專利名稱：能催化吲哚生成靛藍的質(zhì)粒pET28a(+)－P450BM3－gdh0310、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工中基因工程菌生產(chǎn)靛藍的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種能催化吲哚生成靛藍，能共表達細胞色素P450 BM3單加氧酶和葡萄糖脫氫酶的質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
靛藍是一種藍色色素，是最早發(fā)現(xiàn)的天然染料之一。據(jù)統(tǒng)計，到1998年為止，世界染料的年總產(chǎn)量為800,000噸，其中靛藍占80,000噸。染料靛藍最初是從植物中提取的，直至1883年它的化學(xué)結(jié)構(gòu)被闡明后，化學(xué)合成制備方法被廣泛采用，它以生產(chǎn)簡便、原料充足、純度高、使用方便等優(yōu)點迅速普及，很快取代了植物靛藍。但化學(xué)合成靛藍環(huán)境污染嚴(yán)重，并有潛在的致癌作用。隨著人們環(huán)境保護和勞動保護意識的加強，采用生物技術(shù)方法合成靛藍逐漸引起了研究者的注意。生物轉(zhuǎn)化合成靛藍不僅簡化工藝，可能降低成本，而且對消除潛在致癌物，防止環(huán)境污染，具有較多的優(yōu)越性。因此發(fā)展生物法合成靛藍是極具有前途的。
P450酶系是廣泛分布于動物、植物和微生物等不同生物體內(nèi)的一類代謝酶系，因其主要組成中的P450蛋白與CO結(jié)合后在450nm處有特征光吸收峰而得名。迄今為止的研究表明，它可以催化成千上萬的化學(xué)反應(yīng)，參與的主要反應(yīng)有烷基的羥基化、烷基的環(huán)氧化，羥基的氧化，氨、氧、硫部位上的脫烷基化，氨部位上的羥基化和氧化，硫部位上的氧化，氧化性脫氨、脫氫和脫鹵素，氧化性的C-C鍵斷裂以及其它一些還原催化反應(yīng)。有專著甚至指出它可能是自然界中最具催化多樣性的生物催化劑，由于該酶系的性質(zhì)和功能以及在生命活動過程中的作用，P450酶系受到了廣大研究者的高度重視，P450酶系作用的重要性已經(jīng)成為當(dāng)代生物學(xué)研究中一個值得注意的領(lǐng)域。國外的研究工作主要分布于對該酶系在生物機體中的作用以及利用該酶系的催化作用大規(guī)模生產(chǎn)手性藥物等方面，而在國內(nèi)，雖有大量關(guān)于該酶系的綜述性和研究性報導(dǎo)，但研究工作卻只局限在該酶系在生物機體中的作用，目前尚未見有用該酶系的催化作用制備手性藥物的報導(dǎo)，有學(xué)者指出，主要原因是國內(nèi)目前尚未能獲得適量的酶。
在P450酶系中，P450 BM3是從巨大芽孢桿菌(B.megaterium)中發(fā)現(xiàn)的具有脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和O2存在下，它具有快速催化鏈長大約為C12-C18的飽和脂肪酸的加單氧酶活性。在國外，德國斯圖加特大學(xué)技術(shù)生化研究所R.D.Schmid領(lǐng)導(dǎo)的科研小組于2000年利用定向進化技術(shù)獲得具有三個突變位點的P450 BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)，他們發(fā)現(xiàn)這一突變酶竟能催化吲哚生成靛藍；詳見“Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into anindole-hydroxylating catalyst”《Chemistry-A European Journal》Li Q S，Schwaneberg U，F(xiàn)ischer P，Schmid R D.2000，61531-1536。
而后由浙江大學(xué)生物工程研究所梅樂和教授領(lǐng)導(dǎo)的科研小組在此基礎(chǔ)上，通過易錯PCR技術(shù)進一步定向進化P450BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)變體基因，獲得一個高于P450BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)催化吲哚活性的P450 BM3突變酶P450 BM3(D168N，A225V，K440N)，提高了靛藍的產(chǎn)量。詳見“催化吲哚生成靛藍的細胞色素450BM-3定向進化研究”《生物化學(xué)與生物物理進展》李紅梅、梅樂和、VladaUrlacher、Schmid RolfD.2005，32(7)1-6。
但是P450 BM3催化吲哚生成靛藍需要還原型輔酶NADPH的參與，這就限制了P450 BM3用于合成靛藍的實用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能共表達P450 BM3和葡萄糖脫氫酶，并能催化吲哚合成靛藍的質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310。
本發(fā)明還提供了上述質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的制備方法。
本發(fā)明還提供了質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310用于催化吲哚合成靛藍的用途。
一種能催化吲哚生成靛藍的質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310，由P450 BM3基因和葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個表達載體pET28a(+)構(gòu)建。
制備帶有上述質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌的方法，包括以下步驟(1)以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)PCR擴增得到gdh0310基因片段；，將該基因片段連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310；(2)上述pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；(3)挑選克隆接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)擴增質(zhì)粒；(4)提取擴增后的質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI酶解，將所得酶切片段定向連接到經(jīng)EcoRI和XhoI酶解處理過的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310；(5)將重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，涂布到含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；(6)挑選克隆接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)以擴增質(zhì)粒；(7)提取擴增質(zhì)粒，用NcoI和XhoI對重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310進行雙酶切，通過電泳鑒定；(8)將電泳鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中，得到帶有質(zhì)粒(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)的重組菌E.coliBL21。
上述質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310用于催化吲哚生成靛藍。
其催化吲哚生成靛藍包括以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，加入適量葡萄糖，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)，同時加入適量底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h；(3)將所得培養(yǎng)液離心10min，收獲細胞，并用水洗滌2-3次，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)。
催化吲哚生成靛藍還可采用以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)6-8h，裝液量為25-50ml/250ml搖瓶；(3)將所得發(fā)酵液離心10min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆茫?4)稱取濕菌體，懸浮于Tris-HCl緩沖液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；(5)反應(yīng)結(jié)束后，將所得反應(yīng)液離心10min，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)。
本發(fā)明在突變酶P450 BM3(D168N，A225V，K440N)突變基因的基礎(chǔ)上，將該突變基因與葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個表達載體pET28a(+)上，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21，得到的菌株能同時表達細胞色素P450 BM3單加氧酶和葡萄糖脫氫酶，并能協(xié)同作用催化吲哚生成靛藍，在反應(yīng)體系中形成輔酶再生循環(huán)系統(tǒng)，從而大幅度提高靛藍的產(chǎn)量，使生物轉(zhuǎn)化合成靛藍更加實用化。與只能表達P450 BM3的菌株E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)相比較，其催化活性提高了22-27倍，為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)染料靛藍提供了廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)過PCR擴增得到gdh0310基因片段，將所得gdh0310基因片段用電泳檢測并從瓊脂糖凝膠中切膠回收葡萄糖脫氫酶基因片斷，通過“A-T”連接方式連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310；將所得pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到終濃度為50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；挑選大約8個克隆接種到3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)以擴增質(zhì)粒；用堿裂解法提取擴增質(zhì)粒，并用EcoRI和XhoI在37℃酶解，將獲得的酶切片段定向連接到用同樣雙酶切處理過的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310。
將重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；挑選8個克隆接種到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)以擴增質(zhì)粒；用堿裂解法提取擴增質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE-3)中，即得到了帶質(zhì)粒pET28a(+)P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21。
由LB平板挑取帶質(zhì)粒pET28a(+)P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽性克隆接種到添加卡那霉素至終濃度為30μg/ml的LB種子培養(yǎng)基中，180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；發(fā)酵培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度30μg/ml，加入葡萄糖至100-200mM，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG至終濃度0.5-1.0mM誘導(dǎo)，同時加入適量底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h，得到藍色細胞，用N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)。
或者由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)6-8h，裝液量為25-50ml/250ml搖瓶；將所得發(fā)酵液離心10min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆?；稱取濕菌體，懸浮于Tris-HCl緩沖液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；反應(yīng)結(jié)束后，將所得反應(yīng)液離心10min，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)。
序列表序列信息(a)序列特征，此序列不包括pET28(+)，P450 BM3基因片斷上游通過NheI酶切位點連接到pET28a(+)上，下游與葡萄糖脫氫酶基因片斷通過EcoRI酶切位點連接，葡萄糖脫氫酶基因片斷下游通過XhoI酶切位點與pET28a(+)連接，此序列從P450 BM3基因的啟動子開始，到葡萄糖脫氫酶基因的終止子結(jié)束。
長度3946個堿基類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源P450 BM3基因片斷和葡萄糖脫氫酶基因均來自于巨大芽孢桿菌(d)序列描述ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAATCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGGTCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTGGTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCAGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTAGATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAACGAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAG
GAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGAAACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTATGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGATCCAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAGCAAGCCTACAAGACAAGTGCTGGCAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCATTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCT
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AAGCGGGAAGAGGTTAATAA具體操作采用如下步驟進行1.葡萄糖脫氫酶基因的獲得以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)PCR擴增得到gdh0310基因片段，設(shè)計相應(yīng)的上下游引物分別是5’-AAAAGAATTCATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAG-3’和5’-AAAAACTCGAGTTATTAACCTCTTCCCGCTT-3’。
為便于與pET28a(+)-P450 BM3聯(lián)接，上下游引物的5’端分別設(shè)計了EcoRI和XhoI酶切位點。
PCR擴增反應(yīng)體系為向500μl的eppendorf管中加入10nmol的dNTPs，各10pmol的上游引物和下游引物，約1ng質(zhì)粒pQE30-gdh0310作為模板DNA，1.25U Taq Platinum聚合酶，5μl的PCR緩沖液，然后用無菌的蒸餾水加至總體積50μl。PCR反應(yīng)參數(shù)是94℃變性8min后，94℃/30s，54℃/30s，72℃/1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。
將所得gdh0310基因片段用電泳檢測并從瓊脂糖凝膠中切膠回收葡萄糖脫氫酶基因片斷，通過“A-T”連接方式連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310，將所得pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到終濃度為50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；挑選大約8個克隆接種到3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)以擴增質(zhì)粒，用堿裂解法提取擴增質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI在37℃酶解后，用電泳檢測并從瓊脂糖凝膠中切膠回收葡萄糖脫氫酶基因片斷。
酶切過程中，質(zhì)粒pMD18-gdh0310以及限制性內(nèi)切酶的用量為質(zhì)粒pMD18-gdh031010μlEcoRI1μlXhoI 1μl緩沖液(10×H)3μl無菌水 15μl總體積 30μl
2.表達載體pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的構(gòu)建對上述質(zhì)粒pMD18-gdh0310用EcoRI，XhoI雙酶切，獲得的酶切片段定向連接到用同樣雙酶切處理過的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310。
酶切過程中，質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3以及限制性內(nèi)切酶的用量為質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM310μlEcoRI 1μlXhoI 1μl緩沖液(10×H) 3μl無菌水15μl總體積30μl連接過程中，連接酶、葡萄糖脫氫酶基因片斷與質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3的用量為葡萄糖脫氫酶基因片斷 4μl質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3 4μlT4 DNA連接酶 1μl緩沖液(10×) 1μl總體積 10μl3.連接效果的鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到到E.coli DH5α，涂布到含有30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；挑選約8個克隆接種到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)以擴增質(zhì)粒，用堿裂解法提取擴增質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE-3)中，即得到了帶質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21；用NcoI和XhoI對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，利用DNA電泳檢測葡萄糖脫氫酶基因片段是否已連接到pET28a(+)-P450 BM3上。
4.全細胞生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)靛藍a)由LB瓊脂平板挑取帶質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽性克隆，接種到添加卡那霉素至終濃度為30μg/ml的LB(pH7.0-7.5)種子培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；LB發(fā)酵培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度30μg/ml，加入葡萄糖至100-200mM，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG至終濃度0.5-1.0mM誘導(dǎo)，同時加入適量終濃度為0.1-10mM的底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h。
將所得培養(yǎng)液以8000r/min離心10min，收獲細胞，所得細胞用水洗滌2-3次，加入適量的N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)，8000r/min離心保留上清液，測吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算靛藍含量，得到靛藍產(chǎn)量為49.98-915.3mg/L。
b)種子培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為30μg/ml，由平板挑取帶質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21接入，150-180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；LB發(fā)酵培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度30μg/ml，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG至終濃度0.5mM誘導(dǎo)6-8h。裝液量為25-50ml/250ml搖瓶。
發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液于8000r/min離心10min，收集菌體，用0.9％生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆?；稱取0.2-0.4g濕菌體，懸浮于20mlTris-HCl緩沖液中，加入100-200mM葡萄糖和一定量終濃度為0.1-10mM的吲哚，于100r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于8000r/min離心10min，加入適量的N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)，8000r/min離心保留上清液，測吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算靛藍含量，得到靛藍產(chǎn)量為13.1-659mg/L。
權(quán)利要求
1.一種能催化吲哚生成靛藍的質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310，由P450 BM3基因和葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個表達載體pET28a(+)上構(gòu)建，從P450 BM3基因的啟動子開始，到葡萄糖脫氫酶基因的終止子結(jié)束的基因序列為ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAATCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGGTCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTGGTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCAGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTAGATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAACGAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAGGAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGAAACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTATGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGATCCAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAGCAAGCCTACAAGACAAGTGCTGGCAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCATTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCTATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTGTCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGGAGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCAAGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCTGCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCGCGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAGTCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCTCATGAAGACTATCTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACGCTTCATACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAATGGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCTATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATGAAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCTGCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAAGAATTCGGATCCATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAGTTGTAACAGGCGGATCAAAAGGATTGGGTCGCGCAATGGCCGTTCGTTTTGGTCAAGAGCAGTCAAAAGTGGTTGTAAACTACCGCAGCAATGAAGAAGAAGCGCTAGAAGTAAAAAAAGAAATTGAACAAGCTGGCGGCCAAGCAATTATTGTTCGAGGCGACGTAACAAAAGAGGAAGACGTTGTGAATCTTGTAGAGACAGCTGTTAAAGAGTTTGGCACATTAGACGTTATGATTAACAATGCTGGTGTTGAAAACCCGGTTCCTTCACATGAATTATCGTTAGAAAACTGGAATCAAGTAATCGATACAAACTTAACAGGCGCGTTTTTAGGAAGCCGCGAAGCGATTAAATATTTTGTTGAAAATGATATTAAAGGAAACGTTATTAACATGTCCAGCGTTCACGAGATGATTCCTTGGCCACTATTTGTTCACTATGCAGCAAGTAAAGGCGGTATGAAACTAATGACAGAAACATTGGCTCTTGAATATGCGCCAAAAGGTATCCGCGTAAATAACATTGGACCAGGCGCGATCGATACGCCAATCAACGCTGAAAAATTCGCAGATCCGGAACAGCGTGCAGACGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGCTACATCGGCAACCCGGAAGAAATTGCATCAGTTGCAGCATTCTTAGCATCGTCACAAGCAAGCTACGTAACAGGTATTACACTATTTGCTGATGGCGGTATGACAAAATATCCTTCTTTCCAAGCGGGAAGAGGTTAATAA。
2.一種制備帶有如權(quán)利要求1所述質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310的重組菌的方法，包括以下步驟(1)以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)PCR擴增得到gdh0310基因片段；，將該基因片段連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310；(2)上述pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；(3)挑選克隆接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)擴增質(zhì)粒；(4)提取擴增后的質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI酶解，將所得酶切片段定向連接到經(jīng)EcoRI和XhoI酶解處理過的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310；(5)將重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，涂布到含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)；(6)挑選所得克隆接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)以擴增質(zhì)粒；(7)提取擴增質(zhì)粒，用NcoI和XhoI對重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310進行雙酶切，通過電泳鑒定；(8)將電泳鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，得到帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coli BL21。
3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310在催化吲哚生成靛藍中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于催化吲哚生成靛藍包括以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，并加入適量葡萄糖，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)，同時加入適量底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h；(3)將所得培養(yǎng)液離心10min，收獲細胞，并用水洗滌2-3次，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于催化吲哚生成靛藍還可采用以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)12h；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)6-8h，裝液量為25-50ml/250ml搖瓶；(3)將所得發(fā)酵液離心10min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆茫?4)稱取濕菌體，懸浮于Tris-HCl緩沖液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；(5)反應(yīng)結(jié)束后，將所得反應(yīng)液離心10min，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍色物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能共表達P450BM3和葡萄糖脫氫酶，并能催化吲哚合成靛藍的質(zhì)粒pET28a(+)－P450BM3－gdh0310、制備方法及其用途。它是將P450BM3基因和葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個表達載體pET28a(+)上，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21，得到的菌株能同時表達細胞色素P450BM3單加氧酶和葡萄糖脫氫酶，并能協(xié)同作用催化吲哚生成靛藍，與以往菌株相比，其催化活性提高了22－27倍，為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)染料靛藍提供了廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/53GK1880459SQ200610050388
公開日2006年12月20日 申請日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者梅樂和, 陸燕 申請人:浙江大學(xué)