專利名稱：羅布麻與大葉白麻的dna分子鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及羅布麻與大葉白麻的DNA分子鑒別方法。
背景技術(shù)：
羅布麻是夾竹桃科(Apocynaceae)羅布麻屬(Apocynum)的一種多年生宿根草本植物，入藥歷史已逾千年，《中藥大辭典》羅布麻內(nèi)含類黃酮、強(qiáng)心甙、氨基酸等藥物成分，對預(yù)防和緩解高血壓、高血脂、冠心病、哮喘病、氣管炎等癥均有良好的作用；羅布麻葉片亦作茶用和煙用，據(jù)《中華人民共和國藥典》及《本草綱目》記載，羅布麻茶有平肝安神、清熱利水、止眩暈、消炎止咳、強(qiáng)心利尿等功能，羅布麻煙等可治療高血壓等癥。然而同樣俗稱“羅布麻”而非藥典收載的大葉白麻葉片也以同樣藥效和茶效等目的出現(xiàn)于市場，因此急需找到鑒別這兩種植物的方法。
植物中草藥及其偽品的鑒別方法較多，有從形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒別，有從特有的物質(zhì)進(jìn)行鑒別，有從特定的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒別，有利用指紋圖譜進(jìn)行鑒別等等，但這些鑒別方法均沒有通過基因分析鑒別來得重復(fù)性高，不受環(huán)境與人為條件影響。前人已從羅布麻與大葉白麻葉片的形態(tài)、顯微特征以及有效化學(xué)成份等方面做了一些鑒別研究，但形態(tài)解剖結(jié)果顯示羅布麻和大葉白麻葉兩面均可見柵欄組織，氣孔以同樣密度存在于兩面，氣孔微觀性狀十分相似，葉片質(zhì)地均屬草質(zhì)；而且羅布麻葉片在藥用和茶用時(shí)，還要經(jīng)過進(jìn)一步的加工處理，這更增加了形態(tài)鑒別的難度；前人也曾對兩種“羅布麻”葉中的類黃酮物質(zhì)種類和含量進(jìn)行過比較研究，但發(fā)現(xiàn)它們所含主要化學(xué)成份大同小異，且化學(xué)成份與含量易受環(huán)境、個(gè)體發(fā)育階段以及組織器官等的影響，準(zhǔn)確鑒定也存在相當(dāng)?shù)碾y度，因此采用基因分析方法對羅布麻與大葉白麻進(jìn)行鑒別是比較可行的方法。目前對于羅布麻與大葉白麻的基因分析鑒別方法尚沒有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。
測定并分析羅布麻和大葉白麻的trnL內(nèi)含子和trnL-F間隔區(qū)的具體序列可見，它們共有三個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生穩(wěn)定性變異[羅布麻的GenBank序列號為DQ463213(trnL內(nèi)含子)和DQ463212(trnL-F間隔區(qū))；大葉白麻的GenBank序列號為DQ463216(trnL內(nèi)含子)和DQ463217(trnL-F間隔區(qū))]，根據(jù)它們堿基位點(diǎn)的差異設(shè)計(jì)序列特異性引物以鑒別羅布麻和大葉白麻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羅布麻與大葉白麻的DNA分子鑒別方法。
本發(fā)明的目的是通過下列措施實(shí)現(xiàn)的羅布麻與大葉白麻的DNA分子鑒別方法，該方法通過分別提取羅布麻與大葉白麻待測樣品的基因組DNA，用提取的基因組DNA作為模板、利用特異性引物在兩個(gè)不同退火溫度的情況下進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)兩輪PCR產(chǎn)物的不同電泳行為進(jìn)行羅布麻和大葉白麻的鑒別。
所述的方法，其中特異性引物中上游引物是SEQ ID No.1，下游引物是SEQ ID No.2。
所述的方法中針對同一樣本進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，兩輪PCR反應(yīng)僅在退火溫度存在不同，分別為50～62℃和62.7℃，其余步驟相同。
所述的方法，其中根據(jù)兩輪PCR產(chǎn)物的不同電泳行為對羅布麻和大葉白麻進(jìn)行鑒別的判斷標(biāo)準(zhǔn)是第二輪PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，若電泳圖譜中沒有任何條帶，則所測樣品為羅布麻，若在220bp處有清晰單條帶，則所測樣品為大葉白麻。
所述的方法的具體步驟如下a.分別提取待測樣品的基因組DNA；b.利用引物SEQ ID No.1與引物SEQ ID No.2對提取的基因組DNA首先進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，50～62℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min；PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，若電泳圖譜中沒有任何條帶，則顯示所測樣品不是羅布麻或大葉白麻；如果在220bp處有清晰單條帶，則所測樣品為羅布麻或大葉白麻；c.若所測樣本已經(jīng)確定為羅布麻或白麻，而非其他植物，進(jìn)一步利用引物SEQ IDNo.1與引物SEQ ID No.2對提取的基因組DNA繼續(xù)進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，62.7℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min；PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，若電泳圖譜中沒有任何條帶，則所測樣品為羅布麻，若在220bp處有清晰單條帶，則所測樣品為大葉白麻。
上述的方法中提取待測樣品的基因組DNA的方法為稱取待測樣品干燥葉片15mg或新鮮葉片100mg于研缽中，加液氮充分研磨；在液氮未揮發(fā)干前連同液氮將材料轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，待液氮揮發(fā)后，加入0.5～1mL裂解液，該裂解液主要成分為濃度按重量體積百分比(mg/mL，下同)計(jì)均為2％的CTAB和SDS，同時(shí)還含有1.4mol/L NaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、pH 8.00.1mol/LTrisHCl，裂解時(shí)裂解液中還要加入DTT至終濃度為40mg/mL、10mg/mL RNaseA4～6μL、木瓜蛋白酶至終濃度40～60mg/mL，35～45℃條件下振蕩溫浴12～24h；將溶液轉(zhuǎn)入dolph管中，加入0.6～1mL體積比為25∶24∶1的酚-氯酚-異戊醇混合溶液，抽提5～10min后，7000g離心5min；上清再次用體積比為25∶1的氯仿-異戊醇混合溶液多次抽提直至兩相界面沒有白色物質(zhì)為止，取上清；向上清中加入上清體積1/10的1～3mol/L醋酸鈉以去除多糖，再在此基礎(chǔ)上加入4℃預(yù)冷的無水乙醇使乙醇終濃度達(dá)70％，或加入異丙醇使異丙醇終濃度達(dá)50％，-20℃冰箱中2～12h；15000g離心1min所得沉淀即為基因組DNA，加50～100L的TE溶解備用。
本發(fā)明的有益效果本技術(shù)通過提取檢測樣本的基因組DNA，并應(yīng)用特異性引物通過兩輪PCR，通過兩輪PCR產(chǎn)物的電泳行為，鑒別羅布麻與大葉白麻。該方法不受環(huán)境因素影響、與個(gè)體發(fā)育階段無關(guān)、沒有組織器官特異性、也不受實(shí)驗(yàn)時(shí)的人為影響，具有重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
以下實(shí)施例中提取樣品基因組DNA的方法是稱取樣品干燥葉片15mg或新鮮葉片100mg于研缽中，加液氮充分研磨；在液氮未揮發(fā)干前連同液氮將材料轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，待液氮揮發(fā)后，加入0.5～1mL裂解液，該裂解液主要成分為濃度均為2％的CTAB和SDS，同時(shí)還含有1.4mol/L NaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、pH 8.00.1mol/L Tris HCl，裂解時(shí)裂解液中還要加入DTT至終濃度為40mg/mL、10mg/mL RNaseA 4～6μL、木瓜蛋白酶至終濃度40～60mg/mL，35～45℃條件下振蕩溫浴12～24h；將溶液轉(zhuǎn)入dolph管中，加入0.6～1mL體積比為25∶24∶1的酚-氯酚-異戊醇混合溶液，抽提5～10min后，7000g離心5min；上清再次用體積比為25∶1的氯仿-異戊醇混合溶液多次抽提直至兩相界面沒有白色物質(zhì)為止，取上清；向上清中加入上清體積1/10的1～3mol/L醋酸鈉以去除多糖，再在此基礎(chǔ)上加入4℃預(yù)冷的無水乙醇使乙醇終濃度達(dá)70％，或加入異丙醇使異丙醇終濃度達(dá)50％，-20℃冰箱中2～12h；15000g離心1min，所得沉淀即為基因組DNA，加50～100L的TE溶解備用。
實(shí)施例1來源于新疆、內(nèi)蒙、河南、吉林等12省的羅布麻樣品47份和來源于新疆、甘肅、青海等三省的大葉白麻樣本17份(均通過專家鑒定)，首先通過提取基因組DNA后；利用引物SEQ ID No.1與引物SEQ ID No.2對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，50～62℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)所有樣品均在220bp處有清晰單條帶。
進(jìn)一步利用引物SEQ ID No.1與引物SEQ ID No.2對提取的基因組DNA繼續(xù)進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，62.7℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)所有大葉白麻樣本的電泳圖譜中在220bp處均有清晰單條帶，而在所有羅布麻樣本的電泳圖譜中均沒有清晰條帶。
實(shí)施例2分別從市場上購得兩種羅布麻茶以及兩份羅布麻干燥葉片共4份樣品。分別提取各樣品的基因組DNA。首先利用特異性引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，50～62℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，常規(guī)瓊脂糖電泳檢測，發(fā)現(xiàn)電泳圖譜中在220bp處均有清晰單條帶。顯示待檢測的4個(gè)樣品都是羅布麻或大葉白麻，而非其他種屬植物。
進(jìn)步利用引物SEQ ID No.1與引物SEQ ID No.2對提取的基因組DNA繼續(xù)進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，62.7℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)羅布麻干燥葉片樣品和一種羅布麻茶樣品在220bp處有清晰的單條帶，另一個(gè)羅布麻樣品茶在電泳圖譜中沒有發(fā)現(xiàn)條帶。說明市售的兩個(gè)羅布麻樣本以及一個(gè)羅布麻茶樣本的基源植物是大葉白麻，而非羅布麻。
序列表<110>南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院<120>羅布麻與大葉白麻的DNA分子鑒別方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>1actccatagt ctgttgatgc 20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工引物<400>2gggcgagtgt ataaggac 18
權(quán)利要求
1.羅布麻與大葉白麻的DNA分子鑒別方法，其特征在于該方法分別提取羅布麻與大葉白麻待測樣品的基因組DNA，用提取的基因組DNA作為模板、利用特異性引物在兩個(gè)不同退火溫度的情況下進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)兩輪PCR產(chǎn)物的不同電泳行為進(jìn)行羅布麻和大葉白麻的鑒別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的特異性引物中上游引物是SEQ IDNo.1，下游引物是SEQ ID No.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于針對同一樣本進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，兩輪PCR反應(yīng)僅在退火溫度存在不同，分別為50～62℃和62.7℃，其余步驟相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于根據(jù)兩輪PCR產(chǎn)物的不同電泳行為對羅布麻和大葉白麻進(jìn)行鑒別的判斷標(biāo)準(zhǔn)是第二輪PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，若電泳圖譜中沒有任何條帶，則所測樣品為羅布麻，若在220bp處有清晰單條帶，則所測樣品為大葉白麻。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法具體步驟如下a.分別提取待測樣品的基因組DNA；b.利用引物SEQ ID No.1與引物SEQ ID No.2對提取的基因組DNA首先進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，50～62℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min；PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，若電泳圖譜中沒有任何條帶，則顯示所測樣品不是羅布麻或大葉白麻；如果在220bp處有清晰單條帶，則所測樣品為羅布麻或大葉白麻；c.若所測樣本已經(jīng)確定為羅布麻或白麻，而非其他植物，進(jìn)一步利用引物SEQ IDNo.1與引物SEQ ID No.2對提取的基因組DNA繼續(xù)進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，62.7℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7min；PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，若電泳圖譜中沒有任何條帶，則所測樣品為羅布麻，若在220bp處有清晰單條帶，則所測樣品為大葉白麻。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于提取待測樣品的基因組DNA的方法為稱取待測樣品干燥葉片15mg或新鮮葉片100mg于研缽中，加液氮充分研磨；在液氮未揮發(fā)干前連同液氮將材料轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，待液氮揮發(fā)后，加入0.5～1mL裂解液，該裂解液主要成分為濃度均為2％的CTAB和SDS，同時(shí)還含有1.4mol/L NaCl、1％PVP、0.02mol/L EDTA、pH 8.0 0.1mol/L TrisHCl，裂解時(shí)裂解液中還要加入DTT至終濃度為40mg/mL、10mg/mL RNaseA4～6μL、木瓜蛋白酶至終濃度40～60mg/mL，35～45℃條件下振蕩溫浴12～24h；將溶液轉(zhuǎn)入dolph管中，加入0.6～1mL體積比為25∶24∶1的酚-氯酚-異戊醇混合溶液，抽提5～10min后，7000g離心5min；上清再次用體積比為25∶1的氯仿-異戊醇混合溶液多次抽提直至兩相界面沒有白色物質(zhì)為止，取上清；向上清中加入上清體積1/10的1～3mol/L醋酸鈉以去除多糖，再在此基礎(chǔ)上加入4℃預(yù)冷的無水乙醇使乙醇終濃度達(dá)70％，或加入異丙醇使異丙醇終濃度達(dá)50％，-20℃冰箱中2～12h；15000g離心1min所得沉淀即為基因組DNA，加50～100μL的TE溶解備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了羅布麻與大葉白麻的DNA分子鑒別方法。該方法分別提取羅布麻與大葉白麻待測樣品的基因組DNA，用提取的基因組DNA作為模板、利用特異性引物在兩個(gè)不同退火溫度的情況下進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)兩輪PCR產(chǎn)物的不同電泳行為進(jìn)行羅布麻和大葉白麻的鑒別。該方法不受環(huán)境因素影響、與個(gè)體發(fā)育階段無關(guān)、沒有組織器官特異性、也不受實(shí)驗(yàn)時(shí)的人為影響，具有重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK1944672SQ200610041148
公開日2007年4月11日 申請日期2006年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日
發(fā)明者陸長梅, 張衛(wèi)明, 顧龔平, 彭雪梅 申請人:南京師范大學(xué)