專利名稱：一種辣椒小孢子誘導(dǎo)獲得胚狀體的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及一種辣椒小孢子的游離、培養(yǎng)方法，尤其是一種辣椒小孢子誘導(dǎo)獲得胚狀體的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
通過小孢子培養(yǎng)可獲得單倍體植株。然后，經(jīng)秋水仙素加倍可獲得雙單倍體(二倍體純系)，即可直接獲得純系作為親本或育種的中間材料。游離小孢子培養(yǎng)是在單細(xì)胞水平上獲得純系的一種方法，獲得的純系系內(nèi)性狀整齊一致、世代間穩(wěn)定性強(qiáng)、具有高度的純合性。
單倍體在遺傳和育種上具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，單倍體育種技術(shù)的研究和應(yīng)用大大加速了選育新品種的進(jìn)程。如果在雜交育種中把雜交一代或二代已發(fā)生基因重組的單倍體配子或植株染色體經(jīng)人工加倍，就可以得到純合二倍體株系(DH株系)，不必再進(jìn)行多代連續(xù)自交選育純系，從而極大地縮短了育種周期。此外，DH株系中的雙單倍體植株也是進(jìn)行分子標(biāo)記和基因圖譜研究的理想材料。多年來，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)一直是國內(nèi)外細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一，越來越引起世界各國科研工作者的重視。不僅因?yàn)樗膶?shí)驗(yàn)體系對(duì)于認(rèn)識(shí)細(xì)胞全能性、發(fā)育遺傳機(jī)制等重大理論問題具有重要價(jià)值，而且在植物遺傳育種研究方面具有許多重要用途。
辣椒雜種優(yōu)勢十分明顯，雜種優(yōu)勢的利用已成為辣椒育種的主要途徑。選育綜合性狀優(yōu)良，抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、配合力高的純系是辣椒雜種優(yōu)勢利用的關(guān)鍵技術(shù)。辣椒屬常異花授粉作物，天然雜交率高，通過自交分離選育純系一般需要4～6代選擇才能獲得，不僅時(shí)間長，選擇效率差，而且基因之間存在顯隱性關(guān)系，因此很難選育出綜合性狀優(yōu)良、配合力高，適宜作為強(qiáng)優(yōu)勢組合親本的純系。開展辣椒小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究，對(duì)于選育強(qiáng)優(yōu)勢組合親本純系，加速育種進(jìn)程，培育強(qiáng)優(yōu)勢辣椒組合具有重要意義。
利用小孢子培養(yǎng)選育親本自交系(純系)已廣泛應(yīng)用于大白菜、甘藍(lán)等十字花科植物，然而目前尚未見從辣椒小孢子大量誘導(dǎo)獲得胚狀體進(jìn)而再生成植株的報(bào)道。眾所周知，從小孢子誘導(dǎo)胚狀體，再培育其發(fā)育成為單倍體植株是小孢子培養(yǎng)最為有效的途徑。胚狀體是起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)育過程形成胚狀結(jié)構(gòu)，它在最早發(fā)生時(shí)，即表現(xiàn)為一個(gè)具明顯兩極性的結(jié)構(gòu)。經(jīng)胚狀體誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株較通過愈傷組織途徑具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、基因型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。因此，胚狀體作為具有特定優(yōu)良遺傳性狀的個(gè)體的培養(yǎng)手段，具有特殊價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)辣椒小孢子培養(yǎng)中難于通過胚狀體途徑獲得單倍體植株的技術(shù)難題，提供一種辣椒小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體的培養(yǎng)方法，該方法能夠快速穩(wěn)定地獲得大量小孢子胚狀體。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種辣椒小孢子誘導(dǎo)獲得胚狀體的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1)確定試材選取具有綜合優(yōu)良性狀的雜交一代辣椒品種作為試驗(yàn)材料；(2)選取花蕾在開花初期或盛期，通過醋酸洋紅壓片法鏡檢選取處于單核靠邊期的花蕾，外觀形態(tài)特征表現(xiàn)為花冠與花萼等長或花冠稍長于花萼，定期摘除已開放的花朵，讓植株始終處于開花狀態(tài)；(3)花蕾預(yù)處理合適的花蕾用自封塑料袋盛裝后置于4℃低溫冰箱處理1～3天；(4)制備液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基所用的基本培養(yǎng)基均為Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基，所用的碳源為麥芽糖，其濃度為2％～3％；固體培養(yǎng)基添加的凝固劑為瓊脂，其濃度為0.6％～0.8％；固體培養(yǎng)基的組成成分為在Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基中，加入培養(yǎng)基重量的0.6％～0.8％瓊脂，2％～3％的麥芽糖，0.5％～1.0％的活性炭，pH 6.0；液體培養(yǎng)基的組成成分為在Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基中，加入2％～3％的麥芽糖，0.4～0.8mg/L的玉米素ZT，0.5mg/L～1.0mg/L的吲哚乙酸IAA，pH 5.8；(5)培養(yǎng)基的滅菌與分裝固體培養(yǎng)基于121℃，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘，液體培養(yǎng)基用裝有兩層微孔濾膜的塑料濾器過濾滅菌，保證培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)；滅菌后每一培養(yǎng)皿先注入固體培養(yǎng)基6ml，等固體培養(yǎng)基凝固后，再加入液體培養(yǎng)基3ml，進(jìn)行分裝；(6)花蕾消毒先用流水沖洗30分鐘，再用體積份數(shù)70％的酒精表面消毒30秒鐘，之后用體積分?jǐn)?shù)5％的次氯酸鈉消毒12～15分鐘，然后用無菌水沖洗4次，每次5分鐘；(7)無菌剝?nèi)』ㄋ幵跓o菌濾紙上用消過毒的鑷子剝?nèi)』ㄋ?，避免損傷、損壞花藥，并把花絲去除干凈；(8)花藥接種每一培養(yǎng)皿放入12枚花藥，用石蠟?zāi)し饪冢?9)花藥培養(yǎng)培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，在9℃條件下暗培養(yǎng)一周，后轉(zhuǎn)入白天25℃、夜間20℃的組織培養(yǎng)室，繼續(xù)暗培養(yǎng)；(10)小孢子的自然游離胚狀體形成在液固雙層培養(yǎng)系統(tǒng)下，花藥漂浮在上層的液體培養(yǎng)基上，經(jīng)過2～3周，花藥正常裂開，把小孢子釋放入培養(yǎng)基中；(11)胚狀體的發(fā)育形成培養(yǎng)4周后，肉眼可見球型胚和心型胚，培養(yǎng)7周后，可見魚雷型胚和子葉型胚，培養(yǎng)10周后，子葉型胚非常明顯，之后把子葉型胚轉(zhuǎn)入胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，形成完整植株。
再生植株經(jīng)細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定確定為小孢子發(fā)育的植株。
本發(fā)明突出的創(chuàng)新點(diǎn)在于實(shí)行液固雙層培養(yǎng)系統(tǒng)，采用麥芽糖作為碳源，低溫處理，連續(xù)黑暗培養(yǎng)，從而建立起一種辣椒小孢子培養(yǎng)胚狀體的新方法，通過此方法獲得的胚狀體高達(dá)1個(gè)胚狀體/花藥，且胚狀體生長發(fā)育正常，成苗率高。
本發(fā)明對(duì)辣椒小孢子培養(yǎng)胚狀體所采取的方法步驟簡單、實(shí)用，效率高，特別適用于辣椒細(xì)胞工程領(lǐng)域方面應(yīng)用。


圖1是小孢子培養(yǎng)4周后形成的胚狀體。
圖2是小孢子培養(yǎng)7周后形成的胚狀體。
圖3是小孢子培養(yǎng)10周后形成的胚狀體。
圖4是小孢子所形成胚狀體的繼代培養(yǎng)情況。
圖5是小孢子誘導(dǎo)的胚狀體再生成苗植株。
圖6是小孢子誘導(dǎo)的單倍體苗移栽成活(左)與正常的種子二倍體苗(右)生長情況。
圖7是小孢子誘導(dǎo)的單倍體植株的染色體(n＝12)。
圖8是小孢子誘導(dǎo)的雙單倍體植株的染色體(n＝24)。
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
依照本發(fā)明的技術(shù)方案，辣椒小孢子培養(yǎng)胚狀體的方法，具體實(shí)施步驟為(1)確定試材取具有綜合優(yōu)良性狀的雜交一代辣椒品種P51作為試驗(yàn)材料。
(2)選取花蕾在P51開花初期或盛期，通過醋酸洋紅壓片法[引自Dudu zkum cinek，Rukiye Tipirdamam.The effect of cold treatment andcharcoal on the in vitro androgenesis of pepper(Capsicum annuum L.).TurkJ Bot，2002，26131-139]鏡檢選取處于單核靠邊期的花蕾，花蕾外觀形態(tài)特征表現(xiàn)為花冠與花萼等長或花冠稍長于花萼，花蕾直徑5mm，長度7mm。定期摘除植株上已開放的花朵，讓其始終處于開花狀態(tài)。
(3)花蕾預(yù)處理合適的花蕾用自封塑料袋盛裝后置于4℃低溫冰箱處理1天。
(4)制備液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基所用的基本培養(yǎng)基均為Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基(引自H A Collin，G S Edwards.Plant Cell Culture.BIOS Scientific Publishers Limited，1998，pp20。具體組成成分詳見附表)，所用的碳源均為麥芽糖，其濃度為2％。固體培養(yǎng)基添加的凝固劑為瓊脂，其濃度為0.8％。
固體培養(yǎng)基的組成成分為Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基(Nitsch and Nitsch配方見附表)+0.8％瓊脂+2％麥芽糖+0.5％活性炭，pH 6.0；液體培養(yǎng)基的組成成分為Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基+2％麥芽糖+0.5mg/L ZT(玉米素)+0.8mg/LIAA(吲哚乙酸)，pH 5.8。
(5)兩種培養(yǎng)基的滅菌與分裝固體培養(yǎng)基于121℃，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘；液體培養(yǎng)基通過裝有0.45μm和0.22μm兩層微孔濾膜的直徑為25mm的塑料濾器過濾滅菌，其中濾膜和塑料濾器使用前需經(jīng)高壓滅菌。
每一培養(yǎng)皿(直徑60mm)先注入固體培養(yǎng)基6ml，待固體培養(yǎng)基凝固后，再用刻度移液管加入液體培養(yǎng)基3ml。
分裝、過濾除菌均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
(6)花蕾消毒先用流水沖洗30分鐘，再用體積分?jǐn)?shù)70％的酒精表面消毒30秒鐘，之后用體積分?jǐn)?shù)5％的次氯酸鈉消毒15分鐘，然后用無菌水沖洗4次，每次5分鐘。
(7)無菌剝?nèi)』ㄋ幵跓o菌濾紙上用消過毒的鑷子小心剝?nèi)』ㄋ帲苊鈸p傷、損壞花藥，并把花絲去除干凈。
(8)花藥接種每一培養(yǎng)皿放入12枚花藥(花藥來自不同的花蕾，以免花蕾的位置、大小、年齡等引起誤差)，用石蠟?zāi)?Parafilm)封口。
(9)花藥培養(yǎng)培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，在9℃條件下暗培養(yǎng)一周，后轉(zhuǎn)入白天25℃、夜間20℃的組織培養(yǎng)室，繼續(xù)暗培養(yǎng)。
(10)小孢子的自然游離和胚狀體形成在液固雙層培養(yǎng)系統(tǒng)下，花藥漂浮在上層的液體培養(yǎng)基上，經(jīng)過2周，花藥正常裂開，把小孢子釋放入培養(yǎng)基中。
(11)胚狀體的發(fā)育形成培養(yǎng)4周后，肉眼可見球型胚和心型胚(圖1)。培養(yǎng)7周后，可見魚雷型胚和子葉型胚(圖2)。培養(yǎng)10周后，子葉型胚非常明顯，之后把子葉型胚轉(zhuǎn)入胚萌發(fā)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，可見子葉轉(zhuǎn)綠，子葉展平，真葉出現(xiàn)，根系形成，形成完整植株(見圖3、4、5)。小孢子誘導(dǎo)的單倍體苗移栽成活(左)與正常的種子二倍體苗(右)生長情況參見圖6，再生成苗植株經(jīng)細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定以確定其倍性，即鑒定是單倍體還是二倍體。小孢子誘導(dǎo)的單倍體植株的染色體(n＝12)圖片見圖7，小孢子誘導(dǎo)的雙單倍體植株的染色體(n＝24)圖片見圖8。通過根尖壓片法(李懋學(xué)，張贊平.作物染色體及其研究技術(shù).北京中國農(nóng)業(yè)出版社.1996，pp231-233)，單倍體植株染色體數(shù)目為n＝12。單倍體相對(duì)于二倍體在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為葉片狹小，節(jié)間縮短，生活力弱，花蕾不結(jié)實(shí)。
需要說明的是，上述實(shí)施例選取雜交一代辣椒品種P51作為實(shí)驗(yàn)材料，但并不局限于該材料，該方法對(duì)于其他優(yōu)良性狀的雜交一代辣椒品種可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
附表Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基組成成分一覽表(mg/L)

權(quán)利要求
1.一種辣椒小孢子誘導(dǎo)獲得胚狀體的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1)確定試材選取具有綜合優(yōu)良性狀的雜交一代辣椒品種作為試驗(yàn)材料；(2)選取花蕾在開花初期或盛期，通過醋酸洋紅壓片法鏡檢選取處于單核靠邊期的花蕾，其外觀形態(tài)特征表現(xiàn)為花冠與花萼等長或花冠稍長于花萼，定期摘除已開放的花朵，讓植株始終處于開花狀態(tài)；(3)花蕾預(yù)處理合適的花蕾用自封塑料袋盛裝后置于4℃低溫冰箱處理1～3天；(4)制備液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基所用的基本培養(yǎng)基均為Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基，所用的碳源為麥芽糖，其濃度為2％～3％；固體培養(yǎng)基添加的凝固劑為瓊脂，其濃度為0.6％～0.8％；固體培養(yǎng)基的組成成分為在Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基中，加入培養(yǎng)基重量的0.6％～0.8％瓊脂，2％～3％的麥芽糖，0.5％～1.0％的活性炭，pH 6.0；液體培養(yǎng)基的組成成分為在Nitsch and Nitsch培養(yǎng)基中，加入2％～3％的麥芽糖，0.4～0.8mg/L的玉米素ZT，0.5mg/L～1.0mg/L的吲哚乙酸IAA，pH 5.8；(5)培養(yǎng)基的滅菌與分裝固體培養(yǎng)基于121℃，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘，液體培養(yǎng)基用裝有兩層微孔濾膜的塑料濾器過濾滅菌，保證培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)；滅菌后每一培養(yǎng)皿先注入固體培養(yǎng)基6ml，等固體培養(yǎng)基凝固后，再加入液體培養(yǎng)基3ml，進(jìn)行分裝；(6)花蕾消毒先用流水沖洗30分鐘，再用體積分?jǐn)?shù)70％的酒精表面消毒30秒鐘，之后用體積分?jǐn)?shù)5％的次氯酸鈉消毒12～15分鐘，然后用無菌水沖洗4次，每次5分鐘；(7)無菌剝?nèi)』ㄋ幵跓o菌濾紙上用消過毒的鑷子剝?nèi)』ㄋ?，避免損傷、損壞花藥，并把花絲去除干凈；(8)花藥接種每一培養(yǎng)皿放入12枚花藥，用石蠟?zāi)し饪冢?9)花藥培養(yǎng)培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，在9℃條件下暗培養(yǎng)一周，后轉(zhuǎn)入白天25℃、夜間20℃的組織培養(yǎng)室，繼續(xù)暗培養(yǎng)；(10)小孢子的自然游離胚狀體形成在液固雙層培養(yǎng)系統(tǒng)下，花藥漂浮在上層的液體培養(yǎng)基上，經(jīng)過2～3周，花藥正常裂開，把小孢子釋放入培養(yǎng)基中；(11)胚狀體的發(fā)育形成培養(yǎng)4周后，肉眼可見球型胚和心型胚，培養(yǎng)7周后，可見魚雷型胚和子葉型胚，培養(yǎng)10周后，子葉型胚非常明顯，之后把子葉型胚轉(zhuǎn)入胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，形成完整植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種辣椒小孢子誘導(dǎo)獲得胚狀體的培養(yǎng)方法，屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。該方法通過確定試材、選取花蕾、花蕾預(yù)處理、制備液固兩種培養(yǎng)基、兩種培養(yǎng)基的滅菌與分裝、花蕾消毒、無菌剝?nèi)』ㄋ?、花藥接種、花藥培養(yǎng)、小孢子的自然游離和胚狀體形成等步驟，獲得了小孢子胚狀體，且胚狀體能正常生長，成苗率高。本發(fā)明從開始培養(yǎng)到獲得胚狀體一般需要8周時(shí)間。本發(fā)明若應(yīng)用于育種實(shí)踐，必將大大加快育種進(jìn)程，顯著地提高選擇效果，節(jié)省大量人力、物力，是一項(xiàng)加速育種純系選育的有效方法。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1836496SQ20061004261
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月3日
發(fā)明者鞏振輝, 張菊平, 劉珂珂, 黃煒, 李大偉 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)