專利名稱：一種融合蛋白的酵母表達(dá)載體及其基因工程產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)疫苗藥物的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬是乙腦主要的傳染源之一，它與蚊形成了“蚊、豬”的循環(huán)傳播模式。同時，乙腦也是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一，該病引起妊娠母豬流產(chǎn)和死胎，公豬發(fā)生睪丸炎，仔豬因腦炎病死，直接影響豬群數(shù)量的擴(kuò)大，給養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)高產(chǎn)發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并極大的限制了肉產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯；在我國目前用于豬乙腦治療的疫苗是BHK細(xì)胞上培養(yǎng)的弱毒苗，但是存在病毒滴度低，保持能力不佳等缺點(diǎn)，所以對研制乙腦基因工程疫苗的要求越來越迫切；E蛋白是毒粒表面最重要的成分，E蛋白與病毒的毒力、宿主范圍、組織嗜性、膜融合、保護(hù)性免疫、血凝反應(yīng)和血清特異性有關(guān)，本試驗(yàn)選取的乙腦E蛋白主要抗原片段是根據(jù)軟件分析出抗原決定簇較集中的區(qū)域。結(jié)核桿菌熱休克蛋白70具有分子佐劑和載體效應(yīng)，是結(jié)核桿菌的主要抗原成分之一，可誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的發(fā)生，因此用該基因與一些傳染病或寄生蟲病病原體的抗原基因融合表達(dá)以制備疫苗，借助它的載體分子效應(yīng)和佐劑作用，以提高病原體抗原的免疫原性和疫苗的免疫預(yù)防效果。所選用的酵母表達(dá)載體含醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高，外源基因整合在酵母基因組上，可以穩(wěn)定存在，同時，高效分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后，進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且有利于產(chǎn)物的純化。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能增強(qiáng)抗原肽尤其是具有免疫保護(hù)性抗原肽的免疫原性的酵母表達(dá)載體，并且易于大規(guī)模、高效、快速生產(chǎn)，成本低廉。為研制一些傳染病或寄生蟲病防治的基因工程疫苗提供了分子佐劑。
1)以乙腦E蛋白基因?yàn)椴牧?，通過PCR方法將E蛋白上主要抗原片段基因擴(kuò)增出來，E蛋白上主要抗原片段基因位于乙腦SA14-14-2毒株基因組的946nt-2058nt，擴(kuò)增乙腦E蛋白上主要抗原片段基因的上下游引物分別是p1(5’)5’GAATTCATCCTCCTGCGTTGGTC3’；p2(3’)5’GGATCCGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；PCR總體積為25μL乙腦SA14-14-2毒株基因組1μL，2.5μL 10×PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.25μL rTaq酶，10mmol dNTP，用水補(bǔ)足到25μL體系。PCR條件95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃10min。
2)以人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組為模板擴(kuò)增出M.Thsp70基因，M.Thsp70基因登錄號為X58406，擴(kuò)增M.Thsp70的上下游引物分別是p1(5’)5’GGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；p2(3’)5’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；PCR總體積為25μL人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組1μL，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，10mmol dNTP，用水補(bǔ)足到25μL體系。PCR條件95℃5min；94℃1min，66℃1min，72℃3min，30個循環(huán)；72℃10min。
3)首先將E蛋白上的主要抗原片段基因用酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I連接到pBluescriptSK+質(zhì)粒(Promega公司)中，然后將M.Thsp70基因用酶切位點(diǎn)BamH I和Xba I連接到pBluescript SK+質(zhì)粒中E蛋白主要抗原片段基因的下游，因此獲得將E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因融合在pBluescript SK+上的載體SK-E-hsp70，再通過EcoR I和Xba I這兩個酶切位點(diǎn)將E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因形成的融合基因切下來，隨后同樣通過EcoR I和Xba I這兩個酶切位點(diǎn)連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α-A(Invitrogen公司，www.invitrogen.com)上，從而構(gòu)建出融合酵母表達(dá)載體pPICZ α-E-hsp70；4)按照畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ α-A說明書，該融合表達(dá)載體pPICZ α-E-hsp70線性化后，電轉(zhuǎn)化酵母菌，通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得融合蛋白E-hsp70即為基因工程產(chǎn)品。
有益效果1提高抗原性本發(fā)明應(yīng)用M.Thsp70作為分子佐劑，可以增強(qiáng)E蛋白主要抗原片段的免疫原性，在將融合蛋白E-hsp70免疫BALB/c小鼠后，其體液免疫和細(xì)胞免疫都比單獨(dú)的E蛋白主要抗原片段免疫效果好，并且無任何過敏反應(yīng)，此外，若只是將E蛋白主要抗原片段與M.Thsp70進(jìn)行物理性混合，M.Thsp70是不能發(fā)揮它的免疫增強(qiáng)作用的。
2可大量生產(chǎn)目前，在研究M.Thsp70作為分子佐劑時，一般采用原核表達(dá)載體，原核表達(dá)產(chǎn)物有可能形成包含體，需變性、復(fù)性以及純化，并且原核表達(dá)載體能表達(dá)的外源蛋白分子量較低，M.Thsp70的分子量為70kD，使得能插入的抗原肽分子量受限，本發(fā)明在使用M.Thsp70作為分子佐劑時選擇酵母表達(dá)載體，其優(yōu)點(diǎn)在于能表達(dá)的外源蛋白分子量較大，可達(dá)200kD，融合蛋白易于穩(wěn)定、純化，而且能進(jìn)行糖基化修飾，易于實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)。


圖1重組表達(dá)載體pPICZα-E，pPICZα-HSP70和pPICZα-E-HSP70的構(gòu)建圖2(A)E蛋白主要抗原片段的SDS-PAGE分析，(B)E蛋白主要抗原片段的Western blot分析，(C)hsp70蛋白的SDS-PAGE分析，(D)E-HSP70融合蛋白的SDS-PAGE分析和(E)E-HSP70融合蛋白的Western blot分析A:E蛋白主要抗原片段的SDS-PAGE分析，M.Marker；1，2.pPICZα-E；3.pPICZα-A；B:E蛋白主要抗原片段的Westernblot分析，M.Marker；1.pPICZα-E；Chsp70蛋白的SDS-PAGE分析，M.Marker；1.pPICZα-A；2，3.pPICZα-H70；DE-HSP70融合蛋白的SDS-PAGE分析，M.Marker；1.2.pPICZα-E-HSP70；3.pPICZα-A；EE-HSP70融合蛋白的Western blot分析，M.Marker；1.pPICZα-E-HSP70圖3mIL-2的半定量RT-PCR檢測結(jié)果1，2E蛋白主要抗原片段免疫組mIL-2的半定量RT-PCR結(jié)果；3，4E+HSP70免疫組mIL-2的半定量RT-PCR結(jié)果；5，6E-HSP70融合蛋白免疫組mIL-2的半定量RT-PCR結(jié)果；MMarker(DL2000)圖4(A)E蛋白，E+HSP70混合蛋白和E-HSP70融合蛋白分別免疫小鼠后mIL-2產(chǎn)生數(shù)量的比較；(B)E蛋白，E+HSP70混合蛋白和E-HSP70融合蛋白分別免疫小鼠后淋巴細(xì)胞增殖的比較(注標(biāo)注不同字母者表示差異顯著，p＜0.05)具體實(shí)施例1酵母表達(dá)載體pPICZα-E，pPICZα-HSP70和pPICZα-E-HSP70的構(gòu)建1)設(shè)計擴(kuò)增酵母表達(dá)載體pPICZα-E中E蛋白主要抗原片段基因的引物，p1(5’)5’GAATTCATCCTCCTGCTGTTGGTC3’；p2(3’)5’TCTAGAACGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；5’端帶有EcoR I位點(diǎn)，3’端帶有Xba I位點(diǎn)。
以乙腦E蛋白基因?yàn)椴牧?，通過PCR方法將E蛋白上主要抗原片段基因擴(kuò)增出來，E蛋白上主要抗原片段基因位于乙腦SA14-14-2毒株基因組的946nt-2058nt，PCR總體積為25μL乙腦SA14-14-2毒株基因組1μL，2.5μL 10×PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.25μL rTaq酶，10mmol dNTP，用水補(bǔ)足到25μL體系。PCR條件95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃10min。
然后將E蛋白上主要抗原片段基因連接到pMD18-T載體(TaKaRa公司)上，獲得載體pMD18-T-E，再通過EcoR I和Xba I兩個酶切位點(diǎn)將E蛋白上主要抗原片段基因從載體pMD18-T-E上切下來，這樣可獲得分別含有EcoR I和Xba I兩個粘性末端的E蛋白主要抗原片段基因，隨后將該E蛋白主要抗原片段基因通過EcoR I和Xba I兩個酶切位點(diǎn)連接到pPICZ α-A載體上，從而獲得酵母表達(dá)載體pPICZ α-E。
2)設(shè)計擴(kuò)增酵母表達(dá)載體pPICZα-HSP70中M.Thsp70基因的引物，p1(5’)5’GAATTCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；p2(3’)5’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；5’端帶有EcoR I位點(diǎn)，3’端帶有Xba I位點(diǎn)。
以人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組為模板擴(kuò)增出M.Thsp70基因，M.Thsp70基因登錄號為X58406，PCR總體積為25μL人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組1μL，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，10mmol dNTP，用水補(bǔ)足到25μL體系。PCR條件95℃5min；94℃1min，66℃1min，72℃3min，30個循環(huán)；72℃10min。
然后將M.Thsp70基因連接到pMD18-T載體上，獲得載體pMD18-T-HSP70，再通過EcoR I和Xba I兩個酶切位點(diǎn)將M.Thsp70基因從載體pMD18-T-HSP70上切下來，這樣可獲得分別含有EcoR I和Xba I兩個粘性末端的M.Thsp70基因，隨后將該M.Thsp70基因通過EcoR I和Xba I兩個酶切位點(diǎn)連接到pPICZ α-A載體上，從而獲得酵母表達(dá)載體pPICZ α-HSP70。
3)設(shè)計擴(kuò)增酵母表達(dá)載體pPICZ α-E-HSP70中E蛋白主要抗原片段基因的引物，5’端引物為5’GAATTCATCCTCCTGCTGTTGGTC3’；3’端引物為5’GGATCCGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；5’端帶有EcoR I位點(diǎn)，3’端帶有BamH I位點(diǎn)。
以乙腦E蛋白基因?yàn)椴牧?，通過PCR方法將酵母表達(dá)載體pPICZ α-E-HSP70中E蛋白上主要抗原片段基因擴(kuò)增出來，PCR總體積為25μL乙腦SA14-14-2毒株基因組1μL，2.5μL 10×PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.25μL rTaq酶，10mmol dNTP，用水補(bǔ)足到25μL體系。PCR條件95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃10min。
4)設(shè)計擴(kuò)增酵母表達(dá)載體pPICZα-E-HSP70中M.Thsp70基因的引物，
p1(5’)5’GGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；p2(3’)5’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；5’端帶有BamH I位點(diǎn)，3’端帶有Xba I位點(diǎn)。
以人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組為模板擴(kuò)增出酵母表達(dá)載體pPICZα-E-HSP70中M.Thsp70基因，PCR總體積為25μL人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組1μL，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的上下游引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，10mmol dNTP，用水補(bǔ)足到25μL體系。PCR條件95℃5min；94℃1min，66℃1min，72℃3min，30個循環(huán)；72℃10min。
首先將E蛋白上的主要抗原片段基因用酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I連接到pBluescript SK+質(zhì)粒(Promega公司)中，然后將M.Thsp70基因用酶切位點(diǎn)BamH I和Xba I連接到pBluescript SK+質(zhì)粒中E蛋白主要抗原片段基因的下游，因此獲得將E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因融合在pBluescript SK+上的載體SK-E-hsp70，再通過EcoR I和Xba I這兩個酶切位點(diǎn)將E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因形成的融合基因切下來，隨后同樣通過EcoR I和Xba I這兩個酶切位點(diǎn)連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα-A(Invitrogen公司，www.invitrogen.com)上，從而構(gòu)建出融合酵母表達(dá)載體pPICZα-E-hsp70。
圖1為酵母表達(dá)載體pPICZα-E，pPICZα-HSP70和pPICZα-E-HSP70的構(gòu)建，這三種載體構(gòu)建完畢后，質(zhì)粒中外源基因的序列測定由上海博亞生物公司完成。
2酵母載體的表達(dá)將酵母表達(dá)載體pPICZα-E，pPICZα-HSP70，pPICZα-E-HSP70和pPICZα-A線性化后電穿孔轉(zhuǎn)化，用PCR鑒定重組子，檢測引物為p1(5’)5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’(5’Pichia primer)；p2(3’)5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’(3’Pichia primer)。
PCR總體積為25μL重組子基因組1μg，2.5μL 10×LA PCR Buffer，1.25μL DMSO，各10pmol的檢測引物，2μL 25mM MgCl2，0.625U LA Taq酶，20mmol dNTP，用水補(bǔ)足到25μL體系。PCR條件95℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃4min，30個循環(huán)；72℃10min。陽性重組子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，pPICZα-E表達(dá)出44kD和50kD兩種糖基化程度不同的E蛋白主要抗原片段，表達(dá)量較高，約為290mg/L，pPICZα-HSP70表達(dá)的HSP70蛋白分子量為70kD，表達(dá)量為178mg/L，pPICZα-E-HSP70表達(dá)出114kD的E-HSP70融合蛋白，表達(dá)量為33mg/L，經(jīng)Western blot分析，E蛋白主要抗原片段和E-HSP70融合蛋白均具有針對乙腦的抗原性(圖2)。
3蛋白質(zhì)的制備由于本試驗(yàn)中，酵母表達(dá)的外源蛋白較純，自體蛋白極少而且不需考慮LPS的影響，所以在免疫小鼠之前，將表達(dá)的蛋白用PBS進(jìn)行透析，在GeneQuant pro RNA/DNACalculator定量后就可直接進(jìn)行免疫。
4免疫小鼠分為三組，每組10只；用2.2μg(50pmol)E蛋白主要抗原片段，2.2μg(50pmol)的E蛋白主要抗原片段和3.5μg(50pmol)的hsp70混合(命名為E+HSP70蛋白組)，5.7μg(50pmol)E-HSP70融合蛋白進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，三周后第二次免疫。
5細(xì)胞免疫因子mIL-2的半定量RT-PCR檢測結(jié)果每只小鼠取相同量的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(反應(yīng)體系相同)，取等量的RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR，用同體積的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸瓊脂糖電泳，以了解這三組IL-2mRNA水平的差異。經(jīng)分析，β-actin的量大致相同，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠(圖3)，免疫E蛋白主要抗原片段組中IL-2灰度值的平均值為1.375±0.0212b，E+HSP70蛋白組中IL-2灰度值的平均值為1.01±0.0141b，免疫E-HSP70融合蛋白組中IL-2灰度值的平均值為2.23±0.212a，E-HSP70融合蛋白組IL-2灰度值的平均值與其它兩組差異顯著，而E蛋白主要抗原片段組和E+HSP70蛋白組兩者之間差異不顯著(P＜0.05)，這一結(jié)果表明E-HSP70蛋白引起的IL-2含量高于其它兩組(圖4A)。
6四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)免疫E蛋白主要抗原片段的小鼠組OD570平均值為0.32±0.068b，E+HSP70蛋白組為0.35±0.042b，E-HSP70融合蛋白組為0.55±0.0812a，這三組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，E蛋白主要抗原片段組和E+HSP70混合蛋白組差異不顯著，而這兩組均與E-HSP70融合蛋白組差異顯著(P＜0.05)，這一結(jié)果表明E-HSP70蛋白組淋巴細(xì)胞增殖強(qiáng)于其它兩組(圖4B)。
7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)結(jié)果經(jīng)測定，E蛋白主要抗原片段組產(chǎn)生的抗E蛋白主要抗原片段的抗體滴度為103.2，E+HSP70蛋白組產(chǎn)生的抗E蛋白主要抗原片段的抗體滴度為103.2，E-HSP70蛋白組產(chǎn)生的抗E蛋白主要抗原片段的抗體滴度為103.5，這一結(jié)果表明E-HSP70蛋白組引起的體液免疫效果比其它兩組的效果好。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白的酵母表達(dá)載體，是通過以下方法獲得的1)設(shè)計引物上游引物p15’GAATTCATCCTCCTGCTGTTGGTC3’；下游引物p25’GGATCCGAAGGGGTTCACTGTCAC3’；以乙腦E蛋白基因?yàn)槟０?，通過PCR方法擴(kuò)增獲得乙腦E蛋白上主要抗原片段基因，E蛋白上主要抗原片段基因位于乙腦SA14-14-2毒株基因組的946nt-2058nt；2)設(shè)計引物上游引物p15’GGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCGACC3’；下游引物p25’TCTAGAAACTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCG3’；以人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組為模板，PCR方法擴(kuò)增出M.T hsp70基因，M.T hsp70基因登錄號為X58406；3)首先將E蛋白上主要抗原片段基因用酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I連接到pBluescript SK+質(zhì)粒中，然后將M.T hsp70基因用酶切位點(diǎn)BamH I和Xba I連接到pBluescript SK+質(zhì)粒中E蛋白主要抗原片段基因的下游，因此獲得將E蛋白主要抗原片段基因和M.T hsp70基因融合在pBluescript SK+上的載體SK-E-hsp70，再通過EcoR I和Xba I這兩個酶切位點(diǎn)將E蛋白主要抗原片段基因和M.T hsp70基因形成的融合基因切下來，隨后同樣通過EcoRI和Xba I這兩個酶切位點(diǎn)連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα-A上，從而構(gòu)建成功融合酵母表達(dá)載體pPICZα-E-hsp70。
2.權(quán)利要求1所述一種融合蛋白的酵母表達(dá)載體的基因工程產(chǎn)品，其特征在于按照畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα-A使用說明書，將融合表達(dá)載體pPICZα-E-hsp70線性化后，電轉(zhuǎn)化酵母菌，通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得融合蛋白E-hsp70，即為所獲得的基因工程產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白的酵母表達(dá)載體及其基因工程產(chǎn)品，屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)疫苗藥物的技術(shù)領(lǐng)域。分別以乙腦E蛋白基因和人結(jié)核桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的基因組為模板擴(kuò)增出E蛋白主要抗原片段基因和M.Thsp70基因，先將這兩個基因以一個酶切位點(diǎn)BamHI連接的方式克隆入pBluescript SK+質(zhì)粒中，最后將該融合基因克隆入pPICZ α－A中，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPICZ α－E－h(huán)sp70，按照說明書，該融合表達(dá)載體pPICZ α－E－h(huán)sp70線性化后，電轉(zhuǎn)化酵母菌，通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，從而獲得融合蛋白E－h(huán)sp70，來開發(fā)研制相關(guān)的基因工程產(chǎn)品。
文檔編號C12N1/19GK1869239SQ20061004076
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日
發(fā)明者陳溥言, 葛菲菲, 邱亞峰, 曹瑞兵, 周斌 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)