專利名稱：一株可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌及其在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株惡臭假單胞菌及其應(yīng)用，尤其涉及一株可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物催化是新一代工業(yè)生物技術(shù)的主體，它是指在人為控制條件下于生物反應(yīng)器中利用生物催化劑實(shí)現(xiàn)特定生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程。這里所說(shuō)的生物催化劑包括酶、酶的復(fù)合體、細(xì)胞器、完整細(xì)胞，后者可以是生長(zhǎng)細(xì)胞、靜息細(xì)胞或死亡細(xì)胞。與一般的化學(xué)催化相比，生物催化過(guò)程具有催化效率高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)。生物催化一般在水中進(jìn)行，但是水并不是反應(yīng)理想介質(zhì)，因?yàn)樵诜磻?yīng)中許多底物或產(chǎn)物是水不溶性，如固醇類、脂類物質(zhì)，這會(huì)造成水相中底物或產(chǎn)物的濃度太低，從而由于底物濃度低和反饋抑制造成反應(yīng)速度和產(chǎn)率低下，還有些底物或產(chǎn)物在水中易分解，對(duì)這種底物或產(chǎn)物而言，在水相中反應(yīng)會(huì)有很多副反應(yīng)，甚至得不到到預(yù)期的產(chǎn)物。
雙液相反應(yīng)體系是指由兩種互不相容的液體構(gòu)成的反應(yīng)體系，如有機(jī)溶劑和水或者有機(jī)溶劑和有機(jī)溶劑，本發(fā)明涉及的雙液相反應(yīng)體系是指有機(jī)溶劑和水構(gòu)成的雙液相反應(yīng)體系。根據(jù)相似相容的原理，上述的水不溶的底物和產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中一般具有較高的溶解能力和較好的穩(wěn)定性，因而，對(duì)它們而言，在水相中加入合適的有機(jī)相構(gòu)成雙液相反應(yīng)體系，可以提高反應(yīng)的速率和反應(yīng)的效率，減少產(chǎn)物(底物)的抑制，便于產(chǎn)物的分離純化。而且，絕大多有機(jī)溶劑是有毒的，很多有機(jī)溶劑是殺菌劑，如酒精，甲醛等，用含有有機(jī)溶劑的雙液相體系作為反應(yīng)的介質(zhì)能避免微生物污染。但是，有機(jī)溶劑的生物毒性也給雙液相生物催化帶來(lái)了困難，它們會(huì)抑制微生物的能量代謝，和生理活動(dòng)，甚至使之裂解喪失生物學(xué)功能，從而破壞其生物催化活性或使之失活。
自1989年Inoue等人發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑耐受微生物以來(lái)，陸續(xù)有一些有機(jī)溶劑耐受微生物從溶劑污染的土壤或海底污泥等極端環(huán)境種分離出來(lái)，它們由于具有獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和獨(dú)特生理生化特性，而能夠在有機(jī)溶劑存在條件下，有的甚至可以在高濃度的有機(jī)溶劑存在時(shí)，保持代謝活力和細(xì)胞完整性，甚至生長(zhǎng)能力。這種微生物在生物催化中的應(yīng)用前景是顯而易見(jiàn)的，它們?cè)诜撬嗪碗p液相生物轉(zhuǎn)化中具有其他微生物無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。它們的應(yīng)用可以解決油水雙液相反應(yīng)體系和非水相反應(yīng)體系中生物催化劑的活性保持問(wèn)題。對(duì)那些需要輔酶再生或者能量再生的體系而言，它們不僅可以使催化劑活性得以保持，由于保持了微生物細(xì)胞的能量代謝和生理代謝功能，還可以使輔酶再生和能量再生變得簡(jiǎn)單易行。
從環(huán)境中直接分離到既能耐受有機(jī)溶劑又具有特定生理功能的微生物并非易事，而且，從環(huán)境中分離到的有機(jī)溶劑耐受的微生物還會(huì)具有一些不利于生物催化的特點(diǎn)，比如產(chǎn)生一些副產(chǎn)物等。因此對(duì)現(xiàn)有的各種微生物資源的特性進(jìn)行組合就變成了一種比較理性的選擇，比如可以利用基因工程的手段把特定的生物催化功能賦予溶劑耐受的微生物，使之同時(shí)具有溶劑耐受的特性和特定的生物催化功能。
二苯并噻吩、苯并噻吩及它們的衍生物是重要的環(huán)境污染源，是重油、減壓餾分油及渣油中的主要硫化物。它們，尤其是4-甲基二苯并噻吩(4-MDBT)和4，6-二甲基二苯并噻吩(4，6-DMDBT)等，熱穩(wěn)定性較高，是油品中最難脫除的硫化物。它們?cè)谌加椭写嬖?，?huì)隨著燃油的燃燒而氧化，產(chǎn)生大量的二氧化硫等毒性氣體，由此轉(zhuǎn)化成的大面積酸雨嚴(yán)重污染大氣和水源，破壞生態(tài)平衡，危害人類生存。硫化物的存在還會(huì)對(duì)煉油儲(chǔ)油設(shè)備造成腐蝕，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。二苯并噻吩及其衍生物，釋放到環(huán)境中以后，不易被降解，又具有生物毒性，會(huì)對(duì)水體，土壤造成污染，破壞生態(tài)環(huán)境。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多微生物，如紅球菌屬(Rhodococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)等，能夠沿著硫?qū)Ｒ煌緩浇到釪BT，即能夠把二苯并噻吩中的硫原子專一性的脫除，且不破壞二苯并噻吩原有的碳架結(jié)構(gòu)。硫?qū)Ｒ恍悦摿蛲緩街饕苫虼豥szABC編碼，它編碼三個(gè)酶，分別為DszA、DszB、DszC。另外，還有一個(gè)黃速還原酶基因DszD也與專一性脫硫有關(guān)，它為反應(yīng)提供必須的還原力，過(guò)表達(dá)該酶可提高脫硫的活力。
把這種專一性脫硫微生物應(yīng)用于脫除二苯并噻吩、苯并噻吩及它們的衍生物，相比與物理、化學(xué)法，具有操作壓力、溫度低，運(yùn)轉(zhuǎn)成本少，且不不破壞二苯并噻吩、苯并噻吩及它們的衍生物碳架有利于降解產(chǎn)物的回收利用，具廣闊的應(yīng)用前景。但是，由于二苯并噻吩、苯并噻吩及它們的衍生物是水不溶的，一般要在雙液相體系中進(jìn)行反應(yīng)，因而存在和雙液相反應(yīng)一樣的保持生物催化劑活力困難的問(wèn)題，而且，在雙液相體系中，為保持催化劑活力需要加入大量的水，這樣會(huì)增大處理體積，不利于產(chǎn)品的回收，從而使成本大幅度提高。
同非水相和雙液相生物催化反應(yīng)一樣，利用基因工程方法改造菌株獲得能耐受高油水比又有生物脫硫能力的菌株是解決這一問(wèn)題的明智手段。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足本發(fā)明要解決的問(wèn)題是，提供一株可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌，以及利用可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌進(jìn)行雙液相反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)在多種有機(jī)溶劑存在時(shí)降解有機(jī)硫化合物。
本發(fā)明提供了一株可耐受有機(jī)溶劑，又能通過(guò)硫?qū)Ｒ恍酝緩浇到舛讲⑧绶浴?-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的菌株，該菌命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4。該菌株于2006年1月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國(guó)武漢)，保藏中心編號(hào)為CCTCC No.M206011。
上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011具有如下生物學(xué)特性革蘭氏陰性桿菌，有極端鞭毛，有動(dòng)力，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜；在血瓊脂瓶板上形成大而濕潤(rùn)、灰色的菌落；在麥康凱瓊脂平板上呈無(wú)色較大、濕潤(rùn)的菌落；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈黃綠色；氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；分解葡萄糖、果糖、木糖，不分解蔗糖，葡萄糖O/F為氧化型；動(dòng)力試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)陽(yáng)性，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶陰性，不能液化明膠，42℃環(huán)境中不生長(zhǎng)，生長(zhǎng)后期階段培養(yǎng)物有惡臭。
上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能降解二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩。
上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能在高毒性有機(jī)溶劑對(duì)二甲苯中生長(zhǎng)，并能在庚醇、苯乙烯、對(duì)二甲苯、乙苯、環(huán)己烷、間二氯苯、二苯醚、異辛烷和正十二烷存在時(shí)保持降解能力。
上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的培養(yǎng)溫度為20～35℃，可在含有氨芐青霉素的LB和M187中生長(zhǎng)，也可以M9培養(yǎng)基中以二苯并噻吩作為唯一硫源生長(zhǎng)。
本發(fā)明所涉及的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在雙液相生物催化反應(yīng)中的應(yīng)用方法和步驟如下(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有0.5～1.5g/L氨芐青霉素的LB中，置20～35℃下，振蕩培養(yǎng)8～30小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有0.5～1.5g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積百分比為0.05～0.2％的對(duì)二甲苯，置于20～35℃下，振蕩培養(yǎng)8～30小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～20分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到5～15克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶5～20，加入50～300mg/L含硫化合物，在20～35℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，4～42小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心5～20分鐘，取1～5μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率。
其中，步驟(2)(3)中所述的種子細(xì)胞培養(yǎng)和制備催化劑細(xì)胞的優(yōu)選溫度是27～32℃；氨芐青霉素的濃度優(yōu)選為0.8～1.3克/升。
其中，步驟(2)中所述的種子細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是15～25小時(shí)。
其中，步驟(3)中所述的制備催化劑細(xì)胞中，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是10～15小時(shí)。
其中，步驟(3)中所述的制備催化劑細(xì)胞中，培養(yǎng)時(shí)添加對(duì)二甲苯的濃度優(yōu)選為體積百分比0.08～0.12％。
其中，步驟(5)中所述的菌體濃度優(yōu)選是每升6～10克干細(xì)胞重的菌體。
其中，步驟(6)中所述有機(jī)溶劑相與水相的體積比優(yōu)選為1∶7～15。
其中，步驟(6)中所述處理樣品的溫度優(yōu)選為27～32℃，樣品振蕩時(shí)間優(yōu)選為5～15小時(shí)。
其中，步驟(6)中所述的有機(jī)溶劑是指庚醇、苯乙烯、對(duì)二甲苯、乙苯、環(huán)己烷、間二氯苯、二苯醚、異辛烷和正十二烷之一；步驟(6)中所述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
上述固體M187培養(yǎng)基在上述M187培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基配方為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5gNH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
本發(fā)明所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011是用基因工程的方法構(gòu)建的。先從紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCCNo.M205068中克隆出專一性脫硫基因dszABCD然后把它們連接到寬宿主范圍載體pMMB66EH上，構(gòu)建出重組載體pMMABCD(如圖1所示)；然后用三親雜交把重組載體導(dǎo)入宿主菌中(如圖2所示)，經(jīng)過(guò)篩選得到惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011。
本發(fā)明所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011可以通過(guò)硫?qū)Ｒ恍酝緩浇到舛讲⑧绶浴?-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩，生成不破壞原含硫化合物碳架結(jié)構(gòu)的化合物2-羥基聯(lián)苯、2-羥基-3-甲基聯(lián)苯(2-羥基-3’-甲基聯(lián)苯)、2-羥基-3，3’-二甲基聯(lián)苯、2-異丙基苯酚。附圖3是3-甲基苯并噻吩經(jīng)過(guò)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011降解之后得到產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。
本發(fā)明采用的菌株惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能夠在50％以下的對(duì)二甲苯中生長(zhǎng)，能在10％以下的對(duì)二甲苯中生長(zhǎng)良好。該菌株在含10％的對(duì)二甲苯的LB中生長(zhǎng)21.5小時(shí)，生物量可達(dá)1.8克干細(xì)胞/升(如圖4所示)，這說(shuō)明該菌具有耐受對(duì)二甲苯的能力。對(duì)二甲苯的毒性很強(qiáng)，微量對(duì)二甲苯就能夠抑制微生物生長(zhǎng)，它廣泛的分布于各種污染環(huán)境中，燃油中也含有二甲苯，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的耐受對(duì)二甲苯的能力，為該菌株在雙液相反應(yīng)以及環(huán)境修復(fù)中應(yīng)用提供了前提。
本發(fā)明使用的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能夠在高濃度二甲苯存在時(shí)降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩，其降解二苯并噻吩的降解率可達(dá)99％，而在相同條件下其對(duì)照菌紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068幾乎不能降解任何上述含硫化合物(如圖5所示)，這表明惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCCNo.M206011在雙液相反應(yīng)中比未經(jīng)過(guò)改造的紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M20506有著巨大的優(yōu)勢(shì)，有著重要的應(yīng)有價(jià)值。
本發(fā)明所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能耐受多種有機(jī)溶劑，能在多種有機(jī)溶劑存在時(shí)降解有機(jī)硫化合物，比如能在多種有毒的有機(jī)溶劑存在時(shí)降解二苯并噻吩(如圖6所示)，其中許多有機(jī)溶劑存在時(shí)降解率都可以達(dá)到90％以上，如庚醇、二甲苯、乙基苯、環(huán)己烷、異辛烷和十二烷。在雙液相反應(yīng)中溶劑的種類要根據(jù)反應(yīng)類型，產(chǎn)物底物的性質(zhì)等因素來(lái)確定，往往要用到多種有機(jī)溶劑；石油和被污染的環(huán)境中含有的有機(jī)物更是紛繁復(fù)雜不盡其數(shù)，該菌株的這種對(duì)多種有機(jī)溶劑廣泛耐受的特性，在雙液相生物催化反應(yīng)以及環(huán)境治理過(guò)程中，都將具有重要的意義。


本發(fā)明提供的一株可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4，已于2006年1月15日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏中心，保藏地址湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵政編碼430072，其保藏編號(hào)為CCTCC No.M206011。
圖1重組載體pMMABCD的構(gòu)建過(guò)程圖；其中，基因操作使用普通大腸桿菌HB101進(jìn)行；(PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，(Ptac)乳糖啟動(dòng)子，(SD)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，(ori)復(fù)制起始區(qū)，(bla)氨芐青霉素抗性基因。
圖2重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌的流程圖。
圖3使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011降解3-甲基苯并噻吩的代謝產(chǎn)物得到的質(zhì)譜圖。
圖4惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在含有10％對(duì)二甲苯中生長(zhǎng)曲線；(■)600nm時(shí)的光密度(OD值)；(□)細(xì)胞干重。
圖5惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011和紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068在二甲苯中對(duì)二苯并噻吩的降解曲線；(■)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011，(○)紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068。
圖6惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在庚醇、苯乙烯、對(duì)二甲苯、乙苯、環(huán)己烷、間二氯苯、二苯醚、異辛烷和正十二烷中對(duì)二苯并噻吩的降解，從左到右有機(jī)溶劑的極性依次降低。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的構(gòu)建。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的Rhodococcus erythropolis IGTS8的專一脫硫基因，設(shè)計(jì)引物dszf5’CACTCTAGAAGGACGCATACGCG ATGACTC-3’(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶XbaI的酶切位點(diǎn))和dszr 5’-GATCAAAGCTTCA GATCCTCAGGAGGTGAA-3’(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶HindIII的酶切位點(diǎn))。用這兩個(gè)引物以常規(guī)方法提取的紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068的基因組DNA為模板使用常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法(PCR)擴(kuò)增專一性脫硫基因dszABC。擴(kuò)增后的基因連接到pMD18-T載體(大連寶生物工程公司生產(chǎn)的TA克隆載體)上，常規(guī)方法測(cè)序驗(yàn)證克隆的正確性。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的Rhodococcus erythropolis IGTS8的黃素還原酶基因序列設(shè)計(jì)引物dszDf5’-GAGGAATTCATGTCTGACAAGCCG AATGCC-3’(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點(diǎn))和dszDr 5’-CACTCTAGACTATTGACCTAACGGAGTCGG-3’(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶XbaI的酶切位點(diǎn))。用這兩條引物以常規(guī)方法提取的紅平紅球菌(Rhocooocous erythropolis)XP CCTCC No.M205068的基因組DNA為模板用常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法擴(kuò)增dszD片段，連接到pMD18-T載體(大連寶生物工程公司生產(chǎn)的TA克隆載體)上，常規(guī)方法測(cè)序驗(yàn)證克隆正確性。
用限制性內(nèi)切酶把dszD(EcoRI和XbaI)和dszABCD(XbaI和Hind III)從上述構(gòu)建的pMD18-T上切下來(lái)回收純化，用EcoRI和Hind III處理載體pMMB66EH(柏林自由大學(xué))，回收純化。把上述處理好的基因片段和載體用T4 DNA連接酶連接起來(lái)構(gòu)成重組載體pMMABCD(如圖1所示)，使用該重組載體轉(zhuǎn)化E.coli HB101得到轉(zhuǎn)化子命名為E.coli HB101/pMMABCD，用作供體菌。
無(wú)菌條件下把供體菌E.coli HB101/pMMABCD和輔助菌E.coli HB101/pRK2013(哥倫比亞大學(xué)微生物系)，接種到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，然后以4％接種量，轉(zhuǎn)接到新的無(wú)抗生素LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。受體菌Pseudomonas putida Idaho(NRRL B-18435)。與供體菌和輔助菌同時(shí)接入無(wú)抗生素LB中，30℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，以上三株菌培養(yǎng)好后，收集三種無(wú)抗生素LB中的培養(yǎng)物，置于離心管中，8,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，菌體用無(wú)菌生理鹽水重懸至原體積，再8,000轉(zhuǎn)/分鐘離心，重復(fù)兩次，最后用無(wú)滅菌生理鹽水重懸菌體至原來(lái)的體積，制成菌懸液。分別取上述供體菌懸液、輔助菌懸液、受體菌懸液400uL、400uL、2mL，混合起來(lái)，制成混合菌液，用無(wú)菌0.45um濾膜，過(guò)濾混合菌液，截留細(xì)菌，然后把濾膜平貼在無(wú)抗生素固體LB平板上，使濾膜無(wú)菌的平貼在固體LB平板中的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10小時(shí)，再轉(zhuǎn)移到30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10小時(shí)。培養(yǎng)完成后用無(wú)菌的鑷子取下濾膜，置于1mL無(wú)菌生理鹽水中，洗下菌體，用無(wú)菌涂布器把菌液均勻涂在含100mg/L氨芐青霉素的M9平板上30℃培養(yǎng)3～4天(流程見(jiàn)附圖2)，直至長(zhǎng)出大小合適的菌落。
上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用的受體菌Pseudomonas putida Idaho(NRRLB-18435)和輔助菌沒(méi)有氨芐青霉素耐受能力，不能在含有氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)，即在含有氨芐青霉素的M9平板上受體菌不能生長(zhǎng)，供體菌是大腸桿菌不能耐受檸檬酸鹽，在M9培養(yǎng)基中含有0.5％的檸檬酸鹽，因而供體菌也不能生長(zhǎng)，另外氨芐青霉素還能抑制許多環(huán)境中常見(jiàn)的細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)?；谶@兩點(diǎn)，對(duì)所得培養(yǎng)物用含氨芐青霉素和檸檬酸鹽的M9培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和純化，經(jīng)過(guò)幾輪篩選得到一些轉(zhuǎn)化子。
在無(wú)菌條件下把上述轉(zhuǎn)化子分別接種到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，提取各轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，瓊脂糖電泳檢測(cè)，挑選有重組載體pMMABCD存在的轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
在無(wú)菌條件下把上述含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種到含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，加入1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，8,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，用M9培養(yǎng)基洗菌體兩次，再用同樣體積的M9重懸菌體，加入92mg/L的二苯并噻吩，30℃振蕩12小時(shí)后，用Gibbs法測(cè)定各轉(zhuǎn)化子的反應(yīng)體系中是否有2-羥基聯(lián)苯生成。經(jīng)測(cè)定命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4的轉(zhuǎn)化子含有質(zhì)粒pMMABCD且能轉(zhuǎn)化二苯并噻吩為2-羥基聯(lián)苯。
上述構(gòu)建的菌株命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4，已于2006年1月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國(guó)武漢)，保藏中心編號(hào)為CCTCC No.M206011。
在上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的雙液構(gòu)建過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5gK2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011構(gòu)建的過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25g NaCl，0.5g NH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例2惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011的16S rDNA的擴(kuò)增和測(cè)序。
使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.5ml培養(yǎng)物，6,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心2分鐘；沉淀物加入565μl的TE緩沖液，TE緩沖液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調(diào)整pH為8.0，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，加入30μl質(zhì)量體積比為10％的十二烷基磺酸鈉(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1小時(shí)；加入100μl，5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，所述CTAB/NaCl溶液配方如下質(zhì)量體積比為10％的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混勻，于65℃溫育10分鐘；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一支新管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻直到DNA沉淀下來(lái)，用一個(gè)封口的離心管將沉淀轉(zhuǎn)移至1ml的70％乙醇中洗滌；12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心5分鐘，棄上清，用凍干機(jī)稍加干燥，重溶于50μl的TE緩沖液。以提取的基因組DNA為模板，利用購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)有限公司的真細(xì)菌引物27f和1492r，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在50μl反應(yīng)體系依次混勻下列試劑35μl H2O，5μl 10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)、100mmol/L的用鹽酸調(diào)整pH為8.8的Tris緩沖液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，4μl 25mmol/L MgCl2，1μl 4種dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CCTCC M206011的基因組DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。加入50μl礦物油再離心5秒鐘；將混合物在94℃加熱5分鐘。94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，總共30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)混合物擴(kuò)增充分，得到惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)CCTCCM206011的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將產(chǎn)物測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC M206011菌株16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為522bp，核苷酸序列如下caccgtggta accgtcctcc cgaaggttag actagctact tctggtgcaa cccactccca 60tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgaca ttctgattcg 120cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat 180cggttttgtg agattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctctgtaccg accattgtag 240cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc 300ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccataac gtgctggtaa ctaaggacaa 360gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat 420gcagcacctg tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg 480tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tccgaattaa aa 522上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例3惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011在水相中對(duì)含硫化合物的降解。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～20分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到10克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)處理樣品取30mL(5)中制備的休止細(xì)胞懸液，置于4個(gè)300mL搖瓶中，分別加入0.5mM的二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩，30℃振蕩反應(yīng)12小時(shí)，進(jìn)行樣品處理。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，在分別加入5mL乙酸乙酯，置于30℃振蕩30分鐘，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀分別檢測(cè)樣品中二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的殘留含量，使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分別檢測(cè)上述四種化合物的代謝產(chǎn)物，得出惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011可以通過(guò)硫?qū)Ｒ恍酝緩浇到舛讲⑧绶浴?-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩，生成不破壞原含硫化合物碳架結(jié)構(gòu)的化合物，分別為2-羥基聯(lián)苯、2-羥基-3-甲基聯(lián)苯(或2-羥基-3’-甲基聯(lián)苯)、2-羥基-3，3’-二甲基聯(lián)苯、2-異丙基苯酚，降解率分別為97％、80％、71％和53％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水相含硫化合物降解過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5mL金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水相含硫化合物降解過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800mL水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5gNH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例4利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度20℃，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)，細(xì)胞濃度5克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶5。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積比為0.05％的對(duì)二甲苯，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到5克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶5，加入92mg/L含硫化合物，在20℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，4小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為32％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5gNH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例5利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度27℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)，細(xì)胞濃度6克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶7。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積比為0.05％的對(duì)二甲苯，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到6克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶7，加入92mg/L含硫化合物，在27℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，10小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為78％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5g NH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例6利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)，細(xì)胞濃度8克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶9。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積比為0.05％的對(duì)二甲苯，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到8克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶9，加入92mg/L含硫化合物，在30℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，10小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為95％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5gNH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例7利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度32℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)，細(xì)胞濃度10克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶15。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積比為0.05％的對(duì)二甲苯，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到10克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶15，加入192mg/L含硫化合物，在32℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，10小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為83％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5gNH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例8利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間30小時(shí)，細(xì)胞濃度15克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶20。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積比為0.05％的對(duì)二甲苯，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到15克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶20，加入112mg/L含硫化合物，在35℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，30小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為41％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5gNH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例9利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-庚醇雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)，細(xì)胞濃度8克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶9。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積比為0.05％的對(duì)二甲苯，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到8克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶9，加入152mg/L含硫化合物，在30℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，10小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為97％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5gNH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例10利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-十二烷雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)，細(xì)胞濃度8克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶9。
(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有1g/L氨芐青霉素的LB中，置30℃下，振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有1g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積比為0.05％的對(duì)二甲苯，置于30℃下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到8克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶9，加入92mg/L含硫化合物，在30℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，10小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；上述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心10分鐘，取1μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為98％。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M187培養(yǎng)基配方為每升中加入10g酵母粉，10g蛋白胨，5g K2HPO4，10ml甘油，121℃濕熱滅菌20分鐘后，加入5ml金屬離子混合液，固體M187培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.5％的瓊脂。
上述金屬離子混合液配方為0.4g FeSO4，0.2g NaCl，0.4g MgSO4·7H2O，0.2gMnSO4·4H2O，溶于1L蒸餾水，用硫酸調(diào)pH至3.0以下，然后0.22um濾膜過(guò)濾除菌。
在上述利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)過(guò)程中使用的M9培養(yǎng)基培養(yǎng)為每800ml水中加入，0.5g檸檬酸三鈉121℃滅菌20分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至50℃以下，加入200ml 5×M9鹽溶液，固體M9培養(yǎng)基在上述配方基礎(chǔ)上，加入1.5％瓊脂。
上述5×M9鹽溶液配方每100ml水中加入，8.5g Na2HPO4，1.5g KH2PO4，0.25gNaCl，0.5g NH4Cl，121℃滅菌20分鐘。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例11利用紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068進(jìn)行的水-對(duì)二甲苯雙液相反應(yīng)，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間10小時(shí)，菌體濃度8克干細(xì)胞/升，對(duì)二甲苯與水相體積比為1∶9。
(1)菌株選擇選用紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068；(2)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下，取斜面上的菌苔，用接種環(huán)接2環(huán)于100mL含有質(zhì)量體積比為0.005％的二苯并噻吩的液體無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)40小時(shí)，制得種子液。然后以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100mL含有質(zhì)量體積比為0.005％的二苯并噻吩液體無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)42小時(shí)。
(3)休止細(xì)胞制備取步驟(2)所得的培養(yǎng)物5,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH 7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞。收集的細(xì)胞用磷酸緩沖液重懸，使菌體濃度達(dá)到8克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑。
(4)雙液相反應(yīng)在20ml反應(yīng)體系中，以(3)中制備的休止細(xì)胞懸液為水相，二甲苯為有機(jī)相，使有機(jī)相比例達(dá)到10％，加入92mg/L的二苯并噻吩，在30℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘，分別振蕩反應(yīng)42小時(shí)，每隔2小時(shí)取下一瓶，進(jìn)行樣品處理。
(5)樣品檢測(cè)以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心(4)中處理的樣品10分鐘，取1μl使用裝有火焰離子監(jiān)測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩的殘留含量，得出降解率為0。
在上述紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCC No.M205068培養(yǎng)中使用的液體基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 2克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.01％的DBT作為硫源。
上述固體斜面基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為上述液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
通過(guò)實(shí)施例6跟試試?yán)?1的比較，可以看到，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011能在1∶9的對(duì)二甲苯-水雙液相反應(yīng)體系中降解二苯并噻吩，降解率達(dá)95％，而在同等條件下紅平紅球菌(Rhocococcus erythropolis)XP CCTCCNo.M205068不能降解二苯并噻吩，說(shuō)明上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4CCTCC No.M206011具有更好特性，在雙液相反應(yīng)中比紅平紅球菌(Rhocococcuserythropolis)XP CCTCC No.M205068有更高的應(yīng)用價(jià)值。
序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學(xué)<120>一株可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌及其在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用<141>2006-2-21<211>512<212>DNA<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)<221>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011 16S rDNA<222>(1)…(522)<400>
caccgtggta accgtcctcc cgaaggttag actagctact tctggtgcaa cccactccca 60tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgaca ttctgattcg 120cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat 180cggttttgtg agattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctctgtaccg accattgtag 240cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc 300ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccataac gtgctggtaa ctaaggacaa 360gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat 420gcagcacctg tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg 480tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tccgaattaa aa 52權(quán)利要求
1.一株可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌，其特征在于該菌命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4，已于2006年1月15日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO.M206011。
2.如權(quán)利要求1所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌，其特征是，該菌為革蘭氏陰性桿菌，有極端鞭毛，有動(dòng)力，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜；在血瓊脂平板上形成大而濕潤(rùn)、灰色的菌落；在麥康凱瓊脂平板上呈無(wú)色較大、濕潤(rùn)的菌落；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈黃綠色；氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；分解葡萄糖、果糖、木糖，不分解蔗糖，葡萄糖O/F為氧化型；動(dòng)力試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)陽(yáng)性，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶陰性，不能液化明膠，42℃環(huán)境中不生長(zhǎng)，生長(zhǎng)后期階段培養(yǎng)物有惡臭；所述惡臭假單胞菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
3.權(quán)利要求1或2所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下(1)菌株選擇選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)A4 CCTCC No.M206011；(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無(wú)菌條件下接種到含有0.5～1.5g/L氨芐青霉素的LB中，置20～35℃下，振蕩培養(yǎng)8～30小時(shí)；(3)制備催化劑細(xì)胞以步驟(2)所得的培養(yǎng)物為種子，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到含有0.5～1.5g/L氨芐青霉素的M187培養(yǎng)基中，加入體積百分比為0.05～0.2％的對(duì)二甲苯，置于20～35℃下，振蕩培養(yǎng)8～30小時(shí)，得到催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物；(4)收集催化劑細(xì)胞取步驟(3)所得的催化劑細(xì)胞培養(yǎng)物，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～20分鐘，收集催化劑細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再以相同條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞；(5)休止細(xì)胞制備用M9培養(yǎng)基把步驟(4)收集的沉淀細(xì)胞重懸，使菌體濃度達(dá)到5～15克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的惡臭假單胞菌的懸濁液，也稱為生物催化劑；(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品在反應(yīng)體系中，以(5)中制備的休止細(xì)胞懸濁液為水相，以有機(jī)溶劑為有機(jī)相，使有機(jī)相與水相體積比是1∶5～20，加入50～300mg/L含硫化合物，在20～35℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)，4～42小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(7)樣品檢測(cè)(6)中處理的樣品先用6N的鹽酸酸化到pH值小于2.0，再以12,000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心5～20分鐘，取1～5μL上層有機(jī)相，使用裝有火焰離子檢測(cè)器的氣相色譜儀檢測(cè)樣品中二苯并噻吩，或4-甲基二苯并噻吩，或4，6-二甲基二苯并噻吩，或3-甲基苯并噻吩的殘留含量，得出降解率。
5.如權(quán)利要求4所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是27～32℃；培養(yǎng)時(shí)間是10～15小時(shí)。
6.如權(quán)利要求4所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中所述的對(duì)二甲苯體積百分比為0.08～0.12％。
7.如權(quán)利要求4所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)生物催化劑的菌體濃度是6～10克干細(xì)胞/升。
8.如權(quán)利要求4所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)中所述的有機(jī)相與水相的體積比為1∶7～15。
9.如權(quán)利要求4所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)中處理樣品的溫度為27～32℃，樣品振蕩時(shí)間為5～15小時(shí)。
10.如權(quán)利要求4所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)中所述的有機(jī)溶劑是指庚醇、苯乙烯、對(duì)二甲苯、乙苯、環(huán)己烷、間二氯苯、二苯醚、異辛烷和正十二烷之一；步驟(6)中所述的含硫化合物是指二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩之一。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，該菌株于2006年1月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國(guó)武漢)，保藏中心編號(hào)為No.M206011。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的可耐受有機(jī)溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其方法包括(1)菌株選擇，(2)種子細(xì)胞培養(yǎng)，(3)制備催化劑細(xì)胞，(4)收集催化劑細(xì)胞，(5)休止細(xì)胞制備，(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品，(7)樣品檢測(cè)；該菌株具有很強(qiáng)的耐受有機(jī)溶劑的能力，且具有較高的降解二苯并噻吩、4－甲基二苯并噻吩、4，6－二甲基二苯并噻吩和3－甲基苯并噻吩的能力，在雙液相反應(yīng)方面有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/40GK1861785SQ200610044410
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者許平, 陶飛, 于波, 馬翠卿, 馮進(jìn)輝, 李福利, 王穎, 蔡曉鳳, 周文娟, 曲徑遙 申請(qǐng)人:山東大學(xué)