專利名稱：灰樹花菌株、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種一種生物材料——灰樹花菌株，其發(fā)酵產(chǎn)物及其提取物具有藥用功能的微生物，及其在灰樹花多糖，尤其是灰樹花β-葡聚糖生產(chǎn)、片劑、軟膠囊及硬膠囊劑等膠囊劑、水針和凍干粉針劑等注射劑生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1969年日本科學(xué)家千原吳朗發(fā)現(xiàn)香菇多糖具有抗腫瘤活性之后，各國科學(xué)家紛紛致力于真菌多糖在抗腫瘤領(lǐng)域的研究，開創(chuàng)了腫瘤生物治療，尤其是免疫治療的新領(lǐng)域，并取得突出進(jìn)展。在真菌多糖中，涌現(xiàn)出一大批療效顯著的多糖類抗腫瘤制劑。
宮崎利夫和大野尚仁(1984)發(fā)表了灰樹花子實(shí)體多糖具有抗腫瘤活性的報(bào)道之后，日本對(duì)灰樹花多糖的研究逐步深入。大野尚仁(1986)比較了液體培養(yǎng)的菌絲體多糖與子實(shí)體多糖的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)二者十分相似。指出通過液體培養(yǎng)菌絲體生產(chǎn)多糖的工藝條件較從子實(shí)體提取多糖溫和而簡(jiǎn)單，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。在藥理方面，大野尚仁報(bào)道了灰樹花多糖的抗腫瘤活性受巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用的影響，除對(duì)多種實(shí)體瘤有抑制作用外，對(duì)腹水瘤也同樣有效。
Takahiro.T等(1987)揭示了灰樹花多糖的抗腫瘤機(jī)制。灰樹花多糖對(duì)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞無直接細(xì)胞毒作用，但可增加對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用的腹腔滲出細(xì)胞和內(nèi)皮網(wǎng)狀細(xì)胞的數(shù)量，增加有細(xì)胞毒作用的T細(xì)胞的效應(yīng)。揭示了灰樹花多糖的抗腫瘤活性是通過宿主的中介反應(yīng)及巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的共同作用而實(shí)現(xiàn)的。
Iwao.S等(1989)報(bào)道了液體培養(yǎng)菌絲體多糖在抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)活性方面與子實(shí)體多糖有相似之處，可促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞的活性，同時(shí)促進(jìn)抗體反應(yīng)，腹腔滲出細(xì)胞(PEC)數(shù)量，白細(xì)胞介素1(IL-1)，酸性磷酸酶，PEC中附著細(xì)胞的吞噬能力均大大提高。同時(shí)，碳粒廓清能力也增加。這一發(fā)現(xiàn)為灰樹花多糖的發(fā)酵生產(chǎn)及其應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
水野卓(1991)報(bào)道了灰樹花糖蛋白的抗腫瘤活性，它具有抑制腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用，不僅注射有效，口服也同樣有效，而且其起效劑量低于純多糖。Nanba.H等(1995)報(bào)道，灰樹花多糖除具有免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤兩方面的功能外，還同時(shí)具有抗HIV病毒、降低血壓、降低血脂、降低血糖等方面的作用。
1986年，灰樹花人工栽培的成功，為灰樹花多糖的研究提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨后，大野尚仁等發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖是所發(fā)現(xiàn)的具有最強(qiáng)的抗腫瘤活性的真菌多糖之一。
灰樹花多糖的生產(chǎn)多以子實(shí)體為原料提取獲得。由于灰樹花子實(shí)體栽培困難，生物學(xué)產(chǎn)量低，質(zhì)量難以控制，使灰樹花多糖的開發(fā)生產(chǎn)受到極大限制。隨著灰樹花發(fā)酵工藝研究的不斷完善，使灰樹花菌絲體的大規(guī)模獲得成為可能，灰樹花多糖的藥理活性及其在腫瘤治療和免疫調(diào)節(jié)方面的價(jià)值也不斷得到揭示。但由于生產(chǎn)成本高，提取灰樹花多糖的純化問題得不到解決，尤其是適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的灰樹花菌株始終很難獲得，灰樹花多糖的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)展緩慢。
本發(fā)明所涉及的灰樹花菌株，通過野生菌分離純化，經(jīng)過長(zhǎng)期發(fā)酵培養(yǎng)馴化，克服了生長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)基生物利用率和生物轉(zhuǎn)化率低的缺點(diǎn)，具備了工業(yè)化生產(chǎn)用菌株的特性，為灰樹花多糖的應(yīng)用，特別是灰樹花β-葡聚糖的應(yīng)用，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種生物材料——灰樹花菌株，從其發(fā)酵產(chǎn)物中能夠獲得灰樹花多糖，尤其是灰樹花β-葡聚糖。
本發(fā)明所述的灰樹花菌株，命名為灰樹花Grifola frondosa(Dichs.ex Fr)S.F.Gray，GF-932，異名Polyporus frondosus(diks.)Fr.，是從野生環(huán)境天然菌株中分離篩選得到。該生物材料樣品保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市中關(guān)村北一條13號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No.1709，保藏日期為2005年5月11日。
上述灰樹花Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.)S.F.Gray的微生物分類學(xué)地位，屬于真菌門，擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬。
本發(fā)明所述菌株的培養(yǎng)特征斜面菌種培養(yǎng)基采用馬鈴薯瓊脂加富培養(yǎng)基，成分如下馬鈴薯200g；葡萄糖20g；磷酸二氫鉀1g；硫酸鎂0.5g；瓊脂20g；水1000mL；pH＝7.0在PDA平板培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)5～6d，菌落白色，從中心向外呈放射狀，菌絲貼生于培養(yǎng)基表面，中部稀疏，向外密集，粉狀至絮狀，直徑達(dá)8cm，背面灰白色。
在試管斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5～7d可長(zhǎng)滿斜面，菌絲白而粗壯，在上部沿斜面邊緣菌絲密集、厚、呈絮狀。
本發(fā)明所述菌株的形態(tài)特征在顯微鏡下，形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為菌絲無色、壁薄、平滑、具隔膜，分枝，無鎖狀聯(lián)合，寬2～3.2μm。液體培養(yǎng)基中糾集成團(tuán)，淺黃色球形或絮狀，邊緣呈絨毛狀，直徑1～4mm。
子實(shí)體肉質(zhì)，短柄，呈珊瑚狀分枝，末端生扇形至匙形菌蓋，重疊成叢；菌蓋直徑2～7cm，灰色至淺褐色。表面有細(xì)毛，老后光滑，有反射性條紋，邊緣薄，內(nèi)卷。菌肉厚白，厚2～7mm。菌管長(zhǎng)1～4mm，管孔延生，孔面白色至淡黃色，管口多角形，平均每毫米1～3個(gè)。孢子無色，光滑，卵圓形至橢圓形。菌絲壁薄，分枝，有橫隔。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述灰樹花菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基的組成。
液體培養(yǎng)用培養(yǎng)基馬鈴薯1～3％、麩皮提取物1～5％、葡萄糖1～5％、玉米粉0.3～2％、蛋白胨0.1～3％、酵母粉0.1～3％、磷酸二氫鉀0.01～1％、硫酸鎂0.05～1％。
本發(fā)明所述菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)特征發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)第1d，即可見大量細(xì)小菌絲球產(chǎn)生。培養(yǎng)第2d，菌絲增值迅速，培養(yǎng)基中有大量形狀不規(guī)則的菌絲球形成，菌絲球懸浮生長(zhǎng)于液體培養(yǎng)基中，菌液黏稠，靜置僅有少量分層。培養(yǎng)第3d，菌絲體幾乎呈飽和狀態(tài)，靜置不分層，菌絲體形態(tài)有帶刺菌絲球、絮簇菌絲球和顆粒菌絲球。3～5d即可完成一個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)周期。
該菌株超過用于生產(chǎn)的傳代水平(6～9代)后，斜面培養(yǎng)生長(zhǎng)速度無明顯變化，液體培養(yǎng)過程中菌絲體生長(zhǎng)速度也無明顯變化，菌絲體收率和多糖得率也無明顯下降的趨勢(shì)，說明該菌株在生產(chǎn)限定傳代內(nèi)性能穩(wěn)定。
灰樹花菌株的發(fā)酵條件參數(shù)為三級(jí)發(fā)酵，發(fā)酵罐放大比例為1∶10。種子罐和發(fā)酵罐的裝料系數(shù)為50～80％，液體種子接種量為5～10％(V/V)。培養(yǎng)條件培養(yǎng)基C/N為20～30∶1，pH值4～7，溶解氧含量10～100％，溫度24～29℃，罐內(nèi)壓力0.5～1.5Mp，攪拌轉(zhuǎn)速100～600r/min。
上述特征表明，本發(fā)明所述的灰樹花菌株與樹花屬的其他真菌有很大的不同，與其他用于食用菌栽培的灰樹花菌株也有顯著差異。主要不同點(diǎn)在于，無論在固體培養(yǎng)基上，還是在液體培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)速度異常迅速。本菌株適合于液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體產(chǎn)量高，對(duì)培養(yǎng)基的利用率高，多糖等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量高，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述灰樹花菌株其發(fā)酵產(chǎn)物中的灰樹花多糖，尤其是提供灰樹花β-葡聚糖在片劑、膠囊劑、注射劑等生產(chǎn)方面的應(yīng)用途徑。
利用本發(fā)明所述菌株發(fā)酵獲得灰樹花多糖和灰樹花β-葡聚糖的工藝流程發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，回收發(fā)酵液分離胞外多糖。濾出的菌絲體真空干燥并超微粉碎，脫脂后用熱水提取，殘?jiān)萌跛岷蛪A分別提取。分別對(duì)提取物進(jìn)行濃縮醇沉，真空干燥即得灰樹花多糖和糖蛋白。取其中含有β-葡聚糖的提取物，除蛋白后用分離出灰樹花β-葡聚糖。
通過上述工藝流程獲得的灰樹花多糖、糖蛋白和灰樹花β-葡聚糖，除具有真菌多糖的一般藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤和對(duì)放化療的增效減毒作用外，還具有灰樹花多糖特有的藥理活性，如抗病毒、體外抗腫瘤活性、腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性、抗炎鎮(zhèn)痛活性等。
另一個(gè)重要的特點(diǎn)在于，本發(fā)明所述的灰樹花菌株，其代謝產(chǎn)物灰樹花多糖不僅注射有效，而且口服也有效。
利用本發(fā)明所述菌株發(fā)酵獲得的灰樹花多糖和灰樹花β-葡聚糖可應(yīng)用于保健食品、化妝品和藥品等生產(chǎn)領(lǐng)域，可應(yīng)用于片劑、硬膠囊和軟膠囊等膠囊劑的生產(chǎn)，也可用于水針和凍干粉針等注射劑的生產(chǎn)。


附圖1為本發(fā)明所述菌株的菌絲體和菌球顯微形態(tài)圖(Olympus顯微鏡，100X、40X)。
附圖2為本發(fā)明所述菌株得到的灰樹花β-葡聚糖的紅外吸收光譜圖。
附圖3為本發(fā)明所述菌株得到的灰樹花β-葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1菌體培養(yǎng)傳代培養(yǎng)方法采用斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯瓊脂加富培養(yǎng)基，成分如下馬鈴薯200g；葡萄糖20g；磷酸二氫鉀1g；硫酸鎂0.5g；瓊脂20g；水1000mL；VB1適量，pH自然。
斜面菌種培養(yǎng)基按常規(guī)方法制作；接種培養(yǎng)，按無菌操作要求，于無菌室超凈臺(tái)上，采用雙斜面接種法接種。接種后，置27±1℃培養(yǎng)1d，即可看到從移接的組織塊周圍先長(zhǎng)出匍匐狀菌絲和基內(nèi)菌絲，然后由匍匐狀菌絲伸長(zhǎng)成氣生菌絲，也有直接伸長(zhǎng)成氣生菌絲的。4～7d后，幼嫩的菌絲長(zhǎng)滿斜面，菌絲體呈白色絨毛狀，粗壯發(fā)達(dá)，后期呈氈狀。
實(shí)施例2搖瓶培養(yǎng)液體培養(yǎng)用培養(yǎng)基馬鈴薯1％、麩皮1％、葡萄糖2％、玉米粉0.7％、蛋白胨0.3％、酵母粉0.14％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂0.1％。
制備培養(yǎng)基裝入錐形瓶中，裝料系數(shù)為0.2～0.4，棉塞封口，滅菌。按裝料量的5～10％(V/V)接種灰樹花菌種，置搖床培養(yǎng)。溫度25～30℃、轉(zhuǎn)速90～150r/min。培養(yǎng)2d可見大量新生菌絲球產(chǎn)生，3～5d后液體培養(yǎng)基中即有大量菌絲形成，菌絲懸浮生長(zhǎng)于液體培養(yǎng)基中，形態(tài)有分枝菌絲、絮簇菌絲物、顆粒菌絲物。
按上述方法培養(yǎng)3～5d，灰樹花菌絲體產(chǎn)量為9～15g/100mL。胞內(nèi)多糖產(chǎn)率8～12％(W/W)，胞外多糖產(chǎn)率0.5～1％(W/V)。
實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)三級(jí)發(fā)酵，發(fā)酵罐放大比例為1∶10。種子罐和發(fā)酵罐的裝料系數(shù)為50～80％，液體種子接種量為5～10％(V/V)。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)基C/N為20～30∶1，pH值4～7，溫度24～29℃，罐內(nèi)壓力0.5～1.5Mp，攪拌轉(zhuǎn)速100～600r/min，溶解氧含量10～100％。
發(fā)酵罐逐級(jí)放大，在含有充足氮源和碳源的合成或半合成培養(yǎng)基中，灰樹花菌絲體可以在有氧條件下大量生長(zhǎng)繁殖，使菌絲量不斷積累。種子罐生長(zhǎng)周期24～48h，發(fā)酵罐生長(zhǎng)周期36～72h。用連續(xù)放大的方式可在幾天內(nèi)使其生物量成百倍的增長(zhǎng)，在3～5d的時(shí)間內(nèi)即可完成一個(gè)生長(zhǎng)周期。
發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，菌絲體得率1～2％，多糖得率5～8％，β-葡聚糖得率1～3％。
權(quán)利要求
1.一種灰樹花菌株，其特征是命名為灰樹花Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.)S.F.Gray，菌種編號(hào)GF-932，異名Polyporus frondosus(diks.)Fr.，現(xiàn)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1709。
2.按照權(quán)利要求1所述的灰樹花菌株GF-932，其特征是在PDA培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)6d，菌落白色，從中心向外呈放射狀，菌絲貼生于培養(yǎng)基表面，中部稀疏，向外密集，粉狀至絮狀，直徑達(dá)8cm，背面灰白色。在試管斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d可長(zhǎng)滿斜面，菌絲白而粗壯，在上部沿斜面邊緣菌絲密集、厚、呈絮狀。
3.按照權(quán)利要求1所述的灰樹花菌株GF-932的培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)方式為液體深層發(fā)酵，在500～1000ml錐形瓶中搖瓶制種，溫度25～30℃、轉(zhuǎn)速90～150r/min，培養(yǎng)周期72～96h。在三級(jí)發(fā)酵罐中逐級(jí)培養(yǎng)放大，液體種子接種量5～10％，通氣攪拌，溶氧量控制在10～100％之間，一級(jí)罐和二級(jí)罐發(fā)酵周期20～30h，三級(jí)罐發(fā)酵周期36～72h。
4.按照權(quán)利要求1所述的灰樹花菌株GF-932的培養(yǎng)方法，其特征是灰樹花菌株GF-932在馬鈴薯葡萄糖麥麩汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述的馬鈴薯葡萄糖麥麩汁培養(yǎng)基，含馬鈴薯1～3％、麩皮提取物1～5％、葡萄糖1～5％、玉米粉0.3～2％、蛋白胨0.1～3％、酵母粉0.1～3％、磷酸二氫鉀0.01～1％、硫酸鎂0.05～1％。
5.按照權(quán)利要求1所述的灰樹花菌株GF-932所產(chǎn)生的灰樹花β-葡聚糖，其特征是GF-932灰樹花菌種經(jīng)液體培養(yǎng)后得到的β-葡聚糖多為β(1-3)分支的β(1-6)葡聚糖(見附圖3)，分子量50 000～1 000 000Dalton，分子量分布寬度1.5～2.5，并含有少量的結(jié)合蛋白。有引濕性；在水中易溶解，在溶解度達(dá)30～40mg/mL時(shí)溶液變黏稠，最大可溶解140～160mg/mL；不溶解于丙酮、氯仿、乙醚。無固定熔點(diǎn)，在溫度達(dá)250℃～260℃以上時(shí)開始炭化。硫酸-苯酚特征鑒別反應(yīng)呈黃棕色，在490nm處有最大吸收峰，硫酸-蒽酮特征鑒別反應(yīng)呈藍(lán)綠色，于620nm附近有最大吸收峰；紫外吸收掃描無明顯的特征吸收峰，紅外光譜圖中在840cm-1波數(shù)左右無吸收，在895cm-1波數(shù)附近有弱的特征吸收峰(見附圖2)，核磁共振1H-NMR圖譜中，H1信號(hào)均小于4.80ppm。與50mg/L的剛果紅溶液結(jié)合，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯紅移。該β-葡聚糖結(jié)構(gòu)新穎，具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)高壓滅菌后仍能保持其生物活性，在強(qiáng)堿中也具有很好的穩(wěn)定性。
6.按照權(quán)利要求5所述的灰樹花多糖和灰樹花β-葡聚糖，其特征是除具有免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤作用外，還具有灰樹花多糖特有的藥理活性，如對(duì)放化療的增效減毒作用、抗病毒、體外抗腫瘤活性、腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性、抗炎鎮(zhèn)痛活性等。
7.按照權(quán)利要求5所述的灰樹花多糖和灰樹花β-葡聚糖的應(yīng)用范圍，其特征是可用于片劑、硬膠囊和軟膠囊等膠囊劑的生產(chǎn)，也可用于水針和凍干粉針等注射劑的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種其發(fā)酵產(chǎn)物的提取物具有藥用功能的微生物，一種藥食兩用真菌灰樹花GF－932[Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.)S.F.Gray]，該微生物的培養(yǎng)方法，及其在灰樹花多糖，尤其是灰樹花β－葡聚糖的生產(chǎn)，包括灰樹花多糖在片劑、軟膠囊和硬膠囊等膠囊劑、水針和凍干粉針等注射劑生產(chǎn)方面的應(yīng)用。該灰樹花菌株由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No.1709。本發(fā)明所述的灰樹花菌株是從野生環(huán)境天然子實(shí)體中分離篩選并經(jīng)過長(zhǎng)期馴化獲得，遺傳性狀穩(wěn)定，能夠人工發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花β－葡聚糖等多糖，生長(zhǎng)速度快，周期短，菌絲體和多糖產(chǎn)率高，適合大規(guī)模液體深層培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12P19/08GK1880444SQ20061004394
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者徐澤平, 王寶琴 申請(qǐng)人:徐澤平, 王寶琴