專利名稱：乙型肝炎病毒耐藥基因突變的熒光定量pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的熒光定量降落PCR檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝炎是世界性傳染疾病，我國是公認(rèn)的肝炎大國，肝炎的患病率和發(fā)病率都居世界前列，尤其是乙型肝炎在全國范圍內(nèi)分布最廣。肝炎病毒的感染，不僅與急、慢性肝炎，還與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。我國是乙型病毒感染的高發(fā)區(qū)，約50％-70％的人群受過乙肝的感染，8％-12％的人群為乙肝病毒表面抗原攜帶者，多達(dá)1億人口。近些年來，通過接種乙肝疫苗在降低乙肝病毒感染方面發(fā)揮了重要作用，但乙肝的治療和診斷尚需進(jìn)一步的研究。
乙肝病毒持續(xù)感染的過程中，在自然或治療誘導(dǎo)下會出現(xiàn)各種變異，它在肝炎病毒表面抗原區(qū)S、前核心抗原pre-C、核心抗原區(qū)C、X區(qū)與聚合酶基因P區(qū)均有分布。不同位點(diǎn)的突變，可引起不同后果，如免疫逃避、疫苗逃避和抗病毒逃避，在臨床上表現(xiàn)為漏診、盲目用藥和延誤治療，最終導(dǎo)致患者病情加重。
聚合酶基因P區(qū)是最大的讀碼框架，編碼DNA的多聚酶蛋白。在該區(qū)有乙肝進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的活性部位酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天冬氨酸(D)-天冬氨酸(D)組成，而傳統(tǒng)的乙肝病毒藥物拉米夫定正是干擾病毒的復(fù)制結(jié)合位點(diǎn)。如果長期服用該藥物會出現(xiàn)耐藥性，使得血清中已經(jīng)陰轉(zhuǎn)的乙肝病毒DNA重新出現(xiàn)，肝功能異常，甚至伴有病情的突發(fā)。其原因是YMDD中的552位(M)蛋氨酸被(V)纈氨酸或(I)異亮氨酸取代，生成YV552DD或YI552DD，從而導(dǎo)致亞結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)變化，防礙了與拉米夫定的結(jié)合。Tanaka等發(fā)現(xiàn)在拉米夫定平均用藥約25月的36個病人中，25個病人DNA滴度升高，其中有18人出現(xiàn)乙肝的急性發(fā)作現(xiàn)象。在治療前或治療過程中及停藥前后對乙型肝炎病毒進(jìn)行耐藥突變檢測對于指導(dǎo)臨床用藥和判定療效，推測預(yù)后都有非常重要的意義。
鑒于YMDD基序中的M，在A基因型中位于552位，而在B和C基因型中為550位，在D基因型為539位，在E和G基因型為549位。為了消除這種基因型之間的差異，有學(xué)者基于HBV多聚酶RT區(qū)長度一致，均為344個氨基酸。并且起始于一個保守序列EDWGPCDEHG。進(jìn)而對其單獨(dú)命名。即L528M對應(yīng)rt L180M，M552V/I對應(yīng)M204V/I。
目前檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥突變的方法主要有基于PCR基礎(chǔ)上的限制性片段長度多態(tài)性分析、測序以及基因芯片等技術(shù)。上述方法都是基于PCR基礎(chǔ)上的操作，基因芯片技術(shù)操作煩瑣而且雜交過程中不可避免的存在假陽性問題，準(zhǔn)確度差；限制性片段長度多態(tài)性是在PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))基礎(chǔ)上對產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理，它要求PCR產(chǎn)物要足夠酶切使用，同時酶切產(chǎn)物要經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳來識別，檢測靈敏度大大降低。序列分析能精確地識別基因突變，但是對于混合感染株檢測則存在瓶頸。
熒光定量PCR技術(shù)具有實(shí)時監(jiān)測、定量和高通量檢測等特點(diǎn)，而且操作簡便，靈敏度高。熒光定量PCR分為基于Taqman(肽科曼)探針的定量PCR以及基于SyBrGreen(賽博綠)I染料的定量PCR，后者是在PCR反應(yīng)中加入SyBrGreen I染料，它能特異性地嵌入DNA雙鏈中，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；而從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。在一個體系內(nèi)，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。熒光定量PCR反應(yīng)過程中，隨著PCR產(chǎn)物的增加，產(chǎn)物與SyBrGreen I結(jié)合的量也增大，兩者結(jié)合后形成的熒光信號可被儀器檢測到，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)在于提供一種簡便的用于準(zhǔn)確檢測乙肝病毒拉米夫定耐藥基因突變的熒光定量PCR方法，以期指導(dǎo)臨床用藥。
本發(fā)明所述的一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，根據(jù)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關(guān)突變rtL180M、rtM204V/I，將突變位點(diǎn)分別設(shè)計在下游引物的3’端，上游引物為多聚酶區(qū)的一段保守的核苷酸序列。利用優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)程序，通過熒光定量PCR反應(yīng)，對從血清樣本提取的乙型肝炎病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)CT值和熔點(diǎn)曲線來檢測是否有突變發(fā)生。
上述的位于多聚酶區(qū)的上游引物序列為5’CCAATCACTCACCAACCTCT 3’，長度為20bp，分別與5條下游引物配對。5條下游引物中，兩條用于檢測rtL180M位點(diǎn)突變與否，另三條用于檢測rtM204V/I位點(diǎn)突變與否。
上述的優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)榻德銹CR(Touch-down PCR)程序94℃3分鐘1個循環(huán)，94℃20秒、75℃-55℃20秒、72℃30秒，共計40個循環(huán)。其中退火溫度隨著每一循環(huán)的進(jìn)行而遞減0.5℃，即經(jīng)40個循環(huán)后，退火溫度由原來的75℃退為55℃；熒光信號的收集設(shè)在每一循環(huán)的退火溫度。
本發(fā)明所述的一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，所述的熒光定量PCR反應(yīng)的緩沖液為1×PCR緩沖液包括50mmol/L Tris-CI(pH8.3)、50mmol/L KCI、Mg2+濃度為3.5mM；dNTP濃度為0.2mmol/L；Pfu DNA聚合酶濃度為1.25U；上、下游引物的濃度為0.2μmol/L，在PCR反應(yīng)中加入的SyBrGreen I染料終濃度為1×。
本發(fā)明優(yōu)良效果如下現(xiàn)有技術(shù)中影響熒光定量PCR檢測方法特異性的因素在于非特異性擴(kuò)增以及引物二聚體的存在，本發(fā)明通過采用Pfu(Pyrococcus furiosus，激烈火球菌)高保真DNA(脫氧核糖核苷酸)聚合酶、合適的引物以及引物濃度、提高退火溫度以及Touch-down PCR(降落PCR)等方法解決了非特異性擴(kuò)增問題。
該方法利用PCR反應(yīng)中引物在3’末端存在錯配時不能正確延伸的特點(diǎn)，將突變位點(diǎn)設(shè)計在熒光定量PCR引物的3’末端，采用合適的引物濃度，Touch-down PCR反應(yīng)程序，大大降低了由于引物3′端錯配所引起的非特異性擴(kuò)增。根據(jù)突變引物組與野生引物組擴(kuò)增Ct值的差異以及參考相應(yīng)的熔點(diǎn)曲線，能準(zhǔn)確、快速的識別拉米夫定耐藥基因突變。該發(fā)明能準(zhǔn)確快速地檢測乙肝病毒臨床標(biāo)本中DNA突變，同時亦適用于其它基因的突變檢測。


圖1和圖2分別是PU與YMDD-L(圖1)、180W-L(圖2)引物組合在55℃-72.0℃退火溫度范圍內(nèi)，Ct值隨退火溫度升高而逐漸變化的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。其中，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度，圖中平行且遠(yuǎn)離橫坐標(biāo)的直線代表熒光閾值。
圖3-圖14分別是采用180位點(diǎn)為野生型的重組載體，PU與180W-L或180M-L引物組合在不同PCR程序中的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線及其相應(yīng)的熔點(diǎn)曲線。其中，圖3、圖5、圖7、圖9、圖11和圖13分別為采用NT1、NT2、NT3、T1、T2、T3等PCR反應(yīng)程序所得到的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，其中，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光信號強(qiáng)度；圖4、圖6、圖8、圖10、圖12和圖14分別是圖3、圖5、圖7、圖9、圖11和圖13的相應(yīng)的熔點(diǎn)曲線，橫坐標(biāo)代表融解溫度，縱坐標(biāo)代表熒光信號變化率。
圖15-圖20分別是上游引物PU與180W(M)-L引物組合進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得到的擴(kuò)增曲線圖、熔點(diǎn)曲線和相應(yīng)的電泳圖譜；圖18、圖19、圖20分別為上游引物PU與YM(I/V)DD等引物組合進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得到的擴(kuò)增曲線圖、熔點(diǎn)曲線和相應(yīng)的電泳圖譜。圖17中泳道1，Marker 2000；2，目的片段(360bp)，圖20中泳道1，Marker 2000；2，目的片段(433bp)。圖15和圖18的橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光信號強(qiáng)度；圖16和圖19的橫坐標(biāo)代表融解溫度，縱坐標(biāo)代表熒光信號變化率。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
一、乙肝病毒熒光定量PCR拉米夫定耐藥基因突變引物的設(shè)計與合成利用Beacon Designer 2.1(分子信標(biāo)設(shè)計軟件2.1)設(shè)計熒光定量PCR拉米夫定耐藥基因突變引物。其中，突變和野生位點(diǎn)均位于下游引物的3’末端，多聚酶C功能區(qū)的M204野生型引物以及突變的M204V、M204I所對應(yīng)的下游引物分別為YMDD-L、YVDD-L、YIDD-L；多聚酶B功能區(qū)的L180以及突變的L180M的下游引物分別為180W-L、180M-L。上游引物PU是位于多聚酶的保守區(qū)域，用于和5條下游引物配對。其中，PU與180W-L、180M-L配對得到的PCR產(chǎn)物大小為360BP(Base Pair，堿基對)，與YMDD-L、YVDD-L、YIDD-L等下游引物配對得到的PCR產(chǎn)物大小為433BP。所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
400U10 5’ATTCCTCTTCATCCTGCTGC 3’PU5’CCAATCACTCACCAACCTCT 3’(327U20)180W-L5’GCACTAGTAAACTGAGCCAG 3’180M-L5’GCACTAGTAAACTGAGCCAT 3’YMDD-L5’CCCAATACCACATCATCCAT 3’YVDD-L5’CCCAATACCACATCATCCAC 3’YIDD-L5’CCCCAATACCACATCATCA 3’二、乙型肝炎病毒SyBrGreen I熒光定量PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化1.SyBrGreen I熒光定量PCR退火溫度的選擇為了降低非特異性擴(kuò)增，同時保證較高的擴(kuò)增效率，我們設(shè)定了55℃、56.3℃、58.3℃、61.2℃、65.6℃、68.7℃、70.8℃、72.0℃等8個退火梯度。擴(kuò)增體系為20μl，其中包括10×PCR緩沖液2.0μl2.5mM dNTP 1.6μlMgCI2(25mM) 2.8μlPU(5μM) 0.8μl
下游引物(5μM)0.8μlSyBrGreen I(10×) 2.0μlPfu酶(2.5u/μl) 0.5μl(Pfu DNA聚合酶)質(zhì)粒DNA 1.0μlH2O 8.5μl20μl其中10×PCR緩沖液的成分為500mM Tris-CI(pH8.3)，500mM KCI；下游引物分別為180W-L、YMDD-L；退火溫度梯度為55℃-72℃等8個梯度；其中，質(zhì)粒DNA是整合有乙肝病毒DNA的pGEM-T載體，經(jīng)測序分析該240及108位點(diǎn)均為野生型。Pfu DNA聚合酶購于天為時代公司，下同。
定量PCR擴(kuò)增采用Bio-Rad(伯樂)公司PTC-225PCR擴(kuò)增儀，程序?yàn)?4℃3分鐘1個循環(huán)；94℃20秒、55-72℃20秒(溫度梯度)、72℃30秒，共計40個循環(huán)。其中熒光信號的收集設(shè)置在55-72℃20秒的退火溫度循環(huán)中。
對于PU與YMDD-L引物組合組，在65.6℃、68.7℃、70.8℃、72.0℃等四個溫度梯度中沒有擴(kuò)增曲線，55℃、56.3℃、58.3℃、61.2℃相對應(yīng)的Ct值的平均值分別為20.9、22.1、22.9、24.7、30.65(圖1)。由圖可以看出，隨著退火溫度從55℃逐漸升高至61.2℃，PCR擴(kuò)增效率降低。兼顧PCR擴(kuò)增效率與保真性，我們采用60℃作為退火溫度。
對于PU與180W-L引物組合組，在68.7℃、70.8℃、72.0℃等三個溫度梯度中沒有擴(kuò)增曲線，55℃、56.3℃、58.3℃、61.2℃、65.6℃相對應(yīng)的Ct值的平均值分別為11.03、10.9、11.4、11.03、11(圖2)。由圖可以看出，退火溫度在55℃-65.6℃范圍內(nèi)，對PCR擴(kuò)增效率幾乎沒有影響。結(jié)合兩組實(shí)驗(yàn)，采用60℃作為退火溫度。
2.Touch-down PCR與非Touch-down PCR的SyBrGreen I熒光定量PCR比較分析為了比較分析Touch-down PCR與非降落PCR，以及退火或延伸時收集熒光信號對基因突變檢測的影響，我們設(shè)計了6個PCR反應(yīng)程序。
PCR程序1(NT1)94℃3分鐘1個循環(huán)；94℃20秒、60℃50秒，共計40個循環(huán)。該程序采用兩步法，其中熒光信號的收集設(shè)在每一循環(huán)的第二步。
PCR程序2(NT2)94℃3分鐘1個循環(huán)，94℃20秒、60℃20秒，72℃30秒，共計40個循環(huán)，熒光信號的收集設(shè)在每一循環(huán)的退火溫度。
PCR程序3(NT3)同程序2，但熒光信號的收集設(shè)在每一循環(huán)的退火溫度。
Touch-down PCR程序(T1)94℃3分鐘1個循環(huán)，94℃20秒、75℃50秒，共計40個循環(huán)。該程序采用兩步法，即延伸和退火溫度放在一起，其中延伸和退火溫度合并，并隨著每一循環(huán)的進(jìn)行而遞減0.5℃。熒光信號的收集設(shè)在每一循環(huán)的第二步。
Touch-down PCR程序2(T2)94℃3分鐘1個循環(huán)，94℃20秒、75℃20秒，72℃30秒，共計40個循環(huán)。該程序采用三步法，延伸溫度和退火溫度分開，其中退火溫度隨著每一循環(huán)的進(jìn)行而遞減0.5℃。熒光信號的收集設(shè)在每一循環(huán)的退火溫度。
Touch-down PCR程序3(T3)94℃3分鐘1個循環(huán)，94℃20秒、75℃20秒，72℃30秒，共計40個循環(huán)。該程序和Touch-down PCR程序2相同，但熒光信號的收集設(shè)在72℃延伸溫度。
PCR擴(kuò)增體系為20μl，其中包括10×PCR緩沖液2.0μl2.5mM dNTP 1.6μlMgCI2(25mM) 2.8μlPU(5μM) 0.8μl180W-L或180M-L(5μM) 0.8μlSyBrGreen I(10×)2.0μlPfu酶(2.5u/l)0.5μl質(zhì)粒DNA 1.0μlH2O 8.5μl20μl其中10×PCR緩沖液的成分為500mM Tris-CI(pH8.3)，500mM KCI；質(zhì)粒DNA是整合有乙肝病毒DNA的pGEM-T載體，經(jīng)測序分析180位點(diǎn)為野生型。
以上各程序經(jīng)PCR擴(kuò)增完成后，分別執(zhí)行熔點(diǎn)曲線程序，95℃1分鐘，1個循環(huán)；55℃1分鐘，80個循環(huán)(其中，每增加一個循環(huán)，溫度遞增0.5℃)；55℃10秒鐘，1個循環(huán)。
從圖3、圖5、圖7可以看出，180位點(diǎn)為野生型的陽性標(biāo)本，采用NT1、NT2與NT3程序分別擴(kuò)增所得到的180位點(diǎn)的野生型與突變型的平均CT值為16.3、17.3(NT1)；17.7、19.1(NT2)；16.1、17.6(NT3)，各野生型與突變型的CT值差別相當(dāng)，在1-1.5之間，很難判斷該位點(diǎn)是否為野生或突變位點(diǎn)。同時對于程序NT2、NT3而言，在退火或是延伸溫度收集熒光對PCR擴(kuò)增曲線圖沒有影響。
從圖9、圖11、圖13可以看出，180位點(diǎn)為野生型的陽性標(biāo)本，采用T1、T2與T3程序分別擴(kuò)增所得到的180位點(diǎn)的野生型的平均CT值為30.3(T1)、22.0(T2)、29.2(T3)，而各突變型引物均未有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)。
3.Touch-down熒光定量PCR檢測乙肝病毒突變位點(diǎn)3.1血清標(biāo)本DNA的提取乙型肝炎病毒患者血清50μl加入50μl 0.4M NaOH，80℃保溫10分鐘。12000rpm(轉(zhuǎn)速/分鐘)離心5分鐘，取上清，加入25μl 0.4M Tris-HCl pH7.5。
3.2熒光定量PCR反應(yīng)熒光定量PCR反應(yīng)體系同前(SyBrGreen I熒光定量PCR退火溫度的選擇)中的PCR反應(yīng)條件，反應(yīng)程序采用Touch-down熒光定量PCR中的T2程序。
3.3熒光定量PCR結(jié)果分析從圖15可以看出，上游引物PU與180W-L、180M-L的下游引物組合中，熒光定量PCR擴(kuò)增所得到的CT平均值分別為13.5，26.8，熔點(diǎn)曲線圖與電泳圖見圖16，17。從圖18可以看出，在552位點(diǎn)與中上游引物PU與YMDD-L的下游引物組合中，熒光定量PCR擴(kuò)增所得到的CT平均值為29.6，上游引物PU與YVDD-L、YIDD-L下游引物之間都沒有擴(kuò)增，熔點(diǎn)曲線圖與電泳圖見圖19，20。表明該標(biāo)本552、428位點(diǎn)均為野生型，無突變發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，根據(jù)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關(guān)突變rtL180M、rtM204V/I，將突變位點(diǎn)分別設(shè)計在下游引物的3’端，上游引物為多聚酶區(qū)的一段保守的核苷酸序列，利用優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)程序，通過熒光定量PCR反應(yīng)，對從血清樣本提取的乙型肝炎病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)CT值和熔點(diǎn)曲線來檢測是否有突變發(fā)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，位于多聚酶區(qū)的上游引物序列為5’CCAATCACTCACCAACCTCT 3’，長度為20bp，分別與5條下游引物配對；下游引物中的兩條用于檢測rtL180M位點(diǎn)突變與否，另三條用于檢測rtM204V/I位點(diǎn)突變與否。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，優(yōu)化后的熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)榻德銹CR程序94℃ 3分鐘1個循環(huán)，94℃20秒、75℃-55℃20秒，72℃30秒，共計40個循環(huán)；其中退火溫度隨著每一循環(huán)的進(jìn)行而遞減0.5℃，即經(jīng)40個循環(huán)后，退火溫度由原來的75℃退為55℃；熒光信號的收集設(shè)在每一循環(huán)的退火溫度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液為1×PCR緩沖液包括pH8.3的50mmol/LTris-CI、50mmol/L KCI、Mg2+濃度為3.5mM；dNTP濃度為0.2mmol/L；Pfu DNA聚合酶濃度為1.25U，上、下游引物的濃度為0.2μmol/L，在PCR反應(yīng)中加入的SyBrGreen I染料終濃度為1×。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關(guān)突變位于DNA多聚酶基因的rtL180M、rtM204V/I突變。該方法利用PCR反應(yīng)中引物在3’末端存在錯配時不能正確延伸的特點(diǎn)，將突變位點(diǎn)設(shè)計在熒光定量PCR引物的3’末端，采用合適的引物濃度，Touch－down PCR反應(yīng)程序，同時結(jié)合嵌合有SyBrGreen I染料的PCR產(chǎn)物的熔點(diǎn)曲線。根據(jù)熒光定量PCR信號和熔點(diǎn)曲線，即可以判斷拉米夫定位點(diǎn)是否發(fā)生突變。該發(fā)明能準(zhǔn)確快速地檢測乙肝病毒臨床標(biāo)本中DNA突變，同時亦適用于其它基因的突變檢測。
文檔編號C12Q1/70GK1896278SQ20061004468
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日
發(fā)明者魯艷芹, 韓金祥, 戚鵬, 闞洪晶 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心