專利名稱：一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，本發(fā)明還涉及該方法在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展[1，2]，人們發(fā)現(xiàn)了癌基因的存在[3]，這為我們闡明了腫瘤來源于正常細(xì)胞但又不同于正常細(xì)胞的關(guān)系。腫瘤的發(fā)生包含許多級(jí)聯(lián)事件，比如無限增殖、持續(xù)的血管生成和組織侵入等[4]。腫瘤細(xì)胞通常表達(dá)腫瘤特異性抗原或是腫瘤相關(guān)抗原，這構(gòu)成了宿主免疫系統(tǒng)攻擊的標(biāo)靶?？贵w可以通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒活性攻擊腫瘤。而免疫細(xì)胞，例如自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞則可以通過細(xì)胞間相互作用裂解腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，T輔助細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)上述反應(yīng)。盡管機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的異常進(jìn)行著嚴(yán)密的監(jiān)控，但是腫瘤的發(fā)生和生長并不能被完全禁止。一系列的機(jī)理已經(jīng)被提出來解釋免疫監(jiān)視的失敗，比如，腫瘤抗原的丟失，主要組織相容性分子和共刺激分子表達(dá)的下調(diào)，抑制性細(xì)胞因子的過量表達(dá)等等[5，6，7，8]。經(jīng)過一個(gè)世紀(jì)的努力，科學(xué)家們?cè)诓粩嗟膰L試彌補(bǔ)腫瘤患者免疫系統(tǒng)的漏洞。
自從William Cloey第一次利用大腸桿菌裂解物成功地在腫瘤患者身上誘導(dǎo)了系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫以后，許多策略被發(fā)展出來喚醒癌癥患者的免疫系統(tǒng)[9]。在對(duì)Coley毒素作用機(jī)理了解的基礎(chǔ)之上，淋巴因子被引入腫瘤治療，其中IL-2展現(xiàn)了針對(duì)腫瘤的突出療效，盡管它存在著劑量相關(guān)的毒性[10，11，12]。腫瘤裂解物也被用來嘗試誘導(dǎo)抗腫瘤活性，并展現(xiàn)出了令人鼓舞的結(jié)果[13，14]。它包含了腫瘤細(xì)胞所有的抗原，并且可以引起多克隆反應(yīng)。但是，由于在裂解物中腫瘤抗原的含量有限，因此所引起的免疫反應(yīng)并不強(qiáng)烈。用射線照射過的腫瘤細(xì)胞是另一種提供所有腫瘤抗原的方式，它可以提供全部的腫瘤抗原庫[15，16，17]。但是，盡管處理過的腫瘤細(xì)胞可以在細(xì)胞膜上遞呈抗原并誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，但是由輻射引起的細(xì)胞完整性和細(xì)胞膜流動(dòng)性的損失會(huì)減少腫瘤細(xì)胞疫苗的免疫原性[18，19，20，21]。在此基礎(chǔ)上，利用基因工程令腫瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子和共刺激分子改善腫瘤細(xì)胞免疫原性也被嘗試[22，23，24，25]。在腫瘤抗原鑒定工作取得突破進(jìn)展的基礎(chǔ)上，利用腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤特異性抗原制備的腫瘤疫苗的方式也被嘗試[26，27，28]。一系列的腫瘤抗原，比如黑色素瘤的MART-1，gp100和TRP2等被陸續(xù)鑒定出來。作為最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，樹突細(xì)胞近年來成為被關(guān)注的焦點(diǎn)。由于樹突細(xì)胞表面表達(dá)大量的MHC分子和共刺激分子，用腫瘤抗原肽刺激樹突細(xì)胞、向樹突細(xì)胞中轉(zhuǎn)染腫瘤抗原cDNA或是將樹突細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合制成的疫苗都可以激發(fā)抗腫瘤免疫[29，30，31]。但是，我們應(yīng)當(dāng)看到的是樹突細(xì)胞的制備和樹突細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合疫苗的制備仍然離臨床應(yīng)用有一段距離。
利用活腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)免疫反應(yīng)已經(jīng)在不同的腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行了嘗試[32，33，34]。GM-CSF在其它抗腫瘤免疫方式的增強(qiáng)作用也已經(jīng)被探索[33]。
腫瘤組織的生長需要消耗大量營養(yǎng)，這些營養(yǎng)的運(yùn)輸又需要血管的支持，這使得腫瘤具有血管依賴性。針對(duì)腫瘤血管的抗腫瘤研究也是攻克腫瘤的方向之一。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)血管是藥物很容易到達(dá)的作用靶點(diǎn)；(2)殺傷腫瘤血管可以間接的殺傷更多數(shù)量的腫瘤細(xì)胞；(3)相對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞間的差異，腫瘤血管有較高的同源性，針對(duì)腫瘤血管的治療可以適用于多個(gè)腫瘤類型；(4)針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫可以導(dǎo)致腫瘤血管的栓塞，從而使腫瘤細(xì)胞失去營養(yǎng)支持。目前已有采用固定后的原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫[41，42]，但沒有利用活原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白提取物誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題提供一種利用活細(xì)胞、細(xì)胞凍干粉、活原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白提取物誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述方法在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，該方法是利用103～104劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫；或者，利用GM-CSF轉(zhuǎn)染的骨髓瘤FO細(xì)胞凍干粉誘導(dǎo)抗腫瘤免疫；或者，利用原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫；或者，利用腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白提取物誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。
所述的方法，其中利用103～104數(shù)量級(jí)的活骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法的步驟是a.培養(yǎng)活骨髓瘤FO細(xì)胞；
b.通過最大安全劑量的試驗(yàn)來保留其免疫原性并降低致瘤性，c.采取確定的最大安全劑量誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，d.對(duì)其所誘導(dǎo)的體液免疫與細(xì)胞免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
所述的方法，其中利用GM-CSF轉(zhuǎn)染的骨髓瘤凍干粉誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，包括通過利用重組GM-CSF基因的腺病毒制備分泌GM-CSF的骨髓瘤，該細(xì)胞直接凍干為凍干粉，利用該凍干粉誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，對(duì)所誘導(dǎo)的體液免疫與細(xì)胞免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
所述的方法，其中利用活原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法包括活原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的制備，利用該細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，對(duì)所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫與體液免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
所述的方法，其中利用腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白提取物誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，包括利用生物素標(biāo)記腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，將腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞破碎勻漿，采用單體親和素親和層析柱收集腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜蛋白，利用該蛋白誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫與體液免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
上述任一方法在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明第一次提出了采用低劑量(103-104)活骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)自身抗腫瘤免疫，且活骨髓瘤FO細(xì)胞與樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞均顯著地提高了小鼠的生存率。因?yàn)闆]有諸如抗原遞呈細(xì)胞、細(xì)胞因子、共刺激分子等外來調(diào)節(jié)因素涉及，所以該保護(hù)性反應(yīng)展現(xiàn)的是自體抗腫瘤機(jī)制。我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明了供體免疫小鼠的淋巴細(xì)胞在過繼免疫實(shí)驗(yàn)中可以抑制骨髓瘤的生長，而血清則未見明顯效果。同時(shí)，體外CTL實(shí)驗(yàn)也證明了免疫小鼠的T細(xì)胞具有裂解骨髓瘤的能力。在免疫小鼠T細(xì)胞體外激活時(shí)，其分泌的IFN-γ也上升了10倍之多，表明細(xì)胞免疫在抑制腫瘤生長過程中起著關(guān)鍵作用。本發(fā)明通過低劑量活骨髓瘤誘導(dǎo)了強(qiáng)大的細(xì)胞免疫，并且該免疫反應(yīng)可以充分的預(yù)防和抑制骨髓瘤生長。
2.與前人發(fā)現(xiàn)樹突腫瘤融合細(xì)胞疫苗沒有致瘤性不一致的是[30]，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠注射106樹突-骨髓瘤FO細(xì)胞可以導(dǎo)致小鼠腫瘤生長。雖然樹突-骨髓瘤融合疫苗的致瘤性可通過照射γ射線得到了抑制，但是其所激發(fā)的保護(hù)性免疫也有所減弱。為了避免腫瘤發(fā)生并能夠達(dá)到較好的抗腫瘤免疫效果，本發(fā)明提供了活骨髓瘤FO細(xì)胞和樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞的安全注射劑量。
3.由于腫瘤細(xì)胞的免疫原性很差，所以將機(jī)體的免疫耐受轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ｗo(hù)性的免疫反應(yīng)存在著一定難度。本發(fā)明則展示了活的骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)出與活樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞一樣強(qiáng)大的抗腫瘤免疫。這是由于骨髓瘤FO細(xì)胞保留了部分免疫原性并減少了部分致瘤性所致。首先，作為骨髓瘤特殊性之一，免疫球蛋白被表達(dá)于細(xì)胞表面，其互補(bǔ)決定區(qū)是宿主攻擊的絕佳標(biāo)靶[35，36]。其次，骨髓瘤FO細(xì)胞衍生于骨髓細(xì)胞，這是一群高表達(dá)共刺激分子的細(xì)胞群，骨髓瘤FO細(xì)胞也保留了表達(dá)ICAM-1的能力[37，38]。第三，骨髓瘤FO細(xì)胞具有異質(zhì)性，并且只有其中一小部分具有強(qiáng)烈的致瘤性[39，40]。因此，強(qiáng)致瘤性腫瘤的移植可以通過降低骨髓瘤的注射劑量來避免。我們的實(shí)驗(yàn)證明了骨髓瘤的致瘤性在低劑量注射時(shí)有所下降。因此，本發(fā)明從免疫原性的保留和致瘤性的降低兩方面使得利用低劑量骨髓瘤誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫反應(yīng)成為可能。
4.本發(fā)明采用直接凍干的方法制備腫瘤裂解物，與傳統(tǒng)的制備方法有所不同。經(jīng)典的腫瘤裂解物是將腫瘤細(xì)胞機(jī)械破碎或反復(fù)凍融再凍干獲得，其蛋白抗原會(huì)因降解為小分子而導(dǎo)致免疫原性下降。但是本文所采用的直接凍干的方法，不但避免了這種風(fēng)險(xiǎn)而且還保持了蛋白質(zhì)相互交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，有利于更好的激活宿主的免疫系統(tǒng)。本發(fā)明采用轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤FO細(xì)胞凍干粉免疫小鼠，產(chǎn)生了較好的抗腫瘤效果，并證明針對(duì)骨髓瘤的抗體在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
5.在發(fā)現(xiàn)腫瘤的血管生成在腫瘤的發(fā)展中起著重要作用后，包括單克隆抗體在內(nèi)的多種血管生成抑制因子被用于抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。但是，誘導(dǎo)針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)的方案則少見報(bào)導(dǎo)。前人采用3％多聚甲醛固定的血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)了針對(duì)腫瘤血管的體液免疫，并取得了一定的療效[41]。也有科研工作者利用0.025％戊二醛固定的血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫也被激活[42]。這樣的差別可能是由于固定帶來的免疫原性及細(xì)胞活性的變化引起的。本發(fā)明所描述的利用活血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫中，細(xì)胞免疫與體液免疫均被激活。
6.本發(fā)明提供了利用腫瘤血管膜表面蛋白誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。本方案不涉及細(xì)胞的培養(yǎng)，周期更短。相對(duì)于全細(xì)胞蛋白，膜表面蛋白中可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的有效抗原含量更高，效果更強(qiáng)。此外，采用細(xì)胞膜蛋白提取物相對(duì)于采用細(xì)胞本身具有更高的安全性。


圖1樹突細(xì)胞的表型在無血清RPMI1640的環(huán)境中貼壁的小鼠單核細(xì)胞在含有10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，并分化為樹突細(xì)胞。其形態(tài)表現(xiàn)出明顯的樹狀突起。本圖的原始放大倍數(shù)為200倍。
圖2樹突細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況樹突細(xì)胞收獲以后，分別與PE(藻紅素)偶聯(lián)的抗ICAM-1和抗B7-1單抗以及FITC(熒光素)標(biāo)記的抗B7-2和抗MHC-II單抗于室溫保溫1h。所有的樣品用PBS洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光。結(jié)果表明，樹突細(xì)胞表面的共刺激分子和MHC-II分子皆大量表達(dá)。
圖3樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞收獲以后，分別與PE偶聯(lián)的抗ICAM-1和抗B7-1單抗以及FITC標(biāo)記的抗B7-2和抗MHC-II單抗于室溫保溫1h。所有的樣品用PBS洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光。結(jié)果表明，與樹突細(xì)胞相似，樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞表面的共刺激分子和MHC-II分子均大量表達(dá)。
圖4轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤FO細(xì)胞用無血清RPMI1640稀釋10倍的重組GM-CSF腺病毒懸液孵育細(xì)胞。37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，分別加入小牛血清和無血清RPMI1640，調(diào)整血清濃度至10％，并于孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的骨髓瘤FO細(xì)胞，用2％多聚甲醛固定15分鐘，再用含0.5％Triton X-100及0.5％BSA的PBS滲透細(xì)胞膜。用PE偶聯(lián)的抗小鼠GM-CSF的抗體(0.5μg/106個(gè)細(xì)胞)室溫染色1小時(shí)并在熒光顯微鏡下觀察。(A、轉(zhuǎn)染骨髓瘤FO細(xì)胞可見光照片；B、未轉(zhuǎn)染骨髓瘤FO細(xì)胞可見光照片；C、轉(zhuǎn)染骨髓瘤FO細(xì)胞熒光照片；D、未轉(zhuǎn)染骨髓瘤FO細(xì)胞熒光照片。)圖5大鼠肺血管內(nèi)皮的生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記和未標(biāo)記的大鼠肺用HRP-Streptavidin染色，用蘇木精復(fù)染，以檢測(cè)生物素標(biāo)記情況。A生物素標(biāo)記肺。大血管(粗箭頭所示)和肺泡毛細(xì)血管(細(xì)箭頭所示)的內(nèi)皮膜蛋白因?yàn)楸簧锼貥?biāo)記而呈陽性。B在生物素標(biāo)記肺中，支氣管(▲所示)因?yàn)槲幢簧锼貥?biāo)記而呈陰性，而毛細(xì)血管呈陽性(細(xì)箭頭所示)。C未經(jīng)生物素標(biāo)記的大鼠肺呈陰性。Scale bar100μm。
圖6生物素標(biāo)記的內(nèi)皮膜蛋白的分離純化EP指單價(jià)親和素親和柱的洗脫蛋白(Eluted Proteins)；LH指肺勻漿液蛋白(LungHomogenate)。兩個(gè)電泳道上樣等量的蛋白質(zhì)。A銀染的聚丙烯酰胺凝膠。兩個(gè)泳道顯示了不同的蛋白質(zhì)條帶。有些蛋白質(zhì)在EP中富集(用表示)，而有些蛋白質(zhì)在EP中減少或者消失(用表示)。B用HRP-Streptavidin檢測(cè)的免疫印跡。盡管兩個(gè)泳道上樣了等量的蛋白質(zhì)，但是EP所含的生物素標(biāo)記蛋白是LH的10倍以上。說明通過親和層析，生物素標(biāo)記被有效分離純化了。
圖7低劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞對(duì)骨髓瘤的預(yù)防效果BALB/c小鼠分別用103活骨髓瘤、104活樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞和106γ射線照射的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞免疫，每組5只。每兩周免疫一次，共免疫三次。在末次免疫后一周接種106骨髓瘤并每天觀測(cè)腫瘤生長情況，直至60天。結(jié)果表明，全部對(duì)照小鼠長出了腫瘤，并于44天內(nèi)全部死亡。相比之下，免疫組小鼠的生存率有不同程度的提高。其中，低劑量活骨髓瘤和樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞避免了80％的小鼠腫瘤發(fā)生，而照射處理的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞只保護(hù)了60％的小鼠不生成腫瘤。
圖8低劑量活骨髓瘤針對(duì)異源腫瘤的預(yù)防效果用103骨髓瘤FO細(xì)胞免疫C57BL/6小鼠，每兩周免疫一次，共免疫三次，每組5只。在末次免疫后一周接種106LLC腫瘤，并每天觀測(cè)腫瘤生長情況直至小鼠全部死亡。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，免疫組小鼠的生存率及生存時(shí)間均無顯著差異。
圖9活血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)骨髓瘤和LLC的預(yù)防免疫效果C57BL/6J與BALB/c小鼠每周一次連續(xù)4周接受106活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫后，分別于末次免疫一周后接種106LLC(A)或FO(B)腫瘤細(xì)胞(n＝5)。腫瘤的生長狀況被持續(xù)觀測(cè)一個(gè)月?！?”表示兩組腫瘤體積間有顯著差異(P＜0.05)。
圖10活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫延長腫瘤切除小鼠的壽命接種106LLC腫瘤細(xì)胞的C57BL/6J小鼠在切除腫瘤后每周一次連續(xù)3次免疫活血管內(nèi)皮細(xì)胞，其腫瘤大小(A)和生存時(shí)間(B)被觀測(cè)?！?”表示兩組之間的生存時(shí)間存在顯著差異(P＜0.05)。
圖11腫瘤血管膜表面蛋白誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫效果6-8周齡的雄性C56BL/6J小鼠用于腫瘤免疫預(yù)防實(shí)驗(yàn)。免疫組5只，每次免疫使用純化的腫瘤肺血管內(nèi)皮膜蛋白100μg和等體積的弗氏完全佐劑混合免疫；對(duì)照組5只，注射等體積PBS。兩組小鼠均腹腔注射，共免疫4次。末次免疫后第七天給兩組小鼠皮下植入LLC腫瘤細(xì)胞，均為5×105個(gè)細(xì)胞/只。記錄腫瘤小鼠生存率。
圖12活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長抑制梯度濃度(10μl、20μl、30μl)的活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的血清被加入血管內(nèi)皮細(xì)胞和SPC-A-1的培養(yǎng)上清中。結(jié)果表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長收到抑制，而SPC-A-1的生長則未受影響。
圖13低劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞過繼免疫實(shí)驗(yàn)供體BALB/c小鼠接受103骨髓瘤FO細(xì)胞免疫，每兩周免疫一次，共免疫三次，并于末次免疫后一周提取淋巴細(xì)胞和制備血清。受體小鼠在接種106骨髓瘤FO細(xì)胞后一周于尾靜脈分別注射免疫小鼠的100μl血清或7×107淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨髓瘤的生長受到了淋巴細(xì)胞的抑制，而血清則未見明顯效果。
圖14活血管內(nèi)皮細(xì)胞過繼免疫實(shí)驗(yàn)將活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的血清和T淋巴細(xì)胞分別注射于接種106SPC-A-1的nude小鼠及接種106FO的BALB/c小鼠，腫瘤生長情況被觀測(cè)。結(jié)果表明，免疫小鼠的血清和T淋巴細(xì)胞均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。“*”表示不同組間小鼠腫瘤的大小具有顯著性差異(P＜0.05)。
圖15活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫誘導(dǎo)腫瘤壞死接種106FO細(xì)胞的腫瘤小鼠在接受注射活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞后，其腫瘤組織被制成切片觀測(cè)。結(jié)果表明，與注射PBS的腫瘤小鼠切片相比，注射T淋巴細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中出現(xiàn)出血(箭頭)、壞死(大箭頭)和炎癥浸潤(小箭頭)的現(xiàn)象。
圖16腫瘤凍干粉疫苗預(yù)防免疫模型生存曲線收獲未轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染的骨髓瘤FO細(xì)胞，用PBS洗滌三次，計(jì)數(shù)，離心去上清并凍干。將凍干粉用PBS溶解，與弗氏完全佐劑1∶1混勻。每組含5只小鼠，每只皮下注射1×106個(gè)細(xì)胞的凍干粉。小鼠每兩周免疫一次，共免疫兩次。末次免疫后一周背部皮下接種1×106個(gè)骨髓瘤FO細(xì)胞，持續(xù)觀察腫瘤生長55天。
圖17低劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞免疫小鼠血清抗體滴度檢測(cè)將骨髓瘤FO細(xì)胞分別與1∶100稀釋的骨髓瘤FO(A)或樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞(B)免疫的小鼠血清保溫，之后再與FITC標(biāo)記的兔抗小鼠二抗保溫。洗滌后，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品熒光。結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠血清相比，免疫小鼠血清對(duì)骨髓瘤的抗體滴度無顯著差異。
圖18T細(xì)胞純度鑒定采用經(jīng)典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細(xì)胞中提取T細(xì)胞。將重懸于含有5％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的淋巴細(xì)胞通過37℃預(yù)熱的尼龍毛柱，收集穿過的細(xì)胞即為T淋巴細(xì)胞。將T細(xì)胞與其特異性的PE偶聯(lián)的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光計(jì)算T細(xì)胞純度。結(jié)果表明，T細(xì)胞純度達(dá)到了78.46±8.01％。
圖19低劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞免疫小鼠T細(xì)胞CTL功能檢測(cè)采用尼龍毛柱法從免疫小鼠(A、低劑量骨髓瘤，B、樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞)脾臟中提取的T細(xì)胞按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理的骨髓瘤FO細(xì)胞或樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞共同孵育72小時(shí)。T細(xì)胞被收獲后與目標(biāo)骨髓瘤FO細(xì)胞分別以圖示的效靶比孵育6小時(shí)。裂解細(xì)胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶含量被測(cè)定并計(jì)算出裂解百分比。結(jié)果表明，免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞展現(xiàn)出裂解骨髓瘤FO細(xì)胞的能力，并與效靶比呈正相關(guān)。
圖20低劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)分泌的細(xì)胞因子檢測(cè)提純的T細(xì)胞與50μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理的骨髓瘤FO細(xì)胞或樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/mlIL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育72小時(shí)，其上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夾心ELISA試劑盒測(cè)量。結(jié)果表明，與細(xì)胞免疫相關(guān)的Th1類細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)有大幅上升，而與體液免疫相關(guān)的Th2類細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)則未見明顯變化。
圖21轉(zhuǎn)染GM-CSF骨髓瘤凍干粉免疫小鼠血清抗體的檢測(cè)將末次免疫后一周的小鼠取血，制備血清。將骨髓瘤FO細(xì)胞分別與1∶100稀釋的轉(zhuǎn)染的骨髓瘤凍干粉免疫小鼠血清及對(duì)照組小鼠血清保溫。之后與PE標(biāo)記的抗小鼠二抗保溫，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光。
圖22轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉誘導(dǎo)的CTL功能檢測(cè)末次免疫后一周取小鼠脾臟細(xì)胞，并用尼龍毛柱法提純T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。將骨髓瘤FO細(xì)胞與50μg/ml絲裂霉素C在37℃保溫1小時(shí)，再與T細(xì)胞以1∶10的比例在含有10％胎牛血清、50U/mlIL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養(yǎng)基中共同孵育3天進(jìn)行體外激活。之后，將T細(xì)胞與骨髓瘤FO細(xì)胞按照效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1的比例保溫4小時(shí)，按照試劑盒說明書對(duì)其上清釋放的LDH含量進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算殺傷率。
圖23活血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL功能檢測(cè)活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞被提取并在體外激活后分別與血管內(nèi)皮細(xì)胞(A)和骨髓瘤FO細(xì)胞(B)培養(yǎng)。結(jié)果表明，該T細(xì)胞具有裂解血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，并呈現(xiàn)T細(xì)胞劑量相關(guān)性，但不具備裂解骨髓瘤FO細(xì)胞的能力。
圖24活血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分泌的細(xì)胞因子檢測(cè)活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的血清(A)及其T淋巴細(xì)胞體外激活釋放的上清(B)被用來檢測(cè)細(xì)胞因子的釋放。結(jié)果表明，其血清和細(xì)胞上清中的IFN-γ和IL-4均顯著的升高。這說明活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫均被激活。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。
一般性說明實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行。
本申請(qǐng)中提及的生物材料及試劑均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對(duì)本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的生物材料和試劑來代替。
發(fā)明材料1.小鼠品系6至8周雌性BALB/c、C57BL/6和Nu/Nu BALB/c小鼠，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
2.細(xì)胞系及其培養(yǎng)BALB/c同源的骨髓瘤細(xì)胞系FO和C57BL/6同源的肺癌細(xì)胞系LLC均購自ATCC(美國模式培養(yǎng)物收集中心)。人肺癌細(xì)胞SPC-A-1購于上海細(xì)胞庫。FO、LLC及SPC-A-1細(xì)胞均使用含有10％熱滅活新生牛血清(GIBCO，Grand Island，NY)、2mM L-谷胺酰胺(Hyclone，Logan，Utah)、2mg/ml碳酸氫鈉(Amersco，Cleveland，OH)、25mM HEPEs(Promega，Madison，WI)、100U/ml青霉素(華北制藥集團(tuán)公司，石家莊，中國)和100μg/ml鏈霉素(魯抗制藥，濟(jì)寧，中國)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。新提取的原代T細(xì)胞則培養(yǎng)于含有10％熱滅活的胎牛血清、50U/ml重組人白介素-2(北京四環(huán)制藥，北京，中國)，5μg/ml伴刀豆球蛋白(Promega，Madison，WI)、2mML-谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氫鈉、25mM HEPEs、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。人原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)90μg/ml肝素鈉(Sigma，St.Louis，MO)、2ng/ml bFGF(R&D，USA)、100μg/ml青霉素和100μg/ml的鏈霉素的IMDM培養(yǎng)液中。
主要試劑重組GM-CSF的腺病毒Adv-1/GM-CSF(購自南京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所)；定量GM-CSF的夾心ELISA所用捕捉抗體和檢測(cè)抗體均購于biolegend公司，HRP偶聯(lián)的親和素購于Pharmingen公司。顯色底物TMB購于KPL公司。藻紅素(PE)標(biāo)記的抗小鼠GM-CSF抗體購于eBioscience公司。藻紅素標(biāo)記的抗ICAM-1和抗B7-1單抗以及熒光素(FITC)標(biāo)記的抗B7-2單抗購于Pharmingen公司。熒光素標(biāo)記的抗MHC-II單抗購于Southern Biotechnology公司。CTL實(shí)驗(yàn)所用CytoTox 96 non radioactivecytotoxicity assay試劑盒購于Promega公司。檢測(cè)IFN-γ和IL-4的夾心ELISA試劑盒購于Pharmingen公司。提純T細(xì)胞所用尼龍毛購于Polysciences公司。
3統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異用學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算。
實(shí)施例1低劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫1、疫苗的制備1.1脾細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞小鼠脾臟中的紅細(xì)胞采用溶于0.01M Tris-HCl的8.3g/ml的氯化銨溶液裂解。未裂解脾臟細(xì)胞培養(yǎng)于含有2mM谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氫鈉、25mM HEPEs、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的無血清RPMI1640中。在5％CO2孵箱中培養(yǎng)1小時(shí)后，未貼壁細(xì)胞被洗去。貼壁脾臟細(xì)胞則繼續(xù)在含有10％胎牛血清、2mM谷胺酰胺、2mg/ml碳酸氫鈉、25mM HEPEs、10ng/ml IL-4(PeproTech，UK)、10ng/ml GM-CSF(PeproTech，UK)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并分化為樹突細(xì)胞。培養(yǎng)4天后，貼壁和松散貼壁的樹突細(xì)胞通過輕輕吹打收獲，細(xì)胞表面展現(xiàn)出典型的樹狀突起(見圖1)。同時(shí)，一些共刺激分子，比如ICAM-1、B7-1、B7-2和MHC-II等的表達(dá)也急劇上調(diào)(見圖2)。
1.2細(xì)胞融合樹突細(xì)胞與骨髓瘤FO細(xì)胞的混合比例為1∶2.5。融合過程使用預(yù)熱的50％(w/v)的聚乙二醇(Sigma)。
1.3樹突細(xì)胞和樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞表面抗原鑒定樹突細(xì)胞和采用PEG(聚乙二醇)制備的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞在用PBS洗滌后，分別與藻紅素(PE)偶聯(lián)的抗ICAM-1(Pharmingen)和抗B7-1(Pharmingen)單抗以及熒光素(FITC)標(biāo)記的抗B7-2(Pharmingen)和抗MHC-II(Southern Biotechnology，Alabama)單抗于室溫保溫1h。所有的樣品用PBS洗滌后，用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，Moutain View，CA)檢測(cè)熒光。
1.4融合細(xì)胞篩選在洗滌之后，融合細(xì)胞被培養(yǎng)于含有10％特級(jí)胎牛血清(Hyclone)，2mM谷胺酰胺，25mM HEPEs，2mg/ml碳酸氫鈉，10ng/ml GM-CSF，10ng/mlIL-4，5％(v/v)克隆因子(OriGen，Austin，Texas)，2％(v/v)HAT(氨基喋呤-胸苷-次黃嘌呤)(Sigma)，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。由于樹突細(xì)胞不能在體外無限增殖，HAT又限制了骨髓瘤FO細(xì)胞的生長，而樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞則不然，在該培養(yǎng)基培養(yǎng)一周后則獲得單一的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)與樹突細(xì)胞相似(見圖3)。
2活骨髓瘤FO細(xì)胞免疫最大安全劑量骨髓瘤FO細(xì)胞與樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞在洗滌后重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中。BALB/c小鼠注射骨髓瘤FO及樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞劑量梯度共設(shè)5組，每組5只，分別在背部皮下分別注射102、103、104、105和106個(gè)骨髓瘤FO細(xì)胞。之后每天觀察小鼠腫瘤生長狀況，持續(xù)觀察兩周。結(jié)果顯示小鼠接種106樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞和接種106骨髓瘤FO細(xì)胞都可以導(dǎo)致腫瘤形成。為了確定疫苗的安全劑量，我們?cè)谛∈笃は陆臃N了一系列的劑量。結(jié)果表明，在每只小鼠注射103骨髓瘤FO細(xì)胞和每只小鼠注射104樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞的劑量組未見有腫瘤形成，但是在更高的劑量組中都有腫瘤出現(xiàn)(見表1)。因此，每只小鼠接種103活骨髓瘤FO細(xì)胞或104活樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞被確定為免疫時(shí)采用的最大安全劑量。小鼠共免疫三次，每兩周免疫一次。
表1活細(xì)胞疫苗的最大安全劑量

a腫瘤發(fā)生率被表示為在整個(gè)組中腫瘤發(fā)生小鼠的數(shù)目。
b活樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞的最大安全劑量為每只小鼠注射104個(gè)細(xì)胞。
c活骨髓瘤融合細(xì)胞的最大安全劑量為每只小鼠注射103個(gè)細(xì)胞。
3、疫苗抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)3.1活細(xì)胞預(yù)防免疫抗腫瘤模型小鼠骨髓瘤FO模型骨髓瘤FO細(xì)胞、樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞、經(jīng)20Gyγ射線照射過的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞被收獲并分別重懸在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中。雌性BALB/c小鼠分別被103活骨髓瘤FO細(xì)胞、104活樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞、106γ射線照射過的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞免疫。細(xì)胞免疫一共進(jìn)行三次，每兩周免疫一次。在最后一次免疫后一周皮下接種106活骨髓瘤FO細(xì)胞。之后每天觀察腫瘤生長狀況，直到用RPMI1640培養(yǎng)基免疫的對(duì)照組小鼠全部死亡，記錄其生存率。在接種106骨髓瘤FO細(xì)胞之后，對(duì)照組中全部小鼠都長出腫瘤并在44天內(nèi)陸續(xù)死亡，而免疫組則表現(xiàn)出不同程度升高的生存率(見圖7)。并且，活的骨髓瘤FO細(xì)胞和樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞比γ射線照射過的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞更加有效。有80％經(jīng)活細(xì)胞免疫的小鼠避免了腫瘤發(fā)生，而照射過的樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞只保護(hù)了60％的小鼠。同時(shí)，被保護(hù)的小鼠在其整個(gè)壽命中保持了無腫瘤的狀態(tài)。
小鼠肺腫瘤LLC模型為了評(píng)估低劑量骨髓瘤誘導(dǎo)的免疫是否能夠抵抗異源腫瘤，C57BL/6小鼠被用活骨髓瘤FO細(xì)胞免疫并接種LLC腫瘤細(xì)胞。收集骨髓瘤FO細(xì)胞重懸于無血清RPMI1640培養(yǎng)基中。雌性C57BL/6于背部皮下接種103活骨髓瘤FO細(xì)胞進(jìn)行免疫。骨髓瘤FO細(xì)胞每兩周免疫一次，共免疫三次。在末次免疫一周后，給小鼠背部皮下接種106LLC細(xì)胞。每天觀測(cè)小鼠腫瘤生長情況直至全部小鼠死亡。沒有明顯證據(jù)表明該腫瘤受到了抑制(見圖8)，這揭示著活骨髓瘤誘導(dǎo)的免疫可能是骨髓瘤特異性的。
3.2活細(xì)胞過繼免疫抑制腫瘤生長實(shí)驗(yàn)活骨髓瘤免疫BALB/c供體小鼠用103活骨髓瘤FO細(xì)胞免疫三次，每兩周免疫一次。其淋巴細(xì)胞和血清在末次免疫后7天收獲。受體小鼠則接種106骨髓瘤FO細(xì)胞或SPC-A-1細(xì)胞，并在接種后一周于尾靜脈分別注射末次免疫后一周供體免疫小鼠的7×107脾細(xì)胞或100μl血清治療。受體小鼠每三天注射一次，共注射4次。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長徑和垂直徑，其大小由下列公式計(jì)算腫瘤體積＝0.5×腫瘤長徑×腫瘤垂直徑2，持續(xù)觀測(cè)直至所有對(duì)照組小鼠死亡為止。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活骨髓瘤FO細(xì)胞免疫的淋巴細(xì)胞有抑瘤活性，而血清則未見明顯效果(見圖13)；3.3免疫小鼠血清中抗體的檢測(cè)低劑量骨髓瘤免疫將骨髓瘤FO細(xì)胞與1∶100稀釋的低劑量活骨髓瘤免疫小鼠血清或?qū)φ招∈笱灞兀笤倥cFITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗(Southern Biotechnology)保溫。洗滌后，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品熒光。結(jié)果見其熒光強(qiáng)度與對(duì)照組血清結(jié)果相比無顯著差異(見圖17)。這說明免疫血清中針對(duì)骨髓瘤的抗體滴度不高。這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)免疫致敏的淋巴細(xì)胞而非血清在抑制腫瘤生長的過程中發(fā)揮著主要的作用。
3.4T細(xì)胞提取及純度鑒定采用經(jīng)典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細(xì)胞中提取T細(xì)胞。將重懸于5％小牛血清RPMI1640的淋巴細(xì)胞通過37℃預(yù)熱的尼龍毛柱，收集穿過的細(xì)胞即為T淋巴細(xì)胞。將T細(xì)胞與PE偶聯(lián)的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光計(jì)算T細(xì)胞純度。結(jié)果表明，T細(xì)胞的純度達(dá)到了78.46±8.01％(見圖18)。
3.5CTL功能檢測(cè)利用尼龍毛柱從小鼠脾臟中提取的T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，并按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理的骨髓瘤FO或樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養(yǎng)基中共同孵育72小時(shí)。之后T細(xì)胞被收獲并與目標(biāo)骨髓瘤FO細(xì)胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小時(shí)。裂解細(xì)胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶(LDH)含量使用CytoTox 96cytotoxicity assay kit(Promega)測(cè)定。LDH特異性的釋放百分比由下列公式計(jì)算特異性釋放百分比＝(實(shí)驗(yàn)組釋放-T細(xì)胞自發(fā)釋放-骨髓瘤自發(fā)釋放)/(最大骨髓瘤釋放-骨髓瘤自發(fā)釋放)×100。結(jié)果證明，與對(duì)照組T細(xì)胞相比，提取自低劑量骨髓瘤或樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞免疫小鼠的T細(xì)胞具有裂解骨髓瘤的能力(見圖19)。同時(shí)，裂解百分比也呈現(xiàn)出效靶比相關(guān)性。
3.6細(xì)胞因子分析提純的T細(xì)胞與50μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理的骨髓瘤FO細(xì)胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育72小時(shí)，T輔助細(xì)胞(Th)分泌于培養(yǎng)上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夾心ELISA試劑盒(BD Pharmingen)測(cè)量。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，IFN-γ的分泌量提高了10倍多，而IL-4則未見明顯改變(見圖20)。因?yàn)門h1細(xì)胞與Th2細(xì)胞分別特異性的分泌IFN-γ或IL-4等細(xì)胞因子，上述數(shù)據(jù)表明，作為細(xì)胞免疫反應(yīng)的一部分，Th1相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)明顯上升，而Th2相關(guān)的細(xì)胞因子則沒有顯著改變。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫1、疫苗的制備1.1將重組GM-CSF的腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓瘤FO細(xì)胞用無血清RPMI-1640稀釋10倍的重組GM-CSF腺病毒懸液孵育細(xì)胞。37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，分別加入小牛血清和無血清RPMI-1640，調(diào)整血清濃度至10％，并于孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。
1.2轉(zhuǎn)染效率及GM-CSF分泌量的測(cè)定收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的骨髓瘤FO細(xì)胞，用2％(v/v)多聚甲醛固定15分鐘，再用含0.5％(v/v)Triton X-100及0.5％(w/v)BSA的PBS滲透細(xì)胞膜。用PE偶聯(lián)的抗小鼠GM-CSF的抗體(0.5μg/106個(gè)細(xì)胞)室溫染色1小時(shí)并在熒光顯微鏡下觀察。由圖4可見，與可見光照片及未轉(zhuǎn)染骨髓瘤照片比較，90％以上的骨髓瘤FO細(xì)胞被重組腺病毒轉(zhuǎn)染。分泌的GM-CSF采用夾心ELISA法定量。用抗小鼠GM-CSF的捕獲抗體(1μg/ml)鋪板，用含1％BSA，0.1％Tween 20的PBS封閉，再依次與轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清、生物素標(biāo)記的抗小鼠GM-CSF的檢測(cè)抗體(2μg/ml)及偶聯(lián)HRP的親合素保溫，并用TMB底物顯色，于450nm檢測(cè)。夾心ELISA測(cè)得轉(zhuǎn)染后骨髓瘤FO細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌GM-CSF的量為240ng/24小時(shí)/106個(gè)細(xì)胞。
1.3腫瘤細(xì)胞凍干粉的制備分別收獲未轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染的骨髓瘤FO細(xì)胞，用PBS洗滌三次，計(jì)數(shù)，離心去上清并直接凍干。
2、疫苗抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)2.1免疫小鼠血清中抗體的檢測(cè)轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉免疫將骨髓瘤FO細(xì)胞與1∶100稀釋的轉(zhuǎn)染骨髓瘤凍干粉免疫小鼠血清或?qū)φ招∈笱灞兀笤倥cFITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗(Southern Biotechnology)保溫。洗滌后，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品熒光。結(jié)果見圖21，與對(duì)照小鼠相比，免疫小鼠的血清中存在可識(shí)別骨髓瘤的抗體。
2.2T細(xì)胞提取及純度鑒定采用經(jīng)典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細(xì)胞中提取T細(xì)胞。將重懸于5％小牛血清RPMI1640的淋巴細(xì)胞通過37℃預(yù)熱的尼龍毛柱，收集穿過的細(xì)胞即為T淋巴細(xì)胞。將T細(xì)胞與PE偶聯(lián)的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光計(jì)算T細(xì)胞純度。結(jié)果表明，T細(xì)胞的純度達(dá)到了78.46±8.01％(見圖18)。
2.3CTL功能檢測(cè)利用尼龍毛柱從小鼠脾臟中提取的T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，并按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理的目標(biāo)細(xì)胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養(yǎng)基中共同孵育72小時(shí)。之后T細(xì)胞被收獲并與目標(biāo)骨髓瘤FO細(xì)胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小時(shí)。裂解細(xì)胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶(LDH)含量使用CytoTox 96 cytotoxicity assay kit(Promega)測(cè)定。LDH特異性的釋放百分比由下列公式計(jì)算特異性釋放百分比＝(實(shí)驗(yàn)組釋放-T細(xì)胞自發(fā)釋放-骨髓瘤自發(fā)釋放)/(最大骨髓瘤釋放-骨髓瘤自發(fā)釋放)×100。由圖22可見，小鼠經(jīng)轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉免疫后，其T細(xì)胞裂解骨髓瘤的能力與對(duì)照小鼠無顯著差異，未見針對(duì)骨髓瘤的細(xì)胞免疫。
2.4凍干粉疫苗的體內(nèi)抗瘤活性本發(fā)明采用小鼠骨髓瘤預(yù)防免疫模型檢測(cè)凍干粉疫苗的抗腫瘤活性。將凍干粉用PBS溶解，與弗氏完全佐劑1∶1混勻。對(duì)照組、骨髓瘤凍干粉組和轉(zhuǎn)染骨髓瘤凍干粉組小鼠分別用PBS、骨髓瘤凍干粉或轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉免疫，每組含5只小鼠，每只皮下注射1×106個(gè)細(xì)胞的凍干粉。小鼠每兩周免疫一次，共免疫兩次。末次免疫后一周背部皮下接種1×106個(gè)骨髓瘤FO細(xì)胞，持續(xù)觀察腫瘤生長55天。由圖16可見，未經(jīng)免疫的5只BALB/c小鼠于接種腫瘤細(xì)胞后40天全部死亡。單獨(dú)的骨髓瘤凍干粉免疫的5只BALB/c小鼠全部出現(xiàn)腫瘤，并于接種后第51天全部死亡。相比之下，轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉則抑制了3只BALB/c小鼠的腫瘤發(fā)生。這些數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，單純的骨髓瘤凍干粉沒有顯著的抑瘤效果，但轉(zhuǎn)染GM-CSF的骨髓瘤凍干粉則可以預(yù)防腫瘤的發(fā)生。
實(shí)施例3活原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫1、疫苗的制備1.1原代人血管內(nèi)皮細(xì)胞的制備我們根據(jù)Jaffe EA等人的分離血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法進(jìn)行制備[43]。新鮮的人臍靜脈血管被II型膠原酶消化，得到的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用含有10％FBS的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)于1％明膠包被的培養(yǎng)皿中。
2、疫苗抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)2.1活細(xì)胞預(yù)防免疫抗腫瘤模型小鼠骨髓瘤FO模型原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞被收獲并重懸在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中。雌性BALB/c小鼠被106原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫。每周免疫一次共免疫四次。在最后一次免疫后一周皮下接種106活骨髓瘤FO細(xì)胞。之后每天觀察腫瘤生長狀況，直到用RPMI1640培養(yǎng)基免疫的對(duì)照組小鼠全部死亡，記錄其生存率。
小鼠肺腫瘤LLC模型收集原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞并重懸于無血清RPMI1640培養(yǎng)基中。雌性C57BL/6于背部皮下接種106原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫。每周免疫一次共免疫四次。在末次免疫一周后，給小鼠背部皮下接種106LLC細(xì)胞。每天觀測(cè)小鼠腫瘤生長情況直至全部小鼠死亡。
活血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)骨髓瘤及LLC腫瘤的預(yù)防免疫效果活血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著的減緩了骨髓瘤以及LLC腫瘤的生長(見圖9)，同時(shí)，免疫102到107劑量的小鼠均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。
2.2活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移6周齡C57BL/6小鼠被皮下接種5×105LLC細(xì)胞。當(dāng)腫瘤生長至800mm3后，小鼠被深度麻醉并切除腫瘤。并于腫瘤切除3天后治療組小鼠用5×105個(gè)活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫，每周免疫一次，連續(xù)免疫3周。對(duì)照組小鼠則用PBS代替。檢測(cè)小鼠的生存狀況。結(jié)果表明，小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移并未被抑制，但生存周期被顯著的延長。其生存周期從腫瘤接種后48.9天延長到59.5天，或是從腫瘤切除后30.9天延長到41.5天(見圖10)。
2.3活細(xì)胞過繼免疫實(shí)驗(yàn)活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫BALB/c供體小鼠用106活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫三次，每周免疫一次。其淋巴細(xì)胞和血清在末次免疫后7天收獲。受體BALB/c小鼠接種106骨髓瘤FO細(xì)胞，并在接種后一周尾靜脈注射100μl血清或107T淋巴細(xì)胞治療。受體小鼠每三天注射一次，共注射4次。每兩天觀測(cè)一次小鼠腫瘤生長情況，直至所有對(duì)照組小鼠開始死亡為止。小鼠的腫瘤組織被制為切片觀察。在nude小鼠中接種106SPC-A-1細(xì)胞，于接種一周后連續(xù)兩周每周3次注射免疫小鼠的血清，觀測(cè)腫瘤的生長情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫的淋巴細(xì)胞與血清則均有抑瘤活性(見圖14)。同時(shí)，活血管內(nèi)皮細(xì)胞過繼免疫免疫治療的小鼠腫瘤切片也可見嚴(yán)重的出血、壞死和炎癥現(xiàn)象(見圖15)。活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的血清可以有效的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，而對(duì)腫瘤細(xì)胞SPC-A-1沒有明顯作用(見圖12)。
2.4免疫小鼠血清中抗體的檢測(cè)活血管內(nèi)皮細(xì)胞將血管內(nèi)皮細(xì)胞以106每孔的濃度培養(yǎng)于96孔板中過夜。分別將10μl、20μl、30μl活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的血清與血管內(nèi)皮細(xì)胞孵育2天，用MTT法檢測(cè)血清作用。
2.5T細(xì)胞提取及純度鑒定采用經(jīng)典尼龍毛柱法從小鼠淋巴細(xì)胞中提取T細(xì)胞。將重懸于5％小牛血清RPMI1640的淋巴細(xì)胞通過37℃預(yù)熱的尼龍毛柱，收集穿過的細(xì)胞即為T淋巴細(xì)胞。將T細(xì)胞與PE偶聯(lián)的抗小鼠CD3抗體保溫，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光計(jì)算T細(xì)胞純度。結(jié)果表明，T細(xì)胞的純度達(dá)到了78.46±8.01％(見圖18)。
2.6CTL功能檢測(cè)利用尼龍毛柱從小鼠脾臟中提取的T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，并按照5∶1的比例與50μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理的骨髓瘤FO或樹突-骨髓瘤融合細(xì)胞在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養(yǎng)基中共同孵育72小時(shí)。之后T細(xì)胞被收獲并與目標(biāo)骨髓瘤FO細(xì)胞以不同的效靶比在U形底96孔板中孵育6小時(shí)。裂解細(xì)胞釋放在上清中的乳酸脫氫酶(LDH)含量使用CytoTox 96cytotoxicity assay kit(Promega)測(cè)定。LDH特異性的釋放百分比由下列公式計(jì)算特異性釋放百分比＝(實(shí)驗(yàn)組釋放-T細(xì)胞自發(fā)釋放-骨髓瘤自發(fā)釋放)/(最大骨髓瘤釋放-骨髓瘤自發(fā)釋放)×100。結(jié)果表明，活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞展現(xiàn)了裂解血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，并與T淋巴細(xì)胞劑量成相關(guān)性，但沒有發(fā)現(xiàn)其裂解腫瘤細(xì)胞FO的能力(見圖23)。由此可見，活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的細(xì)胞免疫均被激活。
2.7細(xì)胞因子分析提純的T細(xì)胞與50μg/ml絲裂霉素C預(yù)處理的活血管內(nèi)皮細(xì)胞以5∶1的比例在含有10％胎牛血清、50U/ml IL-2和5μg/ml伴刀豆蛋白A的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育72小時(shí)，T輔助細(xì)胞(Th)分泌于培養(yǎng)上清中分泌的IFN-γ和IL-4用夾心ELISA試劑盒(BD Pharmingen)測(cè)量。結(jié)果顯示，在免疫小鼠的血清中IL-4與IFN-γ分別從30.3pg/ml和28.2pg/ml提高到152.5pg/ml和125.2pg/ml，而免疫小鼠T細(xì)胞體外激活后IL-4和IFN-γ的釋放量也從32.4和30.2上升到493.5pg/ml和257.2pg/ml(見圖24)。由此可見，活血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫小鼠的體液免疫被激活。
實(shí)施例4腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白提取物誘導(dǎo)抗腫瘤免疫1、腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白的制備腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白的制備將SD大鼠乳腺癌細(xì)胞13762培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知技術(shù))。用不含血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106細(xì)胞/ml。每只SD大鼠尾靜脈注射1×10513762細(xì)胞，記錄大鼠體重。注射細(xì)胞10天后每天稱重大鼠，如果連續(xù)三天體重下降且超過10克，將大鼠麻醉進(jìn)行肺灌流，用生物素標(biāo)記大鼠肺腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，并用HRP-streptavidin染色檢驗(yàn)標(biāo)記效果(圖5)。將肺組織剪為小塊后勻漿。在勻漿液中加入1/10體積的10％(w/v)SDS溶液，并混勻1h。4℃20,000rpm離心2h后，收集離心上清并對(duì)PBS透析24小時(shí)去除游離的生物素。再次于4℃20,000rpm離心1h，收集上清。用固定化的單體親和素親和柱對(duì)標(biāo)記的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白進(jìn)行提純，并用銀染SDS-PAGE和Western-Blot檢驗(yàn)蛋白的富集效果(見圖6)。
2、疫苗抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白免疫抑瘤實(shí)驗(yàn)6-8周齡的雄性C56BL/6J小鼠被分為免疫組和對(duì)照組，每組5只，免疫組每次免疫使用腫瘤肺血管內(nèi)皮膜蛋白100μg和等體積的弗氏完全佐劑混合免疫；對(duì)照組注射等體積PBS。兩組小鼠均腹腔注射，共免疫4次。末次免疫后第七天給兩組小鼠皮下植入LLC腫瘤細(xì)胞，均為5×105細(xì)胞/只。記錄腫瘤小鼠生存率(見圖11)。
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權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其特征在于利用103～104劑量活骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫；或者，利用GM-CSF轉(zhuǎn)染的骨髓瘤FO細(xì)胞凍干粉誘導(dǎo)抗腫瘤免疫；或者，利用原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫；或者，利用腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白提取物誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用103～104數(shù)量級(jí)的活骨髓瘤FO細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法的步驟是a.培養(yǎng)活骨髓瘤FO細(xì)胞；b.通過最大安全劑量的試驗(yàn)來保留其免疫原性并降低致瘤性，c.采取確定的最大安全劑量誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，d.對(duì)其所誘導(dǎo)的體液免疫與細(xì)胞免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用GM-CSF轉(zhuǎn)染的骨髓瘤凍干粉誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，包括通過利用重組GM-CSF基因的腺病毒制備分泌GM-CSF的骨髓瘤，該細(xì)胞直接凍干為凍干粉，利用該凍干粉誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，對(duì)所誘導(dǎo)的體液免疫與細(xì)胞免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用活原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法包括活原代臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的制備，利用該細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，對(duì)所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫與體液免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白提取物誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，包括利用生物素標(biāo)記腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，將腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞破碎勻漿，采用單體親和素親和層析柱收集腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜蛋白，利用該蛋白誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫與體液免疫效果進(jìn)行測(cè)量。
6.權(quán)利要求1～5任一所述的方法在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法及其在制藥中的應(yīng)用。該方法利用10
文檔編號(hào)C12N5/10GK1887296SQ20061004086
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2006年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月31日
發(fā)明者劉建寧, 譚向陽, 張菁 申請(qǐng)人:南京大學(xué)生物制藥工程研究中心