有明顯的差異(P＞0.05)，但與方法2相比差異顯著(P＜0.05)。在每睪獲得的活細(xì)胞數(shù)上，方法2與方法3沒有明顯的差異但與方法1差異顯著(P＜0.05)。因此，與方法1和3相比，方法2對雞睪丸細(xì)胞的離散程度要明顯優(yōu)于前兩者，且獲得較高的細(xì)胞存活率和平均每睪活細(xì)胞數(shù)(見表1)。
表1 不同處理方法對睪丸細(xì)胞的分離效果

注同列肩注中不同字母表示差異顯著(P＜0.05)2、適宜的雞精原細(xì)胞提取時間的確定分別從孵化15d，19d雞胚和出雛后6d、13d幼雛公雞中，無菌收集兩側(cè)睪丸，置于盛有事先預(yù)熱的無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下用尖頭攝子去除睪丸的附睪，脂肪墊及其白膜等附屬組織后，將睪丸組織分成1mm3左右的小塊，在PBS中輕微吹打1～2min，靜置5min后去上清液。沉淀加入10倍于組織塊的1mg/ml膠原酶I在37℃±1℃，5％CO2條件下作用16～20min，靜置后吸去上清液，用0.25％胰蛋白酶在同樣條件下作用4～6min，移上清液于10ml試管中并加小牛血清(或含有10％小牛血清的DMEM(即杜貝克氏改良的恩格氏培養(yǎng)液)培養(yǎng)液)終止消化。剩余的組織塊再加適量胰蛋白酶重復(fù)消化一次，倒置顯微鏡下見有單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)即可用小牛血清終止消化，懸液通過350目過濾篩，濾液移入10ml離心管中，1000r/min離心5min后吸去上清液，沉淀再用1.5mlDMEM(即杜貝克氏改良的恩格氏培養(yǎng)液)培養(yǎng)液重懸，輕微吹打均勻制成單細(xì)胞懸液。接種到0.1％明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)板孔中，接種密度約為3×105個/ml，置體外培養(yǎng)條件為5％CO2，95％空氣，38.5℃飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，棄去舊的培養(yǎng)液，PBS清洗1～2次后，重新加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下各任選3個視野，分別計細(xì)胞總數(shù)和圓形的精原細(xì)胞數(shù)，并計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果表明從4個不同時期雞睪丸細(xì)胞懸液中獲得的精原細(xì)胞純度平均為31.6％，其中出殼6d雛雞的睪丸細(xì)胞懸液獲得的精原細(xì)胞純度為33.8％，分別比胚胎期15d、19d和出雛13d公雞精原細(xì)胞純度高2.6％，4.3％和3.1％，且四個時期獲得的精原細(xì)胞純度差異顯著(P＜0.05)。
從以上結(jié)果可見在同樣的分離條件下，出殼6d雛雞獲得的精原細(xì)胞純度比胚胎期和出殼13d雛雞精原細(xì)胞純度都高(見表2)。
表2 不同日齡雞精原細(xì)胞分離前后的效果

注同列肩注中不同字母表示差異顯著(P＜0.05)3、適宜的雞精原細(xì)胞純化方法獲取的單細(xì)胞懸液將用以下兩種方法進(jìn)行處理方法1接種到0.1％明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)板孔中(標(biāo)記為A)，接種密度約為3×105個/ml，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中體外培養(yǎng)，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)內(nèi)CO2濃度為5％、空氣濃度為95％、溫度為38.5℃，且飽和濕度，培養(yǎng)24h后，棄去舊的培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗1～2次后，重新加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下任選3個視野，分別計細(xì)胞總數(shù)和圓形的精原細(xì)胞數(shù)，并計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差；然后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察精原細(xì)胞在體外培養(yǎng)的生長情況。
方法2緩慢滴加到Percoll梯度上層，2500r/min離心20min后，用100μl移液器將形成的細(xì)胞條帶取出至5ml離心管中，并加入2.5mlPBS緩沖液稀釋Percoll，800r/min離心5min后，去上清液，再加入PBS緩沖液稀釋Percoll；為了使Percoll減少到最低量，重復(fù)此過程三次，沉淀用3ml DMEM(杜貝克氏改良的恩格氏培養(yǎng)液)培養(yǎng)液懸起，吹打均勻后，等量分成兩份，分別接種到0.1％明膠預(yù)處理過的六孔培養(yǎng)板中，并標(biāo)記B和C，接種密度約為3×105個/ml，37℃±2℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，并定時觀察貼壁情況。
B孔中當(dāng)見有混雜其中的體細(xì)胞貼壁時(接種后約5h)，小心傾斜培養(yǎng)板，用吸管吸取未貼壁的精原細(xì)胞和培養(yǎng)液，另行接種培養(yǎng)，待大多數(shù)細(xì)胞貼壁之后(接種后約12h～24h)，棄去舊的培養(yǎng)液，PBS清洗1～2次后，重新加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下任選3個視野，分別計細(xì)胞總數(shù)和圓形的精原細(xì)胞數(shù)，并計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
C孔接種的細(xì)胞懸液，則不經(jīng)任何處理，連續(xù)培養(yǎng)24h～36h后，棄去舊的培養(yǎng)液，PBS清洗1～2次后，重新加入新鮮的DMEM(杜貝克氏改良的恩格氏培養(yǎng)液)培養(yǎng)液，以下過程與C孔處理相同.
結(jié)果表明出殼6d雛雞睪丸經(jīng)A、B、C三種方式處理后，獲得的精原細(xì)胞純度平均分別為33.8％，66.4％和82.0％。其中C方式經(jīng)過Percoll分離和貼壁純化后獲得的精原細(xì)胞純度最高，比A和B方式分別高15.6％和48.2％。B組合經(jīng)Percoll分離后獲得的精原細(xì)胞純度比A組合高32.6％，三個方式獲得精原細(xì)胞純度差異極顯著(P＜0.01)(見表3)。
表3 不同方式分離純化雞精原細(xì)胞效果的比較

注同列肩注中不同字母表示差異極顯著(P＜0.01)通過以上試驗表明雞睪丸組織經(jīng)“1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶”二酶三步消化之后，獲得的平均細(xì)胞活率為94.4％，每睪平均活細(xì)胞數(shù)為3.24×105個。因此，對雞睪丸細(xì)胞的分離有不可替代的優(yōu)勢，不僅因為用這種方法處理雞睪丸組織能制備出睪丸細(xì)胞數(shù)和存活率都較高的生精上皮細(xì)胞懸液，而且還能確保去除睪丸中其它體細(xì)胞成份。
在精原細(xì)胞提取時間上，本實驗分別比較了四個時期的分離效果(孵化15d，19d雞胚和出雛后6d、13d幼雛公雞)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從出雛后6d公雞的睪丸細(xì)胞懸液中獲得的精原細(xì)胞純度為33.8％，分別比胚胎期15d、19d和出雛13d公雞精原細(xì)胞純度高2.6％，4.3％和3.1％。因此，雞精原細(xì)胞的提取時間尤以出雛后6d公雞為佳。在精原細(xì)胞的純化方面，本試驗嘗試著以“組合酶消化+Percoll梯度離心+貼壁純化”方法純化雞精原細(xì)胞，獲得的精原細(xì)胞純度達(dá)到了82.0％左右。
權(quán)利要求
1.一種雞精原細(xì)胞分離純化方法，其特征在于包括以下步驟1)分離雞精原細(xì)胞無菌收集出雛后3～15日齡公雞睪丸，置于預(yù)熱的無Ca2+、Mg2+的磷酸鹽緩沖液中，去除附睪、脂肪墊及白膜，將組織分成小塊，在磷酸鹽緩沖液中吹打，靜置后去上清液，沉淀的組織塊用1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶三步消化或1mg/ml膠原酶+1.5mg/ml透明質(zhì)酸酶/0.25％胰蛋白酶二步消化或1mg/ml膠原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶二步消化后，制成單細(xì)胞懸液。2)Percoll分離、貼壁純化將單細(xì)胞懸液滴加到Percoll梯度上層，離心，將形成的細(xì)胞條帶置于另一試管中，加入磷酸鹽緩沖液稀釋Percoll，用離心方法去除上清液，將試管中的沉淀物用DMEM培養(yǎng)液懸起，最后將細(xì)胞吹打均勻后，接種到用0.1％明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)板中，在37℃±2℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24h～36h后，棄去舊的培養(yǎng)液；然后用磷酸鹽緩沖液清洗1～2次，最后再加入新鮮DMEM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞精原細(xì)胞分離純化方法，其特征在于收集出雛后6日齡公雞睪丸。
全文摘要
一種雞精原細(xì)胞分離純化方法，涉及轉(zhuǎn)基因、珍稀物種的保存和組織與細(xì)胞工程等領(lǐng)域。本發(fā)明先分離雞精原細(xì)胞，然后進(jìn)行Percoll分離、貼壁純化，本發(fā)明首次對不同時期雞胚的睪丸，比較以組合酶和Percoll介質(zhì)梯度的分離方法，并依據(jù)睪丸細(xì)胞不同貼壁特性進(jìn)行純化，以探索合適的雞精原細(xì)胞分離方法、時期、及精原細(xì)胞純化的可能性。通過從雞睪丸組織中分離出精原細(xì)胞，并經(jīng)過Percoll梯度離心和貼壁純化方法進(jìn)一步對雞精原細(xì)胞進(jìn)行純化，能制備出睪丸細(xì)胞數(shù)和存活率都較高的生精上皮細(xì)胞懸液，而且還能確保去除睪丸中其它體細(xì)胞成分。
文檔編號C12N5/06GK1821391SQ200610038610
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者李碧春, 吳洪 申請人:揚(yáng)州大學(xué)