專利名稱：一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒(流感)的臨床癥狀易與普通感冒相混淆，最終必須通過實(shí)驗(yàn)室方法來進(jìn)行確診。近年來，國外開發(fā)出流感病毒快速診斷試劑盒，其原理有熒光法，酶標(biāo)法，金標(biāo)法等等，雖能達(dá)到快速診斷的目的，但其敏感度遠(yuǎn)低于病毒分離法，假陰性較高，加上價(jià)格昂貴，在我國實(shí)際上很少使用。流感病毒的RT-PCR檢測(cè)較經(jīng)典的病毒分離方法更為敏感，而且6～7h就可得出結(jié)果，但其存在著檢測(cè)易污染與假陽性率高的缺點(diǎn)。
近幾年發(fā)展起來的熒光定量PCR技術(shù)，它利用了PCR對(duì)脫氧核糖核酸(DNA)的高效擴(kuò)增，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性以及定量特點(diǎn)，不僅克服了常規(guī)PCR定性檢測(cè)的不足，而且具有直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高和易操作等優(yōu)點(diǎn)。
熒光定量PCR技術(shù)原理熒光定量PCR是利用熒光染料在激發(fā)光的作用下所釋放的熒光光能的變化來動(dòng)態(tài)直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。因熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，通過足夠靈敏的自動(dòng)化熒光定量PCR儀就可以通過對(duì)熒光信號(hào)的采集與分析來實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量。
常用的熒光標(biāo)記方法可簡(jiǎn)單分為兩大類1、非特異檢測(cè)-雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料；2、擴(kuò)增序列專一檢測(cè)-主要指熒光探針和特異性引物，熒光標(biāo)記的探針共有三類(1)分子信標(biāo)探針；(2)雜交雙探針；(3)Taqman雙標(biāo)記探針。廣泛使用的TaqMan探針法是指PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5′端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團(tuán)淬滅，儀器檢測(cè)不到5′端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào)(就是說5′端熒光基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)正好是3′端熒光基團(tuán)的吸收波長(zhǎng)，因而能量被吸收傳遞到3′端熒光基團(tuán)而發(fā)出其它熒光)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會(huì)將切割探針，釋放5′端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，5′端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)就可以被探頭檢測(cè)到。也就是說每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。從儀器檢測(cè)出熒光值出峰的最低循環(huán)數(shù)(cyclethreshold，Ct)與檢測(cè)病毒核酸量對(duì)數(shù)值呈線性負(fù)相關(guān)。根據(jù)熒光定量PCR反應(yīng)中的Ct值就能算出原始的模板量。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明就是根據(jù)上述原理，設(shè)計(jì)適合甲1型流感病毒的特異性引物和特異性探針，發(fā)明目的在于提供一種甲1型流感病毒的基因快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括甲1型流感病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品、熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑以及DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶，所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑主要包括一步法RT-PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列為5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列FluA1(YG)F35’-GGAATAGCCCCACTACAATTGG-3’，下游引物序列FluA1(YG)R25’-AATTCGCATTCTGGGTTTCCT-3’，所述特異性探針序列為FluA1 PB2-35’FAM-AGATCCATCCGGCAACGCTGCA-TAMRA 3’，其中FAM為報(bào)告熒光基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。
所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑主要成分如下一步法RT-PCR緩沖液 終濃度為1×特異性擴(kuò)增上游引物 0.6～1.0μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.6～1.0μM特異性探針 0.2～0.6μM脫氧三磷酸核苷混合物400～800μM余量為DEPC水。
上述各物質(zhì)濃度均為各物質(zhì)在反應(yīng)體系中的終濃度。脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate(焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫、高壓消毒的MiliQ級(jí)純水。
所述一步法RT-PCR緩沖液終濃度為1×，意思是緩沖液中各組分濃度與1×RT-PCR buffer相同，即表示緩沖液中各組分在反應(yīng)液中終濃度如下KCl 50mM，Tris-HCl 10mM，TritonX-100 0.1％，MgCl21.5mM。本發(fā)明中選用體積為反應(yīng)液總體積50％的2×RT-PCR buffer。
通常，為減少RNA酶污染，所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑中還添加有RNA酶抑制劑，本發(fā)明中RNA酶抑制劑優(yōu)選終濃度為0.8活力單位/μL的RNasin。RNasin核酸酶抑制劑是由Promega研究和開發(fā)的，具有廣譜的RNA酶抑制活力，用于清除RNA酶污染。RNasin核酸酶抑制劑是1個(gè)50kD大小的蛋白，它和RNA酶以非共價(jià)鍵按1∶1結(jié)合，而抑制RNA酶活力，結(jié)合常數(shù)為10-14。RNasin核酸酶抑制劑的活力單位定義為抑制5ngRNase A水解2`，3`-單磷酸環(huán)化胞苷的50％的活力所用的抑制劑的量。
所述脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP物質(zhì)的量1∶1∶1∶1的混合物。
所述DNA聚合酶用量為0.5～5酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。
所述逆轉(zhuǎn)錄酶用量為6～300酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①M(fèi)-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶；②AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
具體的，所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑組成如下一步法RT-PCR buffer 終濃度為1×RNA酶抑制劑RNasin0.8活力單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物 0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.88μM特異性探針0.32μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μM余量為DEPC水。
一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)方法，所述的檢測(cè)方法以甲1型流感病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用待測(cè)病人的含漱液為分析樣本，所述方法步驟如下(1)取含漱液提取病毒RNA；(2)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)取熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑與反應(yīng)所需的DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶配成反應(yīng)液，加入對(duì)照品與分析樣本的RNA分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)；(3)結(jié)果分析選擇熒光檢測(cè)模式FAM熒光，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)；閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)；熒光增長(zhǎng)曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，判斷為陽性；所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列為5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑主要包括一步法RT-PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列FluA1(YG)F35’-GGAATAGCCCCACTACAATTGG-3’，下游引物序列FluA1(YG)R25’-AATTCGCATTCTGGGTTTCCT-3’，所述特異性探針序列為FluA1 PB2-35’FAM-AGATCCATCCGGCAACGCTGCA-TAMRA 3’，其中FAM為報(bào)告熒光基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。
具體的，所述的方法取定量熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑配制反應(yīng)液，反應(yīng)體系每25μL組成如下
2×RT-PCR buffer 12.5μLRNA酶抑制劑RNasin 0.8活力單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物0.88μM特異性探針0.32μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μMAmpli TaqR DNA聚合酶2.5酶活力單位/反應(yīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶50酶活力單位/反應(yīng)分析樣本病毒RNA 5μLDEPC水補(bǔ)足至25μL；所述檢測(cè)方法步驟(2)PCR循環(huán)條件設(shè)置為45℃30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2min，以93℃15s，50℃退火30sec擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在50℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。退火溫度適宜范圍為50～55℃，退火時(shí)間適宜范圍為30sec～1min。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在1、早期診斷PCR可直接檢測(cè)病原體核酸，在流感發(fā)病早期，就可以檢測(cè)出是否含有甲1型流感病毒特異性基因，為及早隔離、確診和治療提供方便。
2、取樣簡(jiǎn)單方便可取潛伏期或發(fā)病早期流感患者呼吸道樣本進(jìn)行檢測(cè)。
3、與傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增技術(shù)相比，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法省時(shí)省力，可在2～3小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。
4、靈敏度高，由于采用了特異性基因擴(kuò)增和特異性基因探針雜交結(jié)合的雙重技術(shù)，診斷的靈敏度更高。
5、采用計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中即可判斷是否含有病毒基因，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷方便準(zhǔn)確。
6、可實(shí)現(xiàn)病毒核酸的定量分析。
(四)說明書附1為熒光定量RT-PCR對(duì)甲1型流感病毒核酸檢測(cè)的敏感性和重復(fù)性；A1000TCID50/管；B100TCID50/管；C10TCID50/管；D1TCID50/管；E0.1TCID50/管，TCID50為病毒滴度單位；圖2為熒光定量RT-PCR方法對(duì)部分甲1型流感疑似患者含漱液樣本檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1浙江省疑似流感暴發(fā)疫情及流感監(jiān)測(cè)醫(yī)院送檢的8份患者含漱液應(yīng)用本發(fā)明TaqMan熒光定量RT-PCR方法，常規(guī)RT-PCR方法與病毒分離方法進(jìn)行檢測(cè)，其中病毒分離陽性5份，RT-PCR陽性6份，TaqManRT-PCR陽性7份，這三者檢測(cè)的陽性患者結(jié)果一致。對(duì)于熒光RT-PCR陽性而病毒分離陰性的病例為了排除熒光RT-PCR結(jié)果假陽性的可能性，我們對(duì)患者發(fā)病早期和恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行流感病毒血凝抑制抗體(HI)測(cè)定，結(jié)果甲1型流感病毒HI抗體均≥4倍增長(zhǎng)，血清學(xué)與TaqMan RT-PCR結(jié)果完全一致。
TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系組成如下
2×RT-PCR buffer 12.5μLRNA酶抑制劑RNasin 0.8活力單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物0.88μM特異性探針0.32μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μMAmpli TaqR DNA聚合酶2.5酶活力單位/反應(yīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶50酶活力單位/反應(yīng)分析樣本病毒RNA(1μg/μL)5μLDEPC水補(bǔ)足至25μL；PCR循環(huán)條件設(shè)置為45℃30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2min，以93℃15s，50℃退火30sec擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在50℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。
敏感性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)方法對(duì)已知病毒滴度的105TCID50/ml流感病毒株甲1/北京/53/97株按10倍系列稀釋成1000、100、10、1、0.1TCID505個(gè)梯度，每個(gè)梯度各取200μL，提取病毒RNA，進(jìn)行熒光定量RT-PCR(方法同上)，對(duì)每一個(gè)濃度的樣本，都重復(fù)3次，見

圖1。結(jié)果表明甲1型流感熒光定量RT-PCR的敏感性為0.1TCID50。通過評(píng)價(jià)每個(gè)稀釋度重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)(CV)評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。見表1。變異系數(shù)均小于3％，說明該方法重復(fù)性良好。
表1熒光定量RT-PCR檢測(cè)甲1型流感病毒的重復(fù)性
熒光定量RT-PCR方法對(duì)部分甲1型流感疑似患者含漱液樣本檢測(cè)的結(jié)果見圖2。
對(duì)105TCID50/ml流感病毒株甲1/北京/53/97株按10倍系列稀釋成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID50，提取病毒RNA，進(jìn)行熒光定量PCR，并與常規(guī)RT-PCR和病毒分離相比較。結(jié)果見表2結(jié)果表明熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)甲1型流感病毒的敏感性，高于經(jīng)典的病毒分離法，靈敏度與RT-PCR方法相一致。
表2熒光定量RT-PCR、RT-PCR和病毒分離的檢測(cè)敏感度比較
序列表.WorkFileApplication Project-------------------<120>Title一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate----------Sequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringggaatagccc cactacaatt gggtaattgc agcgttgccg gatggatgga tcttaggaaa60cccagaatgc gaatt75<212>TypeRNA<211>Length75SequenceName甲1型流感病毒血凝素基因SequenceDescriptionSequence---------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringggaatagccc cactacaatt gg22<212>TypeRNA<211>Length22SequenceName上游引物FluA1(YG)F3SequenceDescriptionSequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringaattcgcatt ctgggtttcc t21<212>TypeRNA<211>Length21SequenceName下游引物FluA1(YG)R2SequenceDescriptionSequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringagatccatcc ggcaacgctg ca22
<212>TypeRNA<211>Length22SequenceName特異性探針SequenceDescription
權(quán)利要求
1.一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括甲1型流感病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品、熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑以及DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶，所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑主要包括一步法RT-PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，其特征在于所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列為5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列FluA1(YG)F35’-GGAATAGCCCCACTACAATTGG-3’，下游引物序列FluA1(YG)R25’-AATTCGCATTCTGGGTTTCCT-3’，所述特異性探針序列為FluA1 PB2-35’FAM-AGATCCATCCGGCAACGCTGCA-TAMRA3’，其中FAM為報(bào)告熒光基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑主要成分如下一步法RT-PCR緩沖液終濃度為1×特異性擴(kuò)增上游引物 0.6～1.0μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.6～1.0μM特異性探針 0.2～0.6μM脫氧三磷酸核苷混合物400～800μM余量為DEPC水。
3.如權(quán)利要求2所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑中還添加有RNA酶抑制劑
4.如權(quán)利要求3所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述RNA酶抑制劑為終濃度為0.8活力單位/μL的RNasin。
5.如權(quán)利要求1所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP物質(zhì)的量1∶1∶1∶1的混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述DNA聚合酶用量為0.5～5酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①Ampli TaqR DNA聚合酶；②rTth DNA聚合酶；③rTth DNA聚合酶XL。
7.如權(quán)利要求1所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄酶用量為6～300酶活力單位/反應(yīng)，選自下列之一①M(fèi)-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶；②AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
8.如權(quán)利要求1所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑組成如下2×RT-PCR buffer 終濃度為1×RNA酶抑制劑RNasin 0.8活力單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物 0.88μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.88μM特異性探針 0.32μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μM余量為DEPC水。
9.一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于所述的檢測(cè)方法以甲1型流感病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用待測(cè)病人的含漱液為分析樣本，所述方法步驟如下(1)取含漱液提取病毒RNA；(2)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)取熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑與反應(yīng)所需的DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶配成反應(yīng)液，加入對(duì)照品與分析樣本的RNA分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測(cè)；(3)結(jié)果分析選擇熒光檢測(cè)模式FAM熒光，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)；閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)；熒光增長(zhǎng)曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，判斷為陽性；所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列為5’-GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT-3’，所述熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑主要包括一步法RT-PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，所述特異性擴(kuò)增引物為上游引物序列FluA1(YG)F35’-GGAATAGCCCCACTACAATTGG-3’，下游引物序列FluA1(YG)R25’-AATTCGCATTCTGGGTTTCCT-3’，所述特異性探針序列為FluA1PB2-35’FAM-AGATCCATCCGGCAACGCTGCA-TAMRA3’，其中FAM為報(bào)告熒光基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求9所述的甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于所述的方法取定量熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑配制反應(yīng)液，反應(yīng)體系每25μL組成如下2×RT-PCR bufffer 12.5μLRNA酶抑制劑RNasin 0.8活力單位/μL特異性擴(kuò)增上游引物 0.4μM特異性擴(kuò)增下游引物 0.4μM特異性探針 0.2μM脫氧三磷酸核苷混合物為dATP、dTTP、dCTP、dGTP各150μMAmpli TaqR DNA聚合酶2.5酶活力單位/反應(yīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 50酶活力單位/反應(yīng)分析樣本病毒RNA 5μLDEPC水補(bǔ)足至25μL；所述檢測(cè)方法步驟(2)PCR循環(huán)條件設(shè)置為45℃30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃變性2min，以93℃15s，50℃退火30sec擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在50℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種甲1型流感病毒熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其利用試劑盒檢測(cè)甲1型流感病毒的方法，試劑盒包括甲1型流感病毒血凝素基因標(biāo)準(zhǔn)品、熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑以及DNA聚合酶與逆轉(zhuǎn)錄酶，熒光擴(kuò)增檢測(cè)試劑主要包括一步法RT－PCR緩沖液、特異性擴(kuò)增引物及特異性探針、脫氧三磷酸核苷混合物，所述甲1型流感病毒血凝素基因部分序列為5’－GGAATAGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTG CCGGATGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATT－3’，本發(fā)明方法可直接檢測(cè)病原體核酸，在流感發(fā)病早期，就可以檢測(cè)出是否含有甲1型流感病毒特異性基因，為及早隔離、確診和治療提供方便。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1904070SQ200610050680
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者嚴(yán)菊英, 盧亦愚, 茅海燕, 馮燕, 史雯, 周敏, 李敏紅 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心