專利名稱：兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測病毒核糖核酸的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中對丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的檢測，有匹基法、華美法等，均存在靈敏度低、特異性不理想等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效提高檢測靈敏性、特異性的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的方法，其特征是包括下列步驟(1)引物和探針的制備根據(jù)HCV全系列，在HCV(丙型肝炎病毒)基因組5’非編碼區(qū)(5’-UTR)，設(shè)計并合成如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2引物HCV-S5’-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’(nt52～nt75)引物HCV-AS5’-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3’(nt312～nt292)探針HCV-P15’-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3’(nt106～nt124)
探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt127～nt149)(2)制備反應(yīng)液反應(yīng)液每份為18μl，每份反應(yīng)液中含下列組分1×PCR Buffer(緩沖液)，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/LBSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)熒光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，并將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標(biāo)準(zhǔn)品各2μl，各加入步驟(2)制得的反應(yīng)液18μl，分別放入各個反應(yīng)管中進(jìn)行處理，同時設(shè)空白管和陰性對照；各反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增，將含待測樣品血清反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果與其他反應(yīng)管擴(kuò)增結(jié)果比較，得出待測樣品血清中丙型肝炎病毒核糖核酸的含量。
步驟(3)中擴(kuò)增是于Roche熒光定量檢測儀中進(jìn)行擴(kuò)增擴(kuò)增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預(yù)變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構(gòu)成一個循環(huán)，共進(jìn)行45個循環(huán)。
步驟(2)中制備標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA的質(zhì)量和濃度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/L dNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應(yīng)1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應(yīng)液23μl，PCR反應(yīng)液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，于PE9600擴(kuò)增儀進(jìn)行如下循環(huán)94℃預(yù)變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，循規(guī)30次，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產(chǎn)物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應(yīng)中有PCR膠回收產(chǎn)物3μl、連接緩沖液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(E.Coli，DH5α)，涂布于含X-gal和IPTG并具氨芐青霉素抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12h～16h至平皿上長出藍(lán)白斑，滅菌牙簽挑取白斑，置含50mg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200轉(zhuǎn)震搖過夜；取1.6ml過夜培養(yǎng)物抽提質(zhì)粒，EcoR I酶切初步鑒定，陽性克隆進(jìn)行測序分析，將篩選出的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，Sac I酶切使質(zhì)粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉(zhuǎn)錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應(yīng)，純化后用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確定量(連續(xù)測定5次，每次重復(fù)4管，取均值)，并進(jìn)行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標(biāo)準(zhǔn)品，-20℃保存，有效期一年。
在用EcoR I酶切初步鑒定時，20μl體系含2μl緩沖液，6μl質(zhì)粒DNA，2μlEcoR I和10μldd(double-distilled)H2O。
利用本發(fā)明方法對105例HCV抗體陽性和220例陰性樣本進(jìn)行檢測，陽性率分別為89.52％(94例)和2.72％(6例)，而同樣的樣本用匹基法和華美法檢測，匹基法的陽性率分別為71.42(75例)和0.9(2例)，華美法為69.52(73例)和2.27(5例)，由此可以看出，本發(fā)明大大提高了HCVRNA檢測的靈敏度低、特異性。
抗HCV陽性樣本105例，抗HCV陰性220例，兩探針法、匹基法和華美法檢測結(jié)果見表1。表1結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，抗HCV陰性與多探針法、華美法顯著性差異(P＜0.05)，抗HCV陽性與匹基法、華美法顯著性差異(P＜0.05)。
表1 105例抗HCV陽性220例抗HCV陰性三種方法結(jié)果的比較

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實施例方式一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的方法，包括下列步驟(1)引物和探針的制備根據(jù)HCV(丙型肝炎病毒)全系列(GenBank注冊號為AB114136)，在HCV(丙型肝炎病毒)基因組5’非編碼區(qū)(5’-UTR)，應(yīng)用Beacon Designer2.1軟件，設(shè)計如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2，并合成引物HCV-S5’-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’(nt52～nt75)引物HCV-AS5’-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3’(nt312～nt292)探針HCV-P15’-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3’(nt106～nt124)
探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt127～nt149)(2)制備反應(yīng)液反應(yīng)液每份為18μl，每份反應(yīng)液中含下列組分1×PCR Buffer(緩沖液)，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/LBSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)熒光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，并將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標(biāo)準(zhǔn)品各2μl，各加入步驟(2)制得的反應(yīng)液18μl，分別放入各個Roche反應(yīng)管中進(jìn)行處理，同時設(shè)空白管和陰性對照；各反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增，將含待測樣品血清反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果與其他反應(yīng)管擴(kuò)增結(jié)果比較，得出待測樣品血清中丙型肝炎病毒核糖核酸的含量(可根據(jù)HCVRNA標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出待測樣品中HCVRNA的準(zhǔn)確含量，同時還可分析標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)品實測值與換算值之間的差異以及實驗重復(fù)性)。
步驟(3)中擴(kuò)增是于Roche熒光定量檢測儀(lightcycle)中進(jìn)行擴(kuò)增擴(kuò)增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預(yù)變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構(gòu)成一個循環(huán)，共進(jìn)行45個循環(huán)。
步驟(2)中制備標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀(Eppendorf公司)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/L dNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應(yīng)1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應(yīng)液23μl，PCR反應(yīng)液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，于PE9600擴(kuò)增儀進(jìn)行如下循環(huán)94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循規(guī)30次，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產(chǎn)物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應(yīng)中有PCR膠回收產(chǎn)物3μl、連接緩沖液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(E.Coli，DH5α)，涂布于含X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)并具氨芐青霉素(Amp)抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12h～16h至平皿上長出藍(lán)白斑，滅菌牙簽挑取白斑，置含50mg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200轉(zhuǎn)震搖過夜；取1.6ml過夜培養(yǎng)物抽提質(zhì)粒，EcoR I酶切初步鑒定，陽性克隆進(jìn)行測序分析，將篩選出的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，Sac I酶切使質(zhì)粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉(zhuǎn)錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應(yīng)，純化后用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確定量(連續(xù)測定5次，每次重復(fù)4管，取均值)，并進(jìn)行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標(biāo)準(zhǔn)品，-20℃保存，有效期一年。
在用EcoR I酶切初步鑒定時，20μl體系含2μl緩沖液，6μl質(zhì)粒DNA，2μlEcoR I和10μlddH2O。
上述試劑中，Trizo購自Invitrogen公司，AMV、dNTPs、DNA聚合酶購自Promega公司。
權(quán)利要求
1.一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是包括下列步驟(1)引物和探針的制備根據(jù)HCV全系列，在HCV基因組5’非編碼區(qū)(5’-UTR)，設(shè)計并合成如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2引物HCV-S5’-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’(nt52～nt75)引物HCV-AS5’-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3’(nt312～nt292)探針HCV-P15’-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3’(nt106～nt124)探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt 127～nt149)(2)制備反應(yīng)液反應(yīng)液每份為18μl，每份反應(yīng)液中含下列組分1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/L BSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)熒光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，并將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標(biāo)準(zhǔn)品各2μl，各加入步驟(2)制得的反應(yīng)液18μl，分別放入各個反應(yīng)管中進(jìn)行處理，同時設(shè)空白管和陰性對照；各反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增，將含待測樣品血清反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果與其他反應(yīng)管擴(kuò)增結(jié)果比較，得出待測樣品血清中丙型肝炎病毒核糖核酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是步驟(3)中擴(kuò)增是于Roche熒光定量檢測儀中進(jìn)行擴(kuò)增擴(kuò)增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預(yù)變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構(gòu)成一個循環(huán)，共進(jìn)行45個循環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是步驟(2)中制備標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA的質(zhì)量和濃度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/LdNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應(yīng)1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應(yīng)液23μl，PCR反應(yīng)液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，于PE9600擴(kuò)增儀進(jìn)行如下循環(huán)94℃預(yù)變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，循規(guī)30次，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產(chǎn)物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應(yīng)中有PCR膠回收產(chǎn)物3μl、連接緩沖液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含X-gal和IPTG并具氨芐青霉素抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12h～16h至平皿上長出藍(lán)白斑，滅菌牙簽挑取白斑，置含50mg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200轉(zhuǎn)震搖過夜；取1.6ml過夜培養(yǎng)物抽提質(zhì)粒，EcoR I酶切初步鑒定，陽性克隆進(jìn)行測序分析，將篩選出的陽性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，SacI酶切使質(zhì)粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉(zhuǎn)錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應(yīng)，純化后用核酸蛋白紫外分析儀準(zhǔn)確定量，并進(jìn)行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標(biāo)準(zhǔn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是在用EcoR I酶切初步鑒定時，20μl體系含2μl緩沖液，6μl質(zhì)粒DNA，2μlEcoR I和10μlddH2O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兩探針實時熒光檢測丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，包括引物和探針的制備、制備反應(yīng)液、制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品、熒光定量檢測等步驟。本發(fā)明大大提高了HCVRNA檢測的靈敏度低、特異性。
文檔編號C12Q1/68GK1908627SQ20061004097
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月16日
發(fā)明者崔之礎(chǔ), 張冬雷, 施健, 黃竺筠 申請人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院