專利名稱：一種使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及細(xì)菌多糖的純化方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌莢膜多糖是細(xì)菌重要的保護(hù)性抗原，接種這些多糖，可以使2歲以上的群體獲得免疫保護(hù)。
在細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中，除了產(chǎn)生莢膜多糖之外，還產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素等成分，疫苗中這些成分的含量超過一定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，接種后可能導(dǎo)致較嚴(yán)重的副反應(yīng)。世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的細(xì)菌多糖疫苗規(guī)程以及《中國藥典》多糖疫苗的標(biāo)準(zhǔn)均對莢膜多糖中的蛋白質(zhì)含量、核酸含量和內(nèi)毒素含量有嚴(yán)格的要求。
細(xì)菌多糖的傳統(tǒng)純化工藝為采用冷酚萃取去除蛋白，然后用超濾或透析去除酚，用分級乙醇沉淀法去除核酸，并使用超速離心去除內(nèi)毒素。這一工藝步驟繁多，每一個(gè)工藝過程均涉及眾多工藝參數(shù)，故工藝波動性較大，給制品質(zhì)量控制帶來不利的因素，同時(shí)苯酚的大量使用給企業(yè)環(huán)保帶來了巨大壓力。
Sepharose 4FF凝膠在病毒、核酸純化中得到應(yīng)用，但是使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種獲得高純度細(xì)菌多糖的條件溫和、操作簡便、易于控制、無環(huán)保問題的純化工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案及步驟(1)采用生物反應(yīng)器對細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)于對數(shù)生長后期殺菌，離心收集上清液；(3)制備粗制多糖；
(4)對粗制多糖進(jìn)行預(yù)處理，用截留分子量10～100kD的超濾膜超濾濃縮至多糖濃度為2～50mg/ml；(5)以2～15％柱體積上樣于Sepharose 4FF凝膠柱，以含0.02～1.0mol/L氯化鈉或氯化鈣的洗脫液洗脫，收集Kd0.5之前的組分；(6)洗脫液加入乙醇至終濃度50-90％沉淀多糖，離心收集多糖沉淀；(7)沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；(8)經(jīng)冷凍干燥，獲得高純度的精制多糖。
其中的細(xì)菌可以為以下任一種b型流感嗜血桿菌、A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌、Y群腦膜炎球菌、傷寒沙門氏菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、肺炎鏈球菌1型、肺炎鏈球菌2型、肺炎鏈球菌3型、肺炎鏈球菌4型、肺炎鏈球菌5型、肺炎鏈球菌6B型、肺炎鏈球菌7F型、肺炎鏈球菌8型、肺炎鏈球菌9N型、肺炎鏈球菌9V型、肺炎鏈球菌10A型、肺炎鏈球菌11A型、肺炎鏈球菌12F型、肺炎鏈球菌14型、肺炎鏈球茵15B型、肺炎鏈球菌17F型、肺炎鏈球菌18C型、肺炎鏈球菌19A型、肺炎鏈球菌19F型、肺炎鏈球菌20型、肺炎鏈球菌22F型、肺炎鏈球菌23F型、肺炎鏈球菌33F型；洗脫液可以含有0.2～1.0mol/L的氯化鈉或氯化鈣；所用的超濾膜截留分子量可以為50～100kD，上樣的多糖濃度可以為20～50mg/ml，上樣量可以為10％～15％；收集Kd0.5之前的組分，然后采取乙醇沉淀法沉淀細(xì)菌多糖；所獲得的多糖適合制備細(xì)菌多糖疫苗及多糖蛋白結(jié)合疫苗。
本發(fā)明的有益效果是由于細(xì)菌多糖的免疫原性與細(xì)菌多糖的分子量密切相關(guān)，分子量大的多糖免疫原性較好，同時(shí)，細(xì)菌多糖中存在的蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素雜質(zhì)對于細(xì)菌多糖用于制備疫苗帶來不利影響，通過采用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化，獲得了蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素含量低的高純度的細(xì)菌多糖，所獲得的多糖適合制備細(xì)菌多糖疫苗及多糖蛋白結(jié)合疫苗，并提高了所制備疫苗臨床使用的安全性和有效性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
采用生物反應(yīng)器對b型流感嗜血桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；于對數(shù)生長后期殺菌后，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時(shí)后，4000rpm離心15分鐘，收集沉淀；沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液，攪拌3小時(shí)后，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得b型流感嗜血桿菌粗制多糖。
10克粗糖按50mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用10kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至2mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，每次上樣36ml(柱體積的2％)。0.02mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度50％，置4℃靜置12小時(shí)，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次。洗滌的經(jīng)多糖冷凍干燥，獲得480mg精制b型流感嗜血桿菌多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％核糖含量 38.8％磷含量 8.1％KD小于0.5的分子回收95.2％鑒別試驗(yàn) 與b型流感嗜血桿菌特異抗血清產(chǎn)生沉淀線內(nèi)毒素含量 10EU/微克多糖實(shí)施例2采用生物反應(yīng)器對A群腦膜炎球菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；于對數(shù)生長后期殺菌后，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時(shí)后，離心收集沉淀；沉淀中加入lmol/L CaCl2溶液，攪拌3小時(shí)后，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得A群腦膜炎球菌粗制多糖。
40克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用100kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至濃度50mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣270毫升(15％柱體積)。用1.0mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度90％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次。洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得7280mg精制A群腦膜炎球菌多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.21％O-乙?；? 2.5mmol/g磷含量 8.52％KD小于0.5的分子回收96.4％鑒別試驗(yàn) 與A群腦膜炎球菌特異抗血清產(chǎn)生沉淀線內(nèi)毒素含量 5EU/微克多糖實(shí)施例3采用生物反應(yīng)器對C群腦膜炎球菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；于對數(shù)生長后期殺菌后，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時(shí)后，離心收集沉淀；沉淀中加入1mol/L CaCl2溶液，攪拌3小時(shí)后，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得C群腦膜炎球菌粗制多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至濃度20mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(10％柱體積)。用0.2mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次。洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1865mg精制C群腦膜炎球菌多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.24％O-乙?；? 2.1mmol/g唾液酸含量 850mg/gKD小于0.5的分子回收97.2％鑒別試驗(yàn) 與C群腦膜炎球菌特異抗血清產(chǎn)生沉淀線內(nèi)毒素含量 2EU/微克多糖實(shí)施例4采用生物反應(yīng)器對W135群腦膜炎球菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；于對數(shù)生長后期殺菌后，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時(shí)后，離心收集沉淀；沉淀中加入1mol/L CaCl2溶液，攪拌3小時(shí)后，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得W135群腦膜炎球菌粗制多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至濃度10mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(5％柱體積)。用0.02mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次。洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得650mg精制W135群腦膜炎球菌多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量0.15％核酸含量0.22％O-乙?；?.61mmol/g唾液酸含量 608mg/gKD小于0.5的分子回收 97.6％鑒別試驗(yàn)與W135群腦膜炎球菌特異抗血清產(chǎn)生沉淀線內(nèi)毒素含量 20EU/微克多糖實(shí)施例5采用生物反應(yīng)器對Y群腦膜炎球菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；于對數(shù)生長后期用甲醛殺菌后，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時(shí)后，離心收集沉淀；沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液，攪拌3小時(shí)后，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)真空冷凍干燥，獲得Y群腦膜炎球菌粗制多糖。
25克粗糖按20mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至濃度50mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣54毫升(柱體積的3％)。用1.0mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次。洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1760mg精制Y群腦膜炎球菌多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％O-乙酰基含量 0.62mmol/g唾液酸含量 596mg/gKD小于0.5的分子回收97.8％鑒別試驗(yàn) 與Y群腦膜炎球菌特異抗血清產(chǎn)生沉淀線內(nèi)毒素含量 16EU/微克多糖實(shí)施例6采用生物反應(yīng)器對傷寒沙門氏菌進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長后期用甲醛殺菌后，離心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度0.1％，室溫靜置12小時(shí)后，離心收集沉淀；沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液，攪拌3小時(shí)后，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度75％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得傷寒Vi粗制多糖；
15克粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至20mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣72毫升(柱體積的4％)。用0.2mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度70％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次。洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1050mg精制傷寒Vi多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量0.16％核酸含量0.18％O-乙酰基含量3.08mmol/gKD小于0.25的分子回收75.2％鑒別試驗(yàn)與傷寒Vi特異血清形成沉淀線，與傷寒O血清不形成沉淀線內(nèi)毒素含量 10EU/微克多糖實(shí)施例7采用生物反應(yīng)器對A群鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用甲醛殺菌后，離心收集菌體；按照菌體濕重每100克加入0.5mol/L NaOH500毫升，攪拌下提取2小時(shí)，加入醋酸中和至pH7.0，4000rpm離心30分鐘收集上清。用50kD超濾膜超濾，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得A群鏈球菌粗制多糖。
將15g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至40mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣108毫升(柱體積的6％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度90％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1750mg精制A群鏈球菌多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.15％鑒別試驗(yàn) 與A群鏈球菌特異性抗血清產(chǎn)生沉淀線內(nèi)毒素含量 0.05EU/微克多糖實(shí)施例8采用生物反應(yīng)器對B群鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用甲醛殺菌后，離心收集菌體；按照菌體濕重每100克加入0.5mol/L NaOH500毫升，攪拌下提取2小時(shí)，加入醋酸中和至pH7.0，4000rpm離心30分鐘收集上清。用50kD超濾膜超濾，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得B群鏈球菌粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至30mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度90％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得850mg精制B群鏈球菌多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.20％鑒別試驗(yàn) 與B群鏈球菌特異性抗血清產(chǎn)生沉淀線內(nèi)毒素含量 0.05EU/微克多糖實(shí)施例9采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌1型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌1型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1650mg精制肺炎鏈球菌1型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.16％糖醛酸含量 50.3％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 4.5％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌1型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例10采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌2型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌2型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至20mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1650mg精制肺炎鏈球菌2型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.19％糖醛酸含量 18.6％甲基戊糖含量 42.3％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 0.2％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌2型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例11采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌3型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌3型粗制多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1850mg精制肺炎鏈球菌3型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.17％核酸含量 0.18％糖醛酸含量 45.3％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 0.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌3型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例12采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌4型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌4型粗制多糖。
將15g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1250mg精制肺炎鏈球菌4型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.23％核酸含量 0.21％氨基己糖含量 45.6％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 5.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌4型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例13采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌5型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌5型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1020mg精制肺炎鏈球菌5型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.23％糖醛酸含量 14.2％氨基己糖含量 23.5％KD 0.35磷含量 0.3％總氮含量 4.2％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌5型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例14采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌6B型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌6B型粗制多糖。
將20g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至40mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣54毫升(柱體積的3％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1350mg精制肺炎鏈球菌6B型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.19％甲基戊糖含量 21.3％KD 0.35磷含量 4.1％總氮含量 0.3％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌6B型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例15采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌7F型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌7F型粗制多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得2250mg精制肺炎鏈球菌7F型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.15％甲基戊糖含量 15.6％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 2.7％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌7F型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例16采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌8型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌8型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1750mg精制肺炎鏈球菌8型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.24％糖醛酸含量 38.6％KD 0磷含量 0.1％總氮含量 0.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌8型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例17采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌9N型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌9N型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1320mg精制肺炎鏈球菌9N型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.17％糖醛酸含量 25.3％氨基己糖含量 31.5％KD 0.05磷含量 0.1％總氮含量 3.3％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌9N型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例18采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌9V型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌9V型粗制多糖。
將30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至20mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1550mg精制肺炎鏈球菌9V型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.20％糖醛酸含量 18.6％甲基戊糖含量 16.2％KD 0.25磷含量 0.1％總氮含量 1.6％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌9V型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例19采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌10A型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌10A型粗制多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1730mg精制肺炎鏈球菌10A型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.22％核酸含量 0.18％氨基己糖含量 15.8％KD 0.35磷含量 2.7％總氮含量 1.9％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌10A型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例20采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌11A型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌11A型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1560mg精制肺炎鏈球菌11A型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.20％核酸含量 0.21％KD 0.15磷含量 3.8％總氮含量 0.2％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌11A型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例21采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌12F型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌12F型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1220mg精制肺炎鏈球菌12F型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.17％氨基己糖含量 28.5％KD 0.10磷含量 0.1％總氮含量 4.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌12F型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例22采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌14型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌14型粗制多糖。
將40g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至30mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得2350mg精制肺炎鏈球菌14型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.19％氨基己糖含量 22.3％KD 0.15磷含量 0.1％總氮含量 3.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌14型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例23采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌15B型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌15B型粗制多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用30kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣180毫升(柱體積的10％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得2150mg精制肺炎鏈球菌15B型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.17％氨基己糖含量 17.6％KD 0.30磷含量 3.2％總氮含量 2.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌15B型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例24采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌17F型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌17F型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1350mg精制肺炎鏈球菌17F型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.22％甲基戊糖含量 23.6％KD 0.25磷含量 0.2％總氮含量 0.3％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌17F型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例25采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌18C型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌18C型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1750mg精制肺炎鏈球菌18C型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.23％甲基戊糖含量 16.8％KD 0磷含量 3.6％總氮含量 0.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌18C型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例26采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌19A型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌19A型粗制多糖。
將30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1850mg精制肺炎鏈球菌19A型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％氨基己糖含量 14.8％甲基戊糖含量 24.5％KD 0.15磷含量 5.6％總氮含量 1.5％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌19A型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例27采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌19F型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌19F型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至40mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣72毫升(柱體積的4％)。用0.1mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1350mg精制肺炎鏈球菌19F型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.20％核酸含量 0.21％氨基己糖含量 14.3％甲基戊糖含量 25.3％KD 0.05磷含量 4.3％總氮含量 2.3％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌19F抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例28采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌20型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌20型粗制多糖。
將25g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1550mg精制肺炎鏈球菌20型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.17％核酸含量 0.19％氨基己糖含量 15.6％KD 0.35磷含量 2.6％總氮含量 1.6％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌20型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例29采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌22F型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌22F型粗制多糖。
將30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至30mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1750mg精制肺炎鏈球菌22F型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.19％核酸含量 0.16％糖醛酸含量 17.8％甲基戊糖含量 27.6％KD 0.30磷含量 0.1％總氮含量 0.2％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌22F型抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例30采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌23F型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌23F型粗制多糖。
將25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提2次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至40mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.1mol/L氯化鈣溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得2350mg精制肺炎鏈球菌23F型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下
蛋白含量 0.16％核酸含量 0.21％甲基戊糖含量 42.6％KD 0磷含量 3.7％總氮含量 0.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌23F抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖實(shí)施例31采用生物反應(yīng)器對肺炎鏈球菌33F型進(jìn)行發(fā)酵；于對數(shù)生長期后期用脫氧膽酸鈉殺菌后，離心收集上清液；上清用50kD超濾膜濃縮10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至終濃度25％，離心收集上清液；上清液加入乙醇至終濃度80％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；洗滌后的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得肺炎鏈球菌33F型粗制多糖。
將30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1體積比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇體積比5∶1)抽提3次，4000g離心30分鐘收集上清，上清加入氯化鈣至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃靜置12小時(shí)，10000g離心1小時(shí)去除沉淀。上清液用50kD超濾膜超濾去除乙醇并濃縮至25mg/ml，上樣于Sepharose 4FF柱，上樣90毫升(柱體積的5％)。用0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫；收集Kd0.5之前的洗脫峰，加入乙醇至終濃度70％，離心收集多糖沉淀；多糖沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；經(jīng)洗滌的多糖經(jīng)冷凍干燥，獲得1850mg精制肺炎鏈球菌33F型多糖。
各項(xiàng)檢定指標(biāo)如下蛋白含量 0.22％核酸含量 0.18％KD 0.25磷含量 0.2％總氮含量 0.1％鑒別試驗(yàn) 與肺炎鏈球菌33F抗血清產(chǎn)生特異沉淀線內(nèi)毒素含量 0.025EU/微克多糖本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的比較

從上表可以看出，本發(fā)明純化獲得的細(xì)菌多糖的蛋白含量、核酸含量、內(nèi)毒素含量均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，說明本發(fā)明是一種獲得高純度細(xì)菌多糖的新方法，本發(fā)明純化獲得的細(xì)菌多糖適合于制備疫苗。
權(quán)利要求
1.一種使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化的方法，具體步驟是(1)采用生物反應(yīng)器對細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)于對數(shù)生長后期殺菌，離心收集上清液；(3)制備粗制多糖；(4)對粗制多糖進(jìn)行預(yù)處理，用截留分子量10～100kD的超濾膜超濾濃縮至多糖濃度為2～50mg/ml；(5)以2～15％柱體積上樣于Sepharose 4FF凝膠柱，以含0.02～1.0mol/L氯化鈉或氯化鈣的洗脫液洗脫，收集Kd0.5之前的組分；(6)洗脫液加入乙醇至終濃度50-90％沉淀多糖，離心收集多糖沉淀；(7)沉淀分別用無水乙醇、丙酮各洗滌2次；(8)經(jīng)冷凍干燥，獲得高純度的精制多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化的方法，其特征是所述細(xì)菌為以下任一種b型流感嗜血桿菌、A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌、Y群腦膜炎球菌、傷寒沙門氏菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、肺炎鏈球菌1型、肺炎鏈球菌2型、肺炎鏈球菌3型、肺炎鏈球菌4型、肺炎鏈球菌5型、肺炎鏈球菌6B型、肺炎鏈球菌7F型、肺炎鏈球菌8型、肺炎鏈球菌9N型、肺炎鏈球菌9V型、肺炎鏈球菌10A型、肺炎鏈球菌11A型、肺炎鏈球菌12F型、肺炎鏈球菌14型、肺炎鏈球菌15B型、肺炎鏈球菌17F型、肺炎鏈球菌18C型、肺炎鏈球菌19A型、肺炎鏈球菌19F型、肺炎鏈球菌20型、肺炎鏈球菌22F型、肺炎鏈球菌23F型、肺炎鏈球菌33F型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化的方法，其特征是所述超濾膜截留分子量為50～100kD。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化的方法，其特征是所述洗脫液含有0.20～1.0mol/L的氯化鈉或氯化鈣。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化的方法，其特征是所述上樣的多糖濃度為20～50mg/ml，上樣量10％～15％。
全文摘要
本發(fā)明一種使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其步驟為在對細(xì)菌多糖進(jìn)行預(yù)處理后，使用Sepharose 4FF凝膠對細(xì)菌多糖進(jìn)行純化，收集Kd 0.5之前的組分，可獲得純度高，內(nèi)毒素含量低的細(xì)菌多糖。本發(fā)明獲得的純度高、內(nèi)毒素含量低的細(xì)菌多糖適合于制備細(xì)菌多糖疫苗及細(xì)菌多糖結(jié)合疫苗。
文檔編號C12R1/21GK1970779SQ20061004887
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月6日
發(fā)明者黃鎮(zhèn), 向左云 申請人:云南沃森生物技術(shù)有限公司