專利名稱：半滑舌鰨雌性特異aflp片段及遺傳性別鑒定的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術(shù)，是一種能在魚類單性育種中應(yīng)用的魚類遺傳性別鑒定的分子生物學(xué)方法。
背景技術(shù)：
我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差異，例如，羅非魚雄性比雌性生長快約40％以上，而牙鲆和半滑舌鰨等海水魚類，雌性個體比雄性個體生長快40％-100％，因此，開展這些魚類遺傳性別檢測和性別控制的研究，既有重要的科學(xué)意義，又有重大的應(yīng)用潛力和推廣前景。
半滑舌鰨(Cynoglossus semiliaevis)是我國特有的一種名貴經(jīng)濟海水魚類，屬于近海溫水性底層魚類，我國沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由于其味道鮮美，肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極高，養(yǎng)殖前景非常廣闊。近2年來，半滑舌鰨人工育苗技術(shù)獲得突破，年產(chǎn)半滑舌鰨苗種近百萬尾，但研究表明，半滑舌鰨雌性個體和雄性個體，在生長速率上存在巨大差別，其雌性個體比雄性個體大2-3倍(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性個體生長過慢，降低了半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加了養(yǎng)殖成本，因而嚴(yán)重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成，由于難以鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，嚴(yán)重影響了半滑舌鰨雌核發(fā)育和性別控制研究的進行。
有關(guān)魚類性別鑒定方法的研究，目前只是在少數(shù)幾種魚類上進行過。加拿大西溫哥華實驗室的Devlin(1994)找到了大鱗大馬哈魚Y染色體特異的DNA片段；英國的Griffiths等(2000)在三椎棘魚(Gasterosteusaculeatus L.)中找到了兩個雄性特異的AFLP標(biāo)記，但是，當(dāng)應(yīng)用于另外兩種棘魚時，卻不能正確的鑒定其性別。英國的Ezaz等(2004)用AFLP技術(shù)掃描尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus L.)基因組，找到3個Y染色體連鎖和一個X染色體連鎖的AFLP標(biāo)記，然而這些標(biāo)記卻不能鑒別沒有親緣關(guān)系的個體的性別，表明這些標(biāo)記和性別決定位點之間發(fā)生了重組。日本的Watanabe等(2005)利用AFLP技術(shù)，應(yīng)用EcoRI和MseI限制性內(nèi)切酶消化孔雀魚(Poecilia reticulata)的基因組DNA，篩選了32組引物組合，最后找到5個與性別決定位點相連鎖的標(biāo)記。后來他們又采了48個樣品對這幾個標(biāo)記進行驗證，發(fā)現(xiàn)性別表型和基因型之間并非完全一致，其中A2-218標(biāo)記在性別表型和基因型之間的一致性達到90％，是與性別聯(lián)系比較緊密的1個標(biāo)記。但有關(guān)鰨科魚類雌性特異DNA標(biāo)記和遺傳性別鑒定的PCR方法，目前國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克隆出半滑舌鰨雌性特異AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)片段，分析其序列，設(shè)計特異的PCR引物，建立半滑舌鰨遺傳性別鑒定的簡單有效的PCR檢測方法，為半滑舌鰨性別控制和全雌育種研究提供技術(shù)手段。
本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容如下包括兩個方面一、半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的克隆與序列分析；二、半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR方法。
一、半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的克隆與序列分析它的技術(shù)內(nèi)容包括1)半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的回收；2)雌性特異AFLP片段的克?。?)雌性特異AFLP片段的序列分析1)、雌性特異AFLP片段的回收選取能擴增出382bp雌性特異AFLP條帶的引物組合，進行AFLP擴增，擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用刀片切下含有382bp雌性特異DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用。
2)、AFLP片段的克隆將回收的雌性特異AFLP片段，克隆到pMD 18-T載體中，采用標(biāo)準(zhǔn)方法進行連接和轉(zhuǎn)化，采用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的長度，符合預(yù)期長度的樣品可以視為陽性克隆。
3)、序列分析選取陽性克隆，用ABI3730測序儀進行序列分析。將來自8個陽性克隆的雌性特異AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0進行多序列比對，其同源性為99.37％，表明各個個體得到的條帶是同一個序列。共有序列同源性比對和相似性搜索用BLAST軟件進行，在GenBank中沒有找到任何同源的序列。
二、半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR方法抽取待測半滑舌鰨魚的血液，提取基因組DNA，根據(jù)獲得的半滑舌鰨雌性特異片段的序列，設(shè)計1對特異引物，CseF382N1和CseF382C1。提取24個雌性個體和22個雄性個體的基因組DNA，用合成的特異引物進行PCR擴增。如果某個個體產(chǎn)生了特異片段，即可認(rèn)為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則被認(rèn)為是遺傳上的雄性個體。
本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點是本發(fā)明克隆了半滑舌鰨雌性特異的AFLP片段，進行了序列分析，從而將AFLP分子標(biāo)記轉(zhuǎn)換為SCAR標(biāo)記，設(shè)計了雌性特異片段的引物，首次建立了我國養(yǎng)殖魚類遺傳性別鑒定的常規(guī)PCR分析技術(shù)。該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點，為魚類性別控制和單性育種開辟了新的技術(shù)途徑，適宜在其它養(yǎng)殖魚類上推廣應(yīng)用，對養(yǎng)殖魚類單性育種具有重要意義和應(yīng)用價值。


圖1、半滑舌鰨雌性特異DNA片段的核苷酸序列圖2、半滑舌鰨雌性個體和雄性個體遺傳性別鑒定結(jié)果
具體實施例方式采用分子克隆技術(shù)，克隆出性別特異的AFLP片段，建立半滑舌鰨遺傳性別鑒定的常規(guī)PCR分析技術(shù)，這對于培育半滑舌鰨全雌苗種，進行全雌苗種養(yǎng)殖，提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，真正將半滑舌鰨開發(fā)為一個被廣大養(yǎng)殖戶接受的優(yōu)良養(yǎng)殖品種，推動半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及海水魚類養(yǎng)殖品種的更新?lián)Q代，具有重要的現(xiàn)實意義和巨大的經(jīng)濟效益。
下面通過‘半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的克隆及遺傳性別鑒定的PCR方法的建立’的實施例，結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進行詳細說明一、半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的克隆與序列分析，包括1、雌性特異AFLP片段的回收；2、AFLP片段的克?。?、序列分析。
1、雌性特異AFLP片段的回收根據(jù)雌性特異AFLP標(biāo)記的篩選結(jié)果，選取能擴增出382bp雌性特異AFLP條帶的引物組合，進行AFLP擴增，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，獲得382bp的雌性特異AFLP條帶，用無污染的刀片切下含有目的DNA片段的聚丙烯酰胺凝膠，加20μl超純水，4℃過夜溶解，得到了微量的DNA，回收目的片段備用。
2、AFLP片段的克隆采用商品化的pMD 18-T連接試劑盒將回收的雌性特異AFLP片段，克隆到pMD 18-T載體中，采用標(biāo)準(zhǔn)的CaCl2轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB培養(yǎng)皿，37℃過夜培養(yǎng)。次日，用滅菌的牙簽挑取單菌落，投入3ml LB(含氨卞青霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm過夜培養(yǎng)。然后采用PCR法篩選目的克隆，從每個樣品中取1μl菌液做為模板，用所對應(yīng)的選擇性擴增的引物和反應(yīng)程序進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的長度，符合預(yù)期長度的樣品可以視為陽性克隆。
3、序列分析選取陽性克隆，用ABI3730測序儀進行序列分析。將來自8個陽性克隆的雌性特異AFLP標(biāo)記的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0進行多序列比對，其同源性為99.37％，表明各個個體得到的條帶是同一個序列。共有序列同源性比對和相似性搜索用BLAST軟件進行，在GenBank中沒有找到任何同源的序列。半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的核苷酸序列(示于圖1)。
二、遺傳性別鑒定的PCR方法抽取待測半滑舌鰨魚的血液，提取基因組DNA，根據(jù)獲得的半滑舌鰨雌性特異片段的序列，設(shè)計1對特異引物，Cse-382N1和Cse382C1。提取24個雌性個體和22個雄性個體的基因組DNA，用合成的特異引物進行PCR擴增。優(yōu)化的25.0μl PCR反應(yīng)體系為2.5μl 10×PCR緩沖液，1.0μl2.5mM dNTP，2.0μl 10pM引物混合液，基因組DNA 0.8～1.5μl，雙蒸水16.3-17μl，Taq酶(5Us/μl)0.2μl。PCR反應(yīng)步驟為第一步在95℃變性5mins；第二步，95℃變性30s，53.5-54.5℃退火30s，72℃延伸60s，如此進行30個循環(huán)；第三步在72℃延伸5mins。如果某個個體產(chǎn)生了特異片段，即可認(rèn)為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則被認(rèn)為是遺傳上的雄性個體。PCR結(jié)果表明24個假定的雌性個體都擴增出性別特異的片段，而雄性個體都沒有擴增出該片段(圖2)。
序列表<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所<120>半滑舌鰨雌性特異AFLP片段及遺傳性別鑒定的PCR方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>358<212>DNA<213>半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)<400>1aattcactga cccctgagag cggcgaagtt aggcagttcg ctgagtccag tgcaaacatc 60aacgttctta tatgccaaca gactttagaa gccaagaatt atgtgtcata tttgttttga 120ctccaggttc agtttactta ggacaaactc agggatttga aatgacgagc aacatcttat 180cgcctcaagt gcacatgggt aaaaagatcc ttccgagcca gggctggaga aagcaggctt 240ctcaggtgac acagtgggtt tggccgagac tagttttaca atgatggtgc cacaaaaaaa 300gaaagggaaa ctctatgagt ggacacagac tgagacattt gtcgtgtgtg agttgtta 358
權(quán)利要求
1.一種半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的克隆與序列分析，其特征在于它的技術(shù)內(nèi)容包括如下三個方面1)雌性特異AFLP片段的回收；2)雌性特異AFLP片段的克隆；3)雌性特異AFLP片段的序列分析1)、雌性特異AFLP片段的回收選取能擴增出382bp雌性特異AFLP條帶的引物組合，進行AFLP擴增，擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用刀片切下含有382bp雌性特異DNA條帶的聚丙烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用；2)、雌性特異AFLP片段的克隆將回收的雌性特異AFLP片段，克隆到pMD 18-T載體中，采用標(biāo)準(zhǔn)的方法進行連接和轉(zhuǎn)化，采用常規(guī)PCR法篩選含有目的片段的克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的長度，符合預(yù)期長度的樣品可以視為陽性克?。?)、雌性特異AFLP片段的序列分析選取陽性克隆，用ABI3730測序儀進行序列分析；將來自8個陽性克隆的雌性特異AFLP標(biāo)記的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0進行多序列比對，其同源性為99.37％，表明各個個體得到的條帶是同一個序列；半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的序列為Primer CseF382N1ATTCACTGACCCCTGAGAGCGGCGAAGTTAGGCAGTTCGCTGAGTCCAGTGCAAACATCAACGTTCTTATATGCCAACAGACTTTAGAAGCCAAGAATTATGTGTCATATTTGTTTTGACTCCAGGTTCAGTTTACTTAGGACAAACTCAGGGATTTGAAATGACGAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTGCACATGGGTAAAAAGATCCTTCCGAGCCAGGGCTGGAGAAAGCAGGCTTCTCAGGTGACACAGTGGGTTTGGCCGAGACTAGTTTTACAATGATGGTGCCACAAAAAAAGAAAGGGAAACTCTATGAGTGGACACAGACTGAGACATTTGTCGTGTGTGAGPrimer CseF382C1
2.一種半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR方法，其特征在于它的方法是抽取待測半滑舌鰨魚的血液，提取基因組DNA，根據(jù)獲得的半滑舌鰨雌性特異片段的序列，設(shè)計1對特異引物，CseF382N1和CseF382C1，提取雌性個體和雄性個體的基因組DNA，用合成的特異引物進行PCR擴增，如果某個個體產(chǎn)生了特異片段，即可認(rèn)為這些魚為遺傳上的雌性個體，而沒有這些片段的個體則被認(rèn)為是遺傳上的雄性個體。
全文摘要
一種半滑舌鰨雌性特異AFLP片段及遺傳性別鑒定的PCR方法，包括雌性特異AFLP片段的回收、AFLP片段的克隆、序列分析以及半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR方法；建立了分離和克隆半滑舌鰨雌性特異AFLP片段的技術(shù)，獲得了雌性特異DNA片段，設(shè)計了特異的引物，將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，創(chuàng)建了半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR技術(shù)。本發(fā)明首次分離到半滑舌鰨雌性特異的DNA片段，查明了其DNA序列，建立了半滑舌鰨遺傳性別鑒定的PCR分析技術(shù)。本發(fā)明具有先進、高效、準(zhǔn)確、可靠的特點，在半滑舌鰨性別控制和單性苗種生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價值，同時在其它魚類遺傳性別鑒定和性別控制研究中也具有應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1880478SQ20061004417
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者陳松林, 李靜, 田永勝, 沙珍霞, 王清印, 莊志猛, 徐建勇 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所