專利名稱：枯草芽孢桿菌zjb－063及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從土壤中篩選到的微生物新菌株枯草芽孢桿菌ZJB-063，及其在制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌。可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強(qiáng)烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取5′-核苷酸酶的菌種。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對(duì)此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
對(duì)羥基苯乙酸是一種重要的有機(jī)合成中間體，用對(duì)羥基苯乙酸合成的產(chǎn)品用途相當(dāng)廣泛，其應(yīng)用領(lǐng)域覆蓋醫(yī)藥、農(nóng)藥、液晶材料等多方面。在醫(yī)藥領(lǐng)域主要用來(lái)合成心血管藥物——4，7-二羥基異黃酮，該藥品臨床用于治療高血壓引起的頸項(xiàng)強(qiáng)痛、頭痛、偏頭痛、頭暈、冠心病、心絞痛及早期神經(jīng)感覺(jué)性耳聾等癥狀，療效顯著，應(yīng)用普遍。還可合成消炎鎮(zhèn)痛藥物苯惡洛芬，該藥品用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他發(fā)炎性疾病。而由該產(chǎn)品合成的抗生素藥物拉氧頭孢鈉更是療效顯著的醫(yī)藥產(chǎn)品，它可通過(guò)阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。其次還用于抗高血壓藥物——阿替洛爾以及抗癌藥物、抗糖尿病藥、抗動(dòng)脈硬化藥、抗過(guò)敏藥和消炎藥、β-受體阻滯藥等的合成。在農(nóng)藥領(lǐng)域主要用于合成除蟲(chóng)劑乙氰菊酸，此殺蟲(chóng)劑具有觸殺和噴殺作用，對(duì)動(dòng)物安全，陽(yáng)光下穩(wěn)定性好，近年來(lái)等到廣大用戶的歡迎，在高分子化合物中，對(duì)羥基苯乙酸可用作合成聚合物的光熱穩(wěn)定劑，在光電子領(lǐng)域中，對(duì)羥基苯乙酸可用來(lái)合成液晶化合物，在生物化學(xué)領(lǐng)域中，合成脂肪氧合酶阻滯劑需用對(duì)羥基苯乙酸。此外還可用于抗靜電劑的合成。
目前所用的生產(chǎn)對(duì)羥基苯乙酸的方法勻?yàn)榛瘜W(xué)合成法，文獻(xiàn)[Tetrahedron Letters，1991，32(10)1343-1346]中報(bào)導(dǎo)過(guò)能產(chǎn)對(duì)羥基苯乙腈水合酶及對(duì)羥基苯乙腈的水解酶的菌Rhodococcus butanica ATCC 21197，該菌能催化多種腈生成對(duì)應(yīng)的酰胺或酸如苯環(huán)上被羥基、甲基、氯、氰基及甲氧基等取代的苯甲腈及對(duì)位被羥基、氯及甲氧基取代的苯乙腈等。但該菌株能同時(shí)產(chǎn)腈水解酶和腈水合酶，所以產(chǎn)物中會(huì)混有較多的對(duì)羥基苯乙酰胺，增加了分離難度的同時(shí)也影響了收率。
另東京大學(xué)1990年報(bào)道的一能催化該反應(yīng)的菌為Alcaligenes faecalisJM3，該菌對(duì)苯環(huán)上有取代基的苯乙腈類物質(zhì)有較好的活性，但對(duì)其它脂肪類腈基本沒(méi)活力[European Journal of Biochemistry，1990，194765-772]。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供可將對(duì)羥基苯乙腈水解為對(duì)羥基苯乙酸的芽孢桿菌屬新菌株及其在制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是枯草芽孢桿菌ZJB-063(Bacillus subtilis ZJB-063)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC No.M 206038，保藏日期2006年4月14日。提議的分類命名為枯草芽孢桿菌ZJB-063。
枯草芽孢桿菌ZJB-063的由以下途徑篩選得到所用富集培養(yǎng)基，其配方如下葡萄糖5g/L，K2HPO40.8g/L，KH2PO43.3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 1g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2mg/L，CaCl215mg/L，對(duì)羥基苯乙腈1g/L，自來(lái)水配置，自然pH。121℃滅菌15min，備用。
用于篩選微生物的土樣來(lái)自各種可分離到微生物的樣品，如果園、農(nóng)田、污水處理站等。
稱取5g土樣于50mL水中，用玻璃珠振蕩打碎，取懸濁液5mL于裝有45mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床28℃、150r/min培養(yǎng)4-5天。然后取1mL富集后的培養(yǎng)物于40mL新鮮的富集培養(yǎng)基中再進(jìn)行一輪富集培養(yǎng)。培養(yǎng)4-5天后進(jìn)行稀釋涂平板。先將培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，選取稀釋度為10-7、10-8、10-9、10-10等四個(gè)梯度進(jìn)行涂布，每一梯度做兩個(gè)對(duì)照，每次吸取涂布的菌懸液量為0.1mL。涂布完畢后置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間主要以長(zhǎng)出合適大小的單菌落為參考，一般為3-4天。待長(zhǎng)出合適大小的單菌落后，根據(jù)形態(tài)上的差異隨機(jī)挑取單菌落接種于試管斜面并分別編號(hào)，置生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)至長(zhǎng)滿整個(gè)斜面，時(shí)間一般為3-4天。
從已長(zhǎng)好的試管斜面上挑取一環(huán)菌體至裝有30mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)均在28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。培養(yǎng)48h后又加入5mL的2g/L的對(duì)羥基苯乙腈水溶液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完成后在9000r/min下離心10分鐘收集菌體，并用生理鹽水洗滌一次，離心棄上清后備用。
用10mLpH為7.0的0.2mol/L的磷酸鈉鹽緩沖液洗下菌體并倒至50mL的磨口三角瓶中，再加入2g/L的對(duì)羥基苯乙腈水溶液10mL，置于水浴搖床上30℃反應(yīng)，24h后取樣，離心取上清液進(jìn)行微濾，然后用薄板色譜法(TLC)檢測(cè)是否有對(duì)羥基苯乙酸生成。有對(duì)羥基苯乙酸生成的菌株即為所要篩選的菌株。
所篩選得到具有很強(qiáng)水解對(duì)羥基苯乙腈能力產(chǎn)生對(duì)羥基苯乙酸的枯草桿菌ZJB-063細(xì)胞形態(tài)為桿狀，長(zhǎng)0.6～0.8μm、寬2.0～3.0μm，活動(dòng)能力差，無(wú)鞭毛、有芽孢，革蘭氏染色陽(yáng)性；所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063生化實(shí)驗(yàn)過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，好氧，V.P.反應(yīng)陽(yáng)性，M.R.實(shí)驗(yàn)陰性，油脂水解陽(yáng)性，明膠液化陽(yáng)性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，石蕊牛奶反應(yīng)陽(yáng)性，生長(zhǎng)最高溫度40℃，脲酶測(cè)定陽(yáng)性。以上是對(duì)枯草桿菌ZJB-063的部分菌株形態(tài)與生理生化特征，詳細(xì)描述見(jiàn)表1表1枯草桿菌ZJB-063菌株形態(tài)與生理生化特征
注表中+表示陽(yáng)性，-表示陰性。
菌株的16s rDNA序列分析以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物p16S-85′-aga gttt gat cct ggctca g-3′和p16S-15415′-aag gag gtg atc cag ccg ca-3′擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)PCR擴(kuò)增成功獲得了一長(zhǎng)約為1.5kb的片段，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)該片段實(shí)際長(zhǎng)度為1489bp，其序列如下GGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAA。
將該序列(已提交GenBank，GenBank登記號(hào)為No.DQ474759)與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)，與枯草芽孢桿菌的同源性最高(homology，100％/1489bps，based on 16S rDNA)。同已知的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，利用Phylips(version 3.572)軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖1)，確定菌株ZJB-063的進(jìn)化地位，生理生化鑒定結(jié)合分子鑒定，可確認(rèn)該菌株為枯草芽孢桿菌，擬命名為Bacillus subtilis ZJB-063。
所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063可用來(lái)水解對(duì)羥基苯乙腈制備對(duì)羥基苯乙酸。
對(duì)羥基苯乙腈英文名為p-hydroxybenzylcyanide，分子式為C8H7NO，分子量133.15，主體為一苯環(huán)，其重要的基團(tuán)有一個(gè)氰基(-CN)和一個(gè)羥基(-OH)。黃色晶體熔點(diǎn)67-71℃，沸點(diǎn)756mmHg下330℃，有刺激性及毒性。
對(duì)羥基苯乙酸英文名為p-hydroxyphenylaceticacid，分子式為C8H8O3，主體為一苯環(huán)，其重要的基團(tuán)有對(duì)個(gè)羧基(-COOH)和一個(gè)羥基(-OH)。是一種白色或淺黃色的針狀結(jié)晶體，熔點(diǎn)為149-151℃，易升華，易溶于乙醚、乙醇、醋酸，部分溶于水，易溶于50-60℃熱水中。
由對(duì)羥基苯乙腈水解生成對(duì)羥基苯乙酸的反應(yīng)式如下 所述的應(yīng)用是將枯草芽孢桿菌ZJB-063菌種接種到適用于芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)獲得產(chǎn)生腈水解酶的微生物細(xì)胞，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心或過(guò)濾，得到菌體，將菌體細(xì)胞或處理過(guò)的菌體細(xì)胞添加到含有對(duì)羥基苯乙腈溶液中進(jìn)行水解反應(yīng)，最后對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分離，即得所述的對(duì)羥基苯乙酸。所述處理過(guò)的菌體細(xì)胞是指經(jīng)處理后得到的粗酶、固定化細(xì)胞、固定化酶。
用于本發(fā)明枯草芽孢桿菌ZJB-063菌種的培養(yǎng)基是一些含有可以被上述菌株利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等。作為碳源的有葡萄糖、乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、油脂類(豆油、豬油等)；作為氮源的有肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、氨鹽(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸胺等)，肽類(二肽、三肽等)；無(wú)機(jī)鹽類有Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金屬鹽類和磷酸鹽、醋酸鹽等有機(jī)酸鹽類；另可加有氨基酸類(如谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、微生素(VB1、VB2、VB12、VC、VE、煙酸等)、核酸類(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。
優(yōu)選的，所述的應(yīng)用是將枯草桿菌ZJB-063菌株的種子液接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.0％，酵母膏0.3％，NaCl0.1％，K2HPO40.02％，KH2PO4·3H2O0.02％，MgSO40.02％，用去離子水配制，pH自然；取種子培養(yǎng)基，分裝培養(yǎng)三角瓶中，滅菌；接入斜面菌種枯草桿菌ZJB-063，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)48h作為種子液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5～2.0％，酵母粉0.1～2.0g％，尿素0.0～1.0g％，谷氨酸鈉0.0～0.1％，K2HPO40.01～0.2％、KH2PO40.01～0.1％，(NH4)2SO40.0～1.0％，MgSO40.01～0.1％、FeCl20～0.01％，余量為去離子水；種子液接種量為2～5％體積比，培養(yǎng)條件為pH6～8、溫度20～40℃下培養(yǎng)1～3天。優(yōu)選的培養(yǎng)條件式在pH6.5～7.5，溫度28～32℃條件下培養(yǎng)48～60h。所述培養(yǎng)基組成以質(zhì)量/體積百分比計(jì)算，某物質(zhì)濃度為1％表示100mL溶液中含有1g該物質(zhì)?？刹捎门囵B(yǎng)方式有靜置培養(yǎng)、搖動(dòng)培養(yǎng)、或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)等，大量生產(chǎn)菌體時(shí)宜采用深層通風(fēng)攪拌培養(yǎng)。
按照上述方法培養(yǎng)獲得產(chǎn)生腈水解酶的微生物細(xì)胞，然后通過(guò)離心的方法分離出細(xì)胞。再將細(xì)胞或以處理過(guò)的細(xì)胞(粗酶、固定化細(xì)胞、固定化酶等)懸浮在水、或緩沖液、也可以是生理鹽水中，然后加入底物對(duì)羥基苯乙腈進(jìn)行水解反應(yīng)。所述水解反應(yīng)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度5～40℃，反應(yīng)pH 5～10，反應(yīng)2～48h。最適反應(yīng)溫度30～34℃、pH 8.6～9.0，底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)100％，酸的產(chǎn)率大于95％。加入底物對(duì)羥基苯乙腈的方式有多種，可以一次性加入，也可以逐漸地，以可控制的方式連續(xù)加入腈化合物，底物濃度最大達(dá)到25g/L。腈化合物在細(xì)胞或處理過(guò)的細(xì)胞的催化作用下轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基苯乙酸，反應(yīng)液中大約含有0.1％～1.5％(重量比)的干細(xì)胞和大約0.05％～2％(重量比)的腈化合物。
所述對(duì)羥基苯乙腈溶液中還添加有體積濃度0.1～90％的助溶劑，以增加底物的溶解度，所述助溶劑選自下列之一①甲醇、②二甲基亞砜、③乙醇、④乙二醇、⑤丙酮。
本發(fā)明中作為生物催化劑的微生物細(xì)胞或處理過(guò)的細(xì)胞(粗酶、固定化細(xì)胞、固定化酶等)可以重復(fù)利用。
所述轉(zhuǎn)化液分離方法為回收反應(yīng)液中的菌體細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂吸附，再用1～1.5mol/L鹽酸洗脫，往洗脫液中加入乙酸乙酯去除雜質(zhì)，收集水相加熱濃縮后冷卻結(jié)晶，過(guò)濾、沖洗、干燥，即得所述的對(duì)羥基苯乙酸。
在產(chǎn)物濃度較高的情況下可不過(guò)離子交換柱，直接向離心去除細(xì)胞后的轉(zhuǎn)化液中加入少量乙酸乙酯去除雜質(zhì)后即可加熱濃縮。然后經(jīng)冷卻結(jié)晶，過(guò)濾干燥，最終對(duì)羥基苯乙酸的產(chǎn)率可達(dá)90％以上，產(chǎn)品純度在98％以上。
具體的，所述對(duì)羥基苯乙酸制備方法如下
(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成葡萄糖1.0％，酵母膏0.3％，NaCl 0.1％，K2HPO40.02％，KH2PO4·3H2O 0.02％，MgSO40.02％，用去離子水配制，pH自然；將種子培養(yǎng)基分裝、滅菌，接入斜面枯草芽孢桿菌ZJB-063菌種，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃搖床培養(yǎng)48h作為種子液，備用；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖1.8％，酵母膏0.5％，K2HPO40.05％，KH2PO4·3H2O 0.05％，MgSO40.1％，味精0.076％，尿素0.75％，用去離子水配制，pH自然；將發(fā)酵培養(yǎng)基分裝、滅菌，以體積比2％接種量接入種子液，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)60h；(3)催化水解發(fā)酵液離心收集菌體，用生理鹽水配制菌懸液，與質(zhì)量濃度0.1％的對(duì)羥基苯乙腈水溶液混合，pH7.0、30℃水浴中轉(zhuǎn)化3h；(4)產(chǎn)物分離轉(zhuǎn)化液離心去除菌體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液用弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301-FC(購(gòu)自浙江千秋環(huán)保水處理有限公司)吸附，用水淋洗，然后用1mol/L鹽酸洗脫，向洗脫液中加入乙酸乙酯去除其它雜質(zhì)，收集水相并加熱濃縮冷卻結(jié)晶，過(guò)濾，少量水沖洗后置于烘箱中干燥，即得所述的對(duì)羥基苯乙酸。
用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)等的分析方法可以對(duì)發(fā)酵液中的對(duì)羥基苯乙酸及對(duì)羥基苯乙腈進(jìn)行分析。用薄層層析(TLC)的分析方法如下薄板為普通硅膠板，所用流動(dòng)相為95％的乙醇水溶液，室溫下經(jīng)過(guò)30-40分鐘層析，在碘缸中顯色，對(duì)羥基苯乙酸Rf＝0.558，對(duì)羥基苯乙腈Rf＝0.854。高效液相色譜檢測(cè)方法為所用色譜柱填料為HypersilODS2(5μm)，尺寸為4.6mm×250mm(大連依利特公司生產(chǎn))。分離對(duì)羥基苯乙腈及對(duì)羥基苯乙酸等物質(zhì)的流動(dòng)相組成為V(甲醇)∶V(水)∶V(四氫呋喃)∶V(乙酸)＝35∶65∶8∶1。對(duì)羥基苯乙酸及對(duì)羥基苯乙腈的出峰時(shí)間分別為4.7min和5.2min。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過(guò)篩選得到一株新的菌株來(lái)生物法合成對(duì)羥基苯乙酸，代替化學(xué)合成的方法。具有轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境友好，過(guò)程綠色等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)該菌株可以將高毒性的腈類化合物水解成危害較小的酸類物質(zhì)，生物法是迄今處理工業(yè)廢水中高毒性腈化合物最經(jīng)濟(jì)、最有效的一種方法，所以本發(fā)明在環(huán)境治理上也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1為Bacillus subtilis ZJB-063與相關(guān)菌株的進(jìn)化樹(shù)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1種子培養(yǎng)基配方(重量/體積百分比，以下同)葡萄糖1.0％，酵母膏0.3％，NaCl0.1％，K2HPO40.02％，KH2PO4·3H2O0.02％，MgSO40.02％，用去離子水配制，pH自然。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖1.8％，酵母膏0.5％，K2HPO40.05％，KH2PO4·3H2O0.05％，MgSO40.1％，味精0.076％，尿素0.75％，用去離子水配制，pH自然。
取100mL上述種子培養(yǎng)基，平均分裝在2個(gè)250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種枯草芽孢桿菌ZJB-063，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)48h作為種子液，備用。
取1L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分裝入10個(gè)500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為2％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為60h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液在9000r/min下離心收集菌體，并將菌體懸浮于200mL生理鹽水中制得菌懸液，將菌懸液與用緩沖液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.2mol/L)配制的對(duì)羥基苯乙腈水溶液等體積混合后，置于30℃的水浴搖床上反應(yīng)，底物濃度為1g/L，pH為7.0轉(zhuǎn)化3h后，離心去除轉(zhuǎn)化液中的細(xì)胞，用高效液相色譜檢測(cè)。得對(duì)羥基苯乙腈的轉(zhuǎn)化率為100％。將轉(zhuǎn)化液離心去除細(xì)胞，并過(guò)濾，將該轉(zhuǎn)化液經(jīng)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301-FC(購(gòu)自浙江千秋環(huán)保水處理有限公司)吸附，用水淋洗，然后用1mol/L鹽酸洗脫，洗脫體積為150mL。向洗脫液中加入20mL的乙酸乙酯，振蕩以去除洗脫液中的其它雜質(zhì)。收集水相并加熱濃縮后置于冰箱中冷卻即會(huì)有對(duì)羥基苯乙酸晶體析出。最后濾紙過(guò)濾，少量水沖洗后置于烘箱中干燥，即可得產(chǎn)品對(duì)羥基苯乙酸，最終產(chǎn)率在91.3％。
實(shí)施例2發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方葡萄糖2.0％，酵母粉0.7％(NH4)2SO40.5％，KCl1.0％，K2HPO4·12H2O0.05％，NaH2PO4·2H2O0.05％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，用HCl調(diào)節(jié)pH為6.5。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種枯草芽孢桿菌ZJB-063，培養(yǎng)菌體50h，然后進(jìn)行離心分離收集得到菌體，將這些菌體加入到500mL對(duì)羥基苯乙腈水溶液中，最終底物濃度為3g/L，利用菌體水解對(duì)羥基苯乙腈；反應(yīng)條件溫度33℃，初始pH為6.8，轉(zhuǎn)化時(shí)間為4h，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，得對(duì)羥基苯乙腈的轉(zhuǎn)化率為100％。將轉(zhuǎn)化液離心去除細(xì)胞，并過(guò)濾，并將該轉(zhuǎn)化液經(jīng)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301-FC吸附，用水淋洗，然后用1mol/L鹽酸洗脫，洗脫體積為200mL。向洗脫液中加入20mL的乙酸乙酯，振蕩以去除洗脫液中的其它雜質(zhì)。收集水相并加熱濃縮后置于冰箱中冷卻即會(huì)有對(duì)羥基苯乙酸晶體析出。最后濾紙過(guò)濾，少量水沖洗后置于烘箱中干燥，即可得產(chǎn)品對(duì)羥基苯乙酸，最終產(chǎn)率在93.1％。
實(shí)施例3液體種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖0.5％，酵母粉2％，尿素0.4g％，谷氨酸鈉0.1％，K2HPO40.01％，KH2PO40.01％，(NH4)2SO41.0％，MgSO40.01％、pH自然。
取100mL液體種子培養(yǎng)基，平均分裝在2個(gè)250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種枯草芽孢桿菌ZJB-063，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)36h作為種子液，備用。
取2L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分裝入20個(gè)500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為4％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為60h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
9000r/min下離心收集菌體，用蒸餾水洗滌兩次，用玻璃珠打碎菌團(tuán)后平均分裝到10個(gè)500mL的三角瓶中，每個(gè)三角瓶中加入200mL緩沖液(甘氨酸-氫氧化鈉，0.05mol/L)，pH為9.2，向每瓶中加入10mL乙醇，底物對(duì)羥基苯乙腈的濃度為10g/L，置于30℃，100r/min的搖床上轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化12h后，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)得底物轉(zhuǎn)化率已達(dá)100％。將所得到的轉(zhuǎn)化液離心去除細(xì)胞，將上清液收集得到1900mL轉(zhuǎn)化液，向該上清液中加入200mL乙酸乙酯，用以去除乙醇及其它雜質(zhì)。將水相收集后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并經(jīng)冷卻結(jié)晶，過(guò)濾干燥后得到產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙酸。最終對(duì)羥基苯乙酸的產(chǎn)率為90.5％。
實(shí)施例4液體種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄1.35％，酵母粉0.65％，(NH4)2SO40.55％，K2HPO40.066％，KH2PO40.05％，MgSO40.05％，pH自然。
取100mL液體種子培養(yǎng)基，平均分裝在2個(gè)250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種枯草芽孢桿菌ZJB-063，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)45h作為種子液，備用。
取2L上述發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分裝入20個(gè)500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為3％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為72h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
9000r/min下離心收集菌體，用蒸餾水洗滌兩次，用玻璃珠打碎菌團(tuán)后平均分裝到10個(gè)500mL的三角瓶中，每個(gè)三角瓶中加入200mL緩沖液(甘氨酸-氫氧化鈉，0.05mol/L)，pH為8.6，底物對(duì)羥基苯乙腈的濃度為1g/L，置于30℃，100r/min的搖床上轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化開(kāi)始后每隔2-3h向每瓶中加入0.2g底物，所加的底物使緩沖體系中的底物濃度提高1g/L，經(jīng)轉(zhuǎn)化48h后，底物的累積濃度已到約25g/L，共加入底物50g。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)得底物轉(zhuǎn)化率已達(dá)100％。將所得到的轉(zhuǎn)化液離心去除細(xì)胞，將上清液收集，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將產(chǎn)物濃縮，冷卻結(jié)晶，過(guò)濾后少量水洗滌，將剩余的對(duì)羥基苯乙酸濾液收集后可再進(jìn)行分離，干燥后得到產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙酸，產(chǎn)率為93.2％。
實(shí)施例5液體種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方 葡萄糖2.0％，尿素0.8％，酵母膏0.1％，NaCl0.5％，K2HPO4·12H2O1.0％，KH2PO4·2H2O0.5％，MgSO40.02％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.5。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，按4％(v/v)的接種量接入液體種子枯草芽孢桿菌ZJB-063。培養(yǎng)50h后離心收集菌體，將菌體懸浮地于200mLpH為8.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，用超聲波將菌體破碎，再進(jìn)行離心去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片后得粗酶液180mL，加入pH為8.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液120mL后共得300mL。向該粗酶液中加入對(duì)羥基苯乙腈，最終底物濃度為3g/L。反應(yīng)條件溫度32℃，初始pH為8.0，轉(zhuǎn)化時(shí)間為10h左右，反應(yīng)在靜置下進(jìn)行。取上述轉(zhuǎn)化液2mL，進(jìn)行離心后取上清液，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，得對(duì)羥基苯乙腈的轉(zhuǎn)化率為100％。將轉(zhuǎn)化液離心取上清液，向上清液中加入20mL乙酸乙酯，將水相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將產(chǎn)濃縮，冷卻結(jié)晶，過(guò)濾后少量水洗滌，將剩余的對(duì)羥基苯乙酸濾液收集后可再進(jìn)行分離，干燥后得到產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙酸，產(chǎn)率為91.8％。
實(shí)施例6液體種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方 葡萄糖1.5％，尿素0.1％，酵母膏1％，NaCl0.1％，K2HPO4·12H2O1.0％，KH2PO4·2H2O0.5％，MgSO40.05％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.5。
取2000mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，按2％(v/v)的接種量接入液體種子枯草芽孢桿菌ZJB-063。培養(yǎng)48h后離心收集菌體，將菌體懸浮地于400mLpH為9.2的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，用超聲波將菌體破碎，再進(jìn)行離心去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片后得粗酶液380mL，加入pH為9.2的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液220mL后共得600mL。向該粗酶液中加入對(duì)羥基苯乙腈，并加入40mL乙醇為促溶劑，最終底物濃度為12g/L。反應(yīng)條件溫度35℃，初始pH為9.2，轉(zhuǎn)化時(shí)間為18h左右，反應(yīng)在靜置下進(jìn)行。取上述轉(zhuǎn)化液2mL，進(jìn)行離心后取上清液，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，得對(duì)羥基苯乙腈的轉(zhuǎn)化率為98％。將轉(zhuǎn)化液離心(12000r/min，5min)取上清液，向上清液中加入80mL乙酸乙酯，將水相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將產(chǎn)濃縮，冷卻結(jié)晶，過(guò)濾后少量水洗滌，將剩余的對(duì)羥基苯乙酸濾液收集后可再進(jìn)行分離，干燥后得到產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙酸，產(chǎn)率為89.6％。
實(shí)施例7液體種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖1.5％，酵母膏0.2％，牛肉膏0.5％，NaCl0.1％，K2HPO4·12H2O0.05％，KH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，F(xiàn)eCl20.001％，用去離子水配制，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH為6.0。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，按5％(v/v)的接種量接入液體種子枯草芽孢桿菌ZJB-063。培養(yǎng)72h后離心收集菌體，將菌體懸浮于250mL pH為7.5的HCl-Tris緩沖液(0.05mol/L)中，用超聲波將菌體破碎，再進(jìn)行離心去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片后得粗酶液380mL，加入pH為7.5的HCl-Tris緩沖液(0.05mol/L)250mL后共得500mL。向該粗酶液中加入對(duì)羥基苯乙腈，并加入50mL二甲基亞砜(DMSO)為促溶劑，最終底物濃度為14g/L。反應(yīng)條件溫度30℃，初始pH為7.5，在水浴搖床上進(jìn)行轉(zhuǎn)化(50r/min)，時(shí)間為16h左右。取上述轉(zhuǎn)化液2mL，進(jìn)行離心后取上清液，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，得對(duì)羥基苯乙腈的轉(zhuǎn)化率為98％。將轉(zhuǎn)化液離心(12000r/min，5min)取上清液，向上清液中加入100mL乙酸乙酯，將水相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將產(chǎn)物濃縮，冷卻結(jié)晶，過(guò)濾后少量水洗滌，將剩余的對(duì)羥基苯乙酸濾液收集后可再進(jìn)行分離，干燥后得到產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙酸，產(chǎn)率為90.8％。
序列表.WorkFileApplication Project-------------------<120>Title枯草芽孢桿菌ZJB-063及其應(yīng)用<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate____-__-__Sequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringgggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga60gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag120actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtctgaac cgcatggttc180agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt240ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca300cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca360atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag420ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa480ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt540gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc600cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt660ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaceag tggcgaaggc720gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga780taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt840agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact900caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg960cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc1020gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt1080aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa
序列表.WorkFile1140ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt1200atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt1260taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga1320agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg1380tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt1440taggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaa1489<212>TypeDNA<211>Length1489SequenceNameZJB-063菌株的16s rDNASequenceDescriptionSequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringagagtttgat cctggctcag20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName引物p16S-8SequenceDescriptionSequence-------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringaaggaggtga tccagccgca20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName引物p16S-1541SequenceDescription
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌ZJB-063(Bacillus subtilis ZJB-063)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC No.M 206038，保藏日期2006年4月14日。
2.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063，其特征在于所述枯草芽孢桿菌ZJB-063的16S rDNA基因序列為GGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAA。
3.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063，其特征在于所述的枯草桿菌ZJB-063細(xì)胞形態(tài)為桿狀，長(zhǎng)0.6～0.8μm、寬2.0～3.0μm，活動(dòng)能力差，無(wú)鞭毛、有芽孢，革蘭氏染色陽(yáng)性；所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063生化實(shí)驗(yàn)過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，好氧，V.P.反應(yīng)陽(yáng)性，M.R.實(shí)驗(yàn)陰性，油脂水解陽(yáng)性，明膠液化陽(yáng)性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，石蕊牛奶反應(yīng)陽(yáng)性，生長(zhǎng)最高溫度40℃，脲酶測(cè)定陽(yáng)性。
4.如權(quán)利要求1～3之一所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063在制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063在制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將枯草芽孢桿菌ZJB-063菌種接種到適用于芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心或過(guò)濾，得到菌體，將菌體細(xì)胞或處理過(guò)的菌體細(xì)胞添加到含有對(duì)羥基苯乙腈溶液中進(jìn)行水解反應(yīng)，最后對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分離，即得所述的對(duì)羥基苯乙酸。
6.如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063在制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將枯草桿菌ZJB-063菌種的種子液接種入發(fā)醇培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.0％，酵母膏0.3％，NaCl0.1％，K2HPO40.02％，KH2PO4·3H2O0.02％，MgSO40.02％，用去離子水配制，pH自然；取種子培養(yǎng)基，分裝培養(yǎng)容器中，滅菌；接入斜面菌種枯草桿菌ZJB-063，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)48h作為種子液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5～2.0％，酵母粉0.1～2.0g％，尿素0.0～1.0g％，谷氨酸鈉0.0～0.1％，K2HPO40.01～0.2％、KH2PO40.01～0.1％，(NH4)2SO40.1～1.0％，MgSO40.01～0.1％、FeCl20.001～0.01％，余量為去離子水；種子液接種量為2～5％體積比，培養(yǎng)條件為pH6～8、溫度20～40℃下培養(yǎng)1～3天。
7.如權(quán)利要求5所述的枯草桿菌ZJB-063在微生物水解制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用，其特征在于所述水解反應(yīng)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度5～40℃，反應(yīng)pH 5～10，反應(yīng)2～4h。
8.如權(quán)利要求5所述的枯草桿菌ZJB-063在微生物水解制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用，其特征在于所述對(duì)羥基苯乙腈溶液中還添加有體積濃度0.1～90％的助溶劑，所述助溶劑選自下列之一①甲醇、②二甲基亞砜、③乙醇、④乙二醇、⑤丙酮。
9.如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063在微生物水解制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化液分離方法為回收反應(yīng)液中的菌體細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化液經(jīng)弱堿性陰離子吸附，再用1～1.5mol/L鹽酸洗脫，往洗脫液中加入乙酸乙酯去除雜質(zhì)，收集水相加熱濃縮后冷卻結(jié)晶，過(guò)濾、沖洗、干燥，即得所述的對(duì)羥基苯乙酸。
10.如權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌ZJB-063在微生物水解制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用，其特征在于所述對(duì)羥基苯乙酸制備方法如下(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成葡萄糖1.0％，酵母膏0.3％，NaCl 0.1％，K2HPO40.02％，KH2PO4·3H2O 0.02％，MgSO40.02％，用去離子水配制，pH自然；將種子培養(yǎng)基分裝、滅菌，接入斜面枯草芽孢桿菌ZJB-063菌種，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃搖床培養(yǎng)48h作為種子液，備用；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖1.8％，酵母膏0.5％，，K2HPO40.05％，KH2PO4·3H2O 0.05％，MgSO40.1％，味精0.076％，尿素0.75％，用去離子水配制，pH自然；將發(fā)酵培養(yǎng)基分裝、滅菌，以體積比2％接種量接入種子液，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下培養(yǎng)60h；(3)催化水解發(fā)酵液離心收集菌體，用去離子水配制菌懸液，與質(zhì)量濃度0.1％的對(duì)羥基苯乙腈水溶液混合，pH7.0、30℃水浴中轉(zhuǎn)化3h；(4)產(chǎn)物分離轉(zhuǎn)化液離心去除菌體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液經(jīng)弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301-FC吸附，用水淋洗，然后用1mol/L鹽酸洗脫，向洗脫液中加入乙酸乙酯去除其它雜質(zhì)，收集水相并加熱濃縮冷卻結(jié)晶，過(guò)濾，少量水沖洗后置于烘箱中干燥，即得所述的對(duì)羥基苯乙酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了從土壤中篩選到的微生物新菌株枯草芽孢桿菌ZJB－063，及其在制備對(duì)羥基苯乙酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過(guò)篩選得到新的菌株來(lái)生物法合成對(duì)羥基苯乙酸，代替化學(xué)合成的方法。具有轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境友好，過(guò)程綠色等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)該菌株可以將高毒性的腈類化合物水解成危害較小的酸類物質(zhì)，生物法是迄今處理工業(yè)廢水中高毒性腈化合物最經(jīng)濟(jì)、最有效的一種方法，所以本發(fā)明在環(huán)境治理上也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12P7/42GK101037658SQ20061005059
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月29日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 吳明火, 柳志強(qiáng), 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)