專利名稱：一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法，它屬于基因治療領(lǐng)域新型高效非病毒基因傳遞體系的制備方法和技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代基因技術(shù)和人類基因組工程圖譜的完成，為采用基因分子生物學(xué)方法治療各類疾病，提高人類生命質(zhì)量提供了廣闊的前景?；蛑委煶蔀楫?dāng)前最活躍的生物高技術(shù)領(lǐng)域之一。由于裸露的核酸分子難以在體液中穩(wěn)定存在，在主要器官中只能實現(xiàn)低層次的表達(dá)，尋求能夠?qū)崿F(xiàn)廣泛基因表達(dá)的基因傳遞體系成為基因治療在大規(guī)模臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵問題。病毒載體雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但潛在的毒性、免疫原性及靶向性等問題限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。開發(fā)具有高效安全和組織特異性的高生物相容性非病毒基因傳遞體系具有非常重要的意義。
陽離子聚合物由于具有可控的結(jié)構(gòu)、較低的免疫原性及優(yōu)異的濃縮DNA分子的能力，受到越來越多的關(guān)注。陽離子聚合物能與DNA通過靜電吸引形成電荷中和的疏水性核，而過量陽離子聚合物則在外層形成保護(hù)的殼層。但陽離子聚合物/DNA基因組裝體在體內(nèi)傳遞時，易與體內(nèi)的血液成分及細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生非特異性吸附，導(dǎo)致在體內(nèi)的聚集并被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除出體內(nèi)，降低基因傳遞體系在體內(nèi)的循環(huán)時間并影響基因轉(zhuǎn)染效率。制備聚乙二醇(PEG)化的基因傳遞體系可有效解決上述問題。已有研究均是通過化學(xué)鍵合的方式將PEG鏈段引入到基因傳遞體系中，但這種方法制備復(fù)雜且影響了基因載體締合DNA分子的能力。超分子組裝體是利用分子間相互作用力，如親水/疏水性作用、靜電作用、氫鍵等自組裝形成的聚集體。由于具有可控的結(jié)構(gòu)及合適的納米尺寸，采用超分子組裝手段制備新型的非病毒基因傳遞體系具有廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法。
它的步驟如下(1)配置含聚乙二醇鏈段的兩親聚合物與陽離子聚合物的混合溶液，其中陽離子聚合物濃度為0.1～1mg/mL，兩親聚合物與陽離子聚合物的摩爾比為1∶1～5∶1；
(2)配置濃度為50～500μg/mL的質(zhì)粒DNA溶液；(3)步驟(1)溶液加入到等體積的步驟(2)溶液中，漩渦混合并靜置，獲得表面含聚乙二醇鏈段的非病毒基因組裝體。
所述的陽離子聚合物為天然或合成陽離子聚合物。陽離子聚合物為聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸(PLL)或殼聚糖(Chitosan)。含聚乙二醇鏈段的兩親聚合物為膽固醇-聚乙二醇(CPEG)、聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PEO-PPO-PEO)或聚氧乙烯硬脂酸鹽(Polyoxyethylene stearate)。質(zhì)粒DNA為pEGFP。
本發(fā)明的有益效果1)本方法制備方法簡單。通過加入含PEG鏈段兩親聚合物的共混改性，采用超分子組裝技術(shù)，可制備PEG化基因組裝體。
2)本方法適用范圍廣泛。陽離子聚合物基因載體可以為合成的聚合物，包括聚乙烯亞胺、聚賴氨酸，也可以為殼聚糖天然聚合物分子。
3)本方法結(jié)構(gòu)可控。通過調(diào)節(jié)陽離子聚合物的種類、含PEG鏈段兩親聚合物及陽離子聚合物的加入比例，可制備不同種類、不同PEG化程度的非病毒基因傳遞體系。


圖1是PEI25k/DNA組裝體在生理鹽溶液中放置4h后，pEGFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的相差顯微鏡圖。
圖2是PEI25k/DNA組裝體在生理鹽溶液中放置4h后，pEGFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
圖3是PEI25k/CPEG/DNA組裝體在生理鹽溶液中放置4h后，pEGFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的相差顯微鏡圖。
圖4是PEI25k/CPEG/DNA組裝體在生理鹽溶液中放置4h后，pEGFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
具體實施例方式
本發(fā)明采用超分子組裝技術(shù)，通過加入含PEG鏈段的兩親聚合物作為共混改性劑，制備PEG化的非病毒基因傳遞體系。具體包括以下三個步驟(1)配置含聚乙二醇(PEG)鏈段的兩親聚合物與陽離子聚合物的混合溶液，其中陽離子聚合物濃度為0.1～1mg/mL，兩親聚合物與陽離子聚合物的摩爾比為1∶1～5∶1；(2)配置濃度為50～500μg/mL的質(zhì)粒DNA溶液；(3)步驟(1)溶液加入到等體積的步驟(2)溶液中，漩渦混合并靜置。陽離子聚合物與DNA分子通過靜電吸引形成電荷中和的疏水性核，而過量陽離子聚合物則在疏水性核外層形成保護(hù)的殼層。在陽離子聚合物/DNA疏水性核形成的過程中，含PEG鏈段兩親聚合物的疏水性基團(tuán)與疏水性核之間通過疏水性的相互作用力，可將PEG鏈段引入到基因超分子組裝體中，獲得表面含PEG鏈段的非病毒基因傳遞體系，保護(hù)DNA分子的生物活性。由于PEG鏈段具有很強的水合作用，在體內(nèi)能阻抗各種蛋白質(zhì)的非特異吸附、延長體內(nèi)循環(huán)時間、降低細(xì)胞毒性、提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，有效提高陽離子聚合物非病毒基因傳遞體系的生物相容性及基因轉(zhuǎn)染效率。
實施例1配置NaCl濃度為20mM、pH為7.4、濃度為20mM的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPEs)緩沖溶液。采用該緩沖溶液，配置聚乙烯亞胺(PEI，分子量為25000)與膽固醇-聚乙二醇(CPEG，分子量為1706)的混合溶液，其中PEI濃度為0.15mg/mL，CPEG與PEI的摩爾比為2∶1。選用綠色熒光蛋白報告基因pEGFP(4733bp)為目的基因，配置濃度為100μg/mL的緩沖溶液。取250μl上述PEI與CPEG的混合溶液加入到等體積DNA溶液中，漩渦混合并靜置30分鐘，獲得表面含PEG鏈段的聚乙烯亞胺類基因納米粒子。
實施例2配置pH為5.0的醋酸鈉/醋酸緩沖溶液，將殼聚糖(粘度55mPa.s，脫乙酰度大于92％)與聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇共聚物(PEO-PPO-PEO)溶于上述溶液中，使殼聚糖濃度達(dá)到1mg/ml，PEO-PPO-PEO與殼聚糖的摩爾比為5∶1。配置濃度為500μg/mL的pEGFP緩沖溶液。取250μl上述殼聚糖與PEO-PPO-PEO的緩沖溶液加入到等體積的DNA溶液中，漩渦混合并靜置，制備PEO-PPO-PEO共混改性的殼聚糖基因超分子組裝體。
實施例3將膽固醇-聚乙二醇(CPEG，分子量1706)與聚賴氨酸(PLL，分子量為20000)溶解于pH為7.4的25mM Tris緩沖溶液中，其中PLL濃度為0.2mg/mL，CPEG與PLL的摩爾比為1∶1～2∶1。配置200μg/mL的pEGFP緩沖溶液。取250μl上述PLL與CPEG的緩沖溶液加入到等體積DNA溶液中，漩渦混合并靜置30分鐘，制得表面含PEG鏈段的非病毒基因傳遞體系。
實施例4配置NaCl濃度為20mM、pH為6.0、濃度為20mM的N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPEs)緩沖溶液。采用該緩沖溶液，配置聚乙烯亞胺(PEI，分子量為25000)與聚氧乙烯硬脂酸鹽(Polyoxyethylene 40 stearate)的混合溶液，其中PEI濃度為0.1mg/mL，聚氧乙烯硬脂酸鹽與聚乙烯亞胺的摩爾比為1∶1。配置濃度為50μg/mL的pEGFP(4733bp)溶液。取250μl上述陽離子聚合物的混合溶液加入到等體積的質(zhì)粒DNA溶液中，漩渦混合并靜置，制得表面含PEG鏈段的非病毒基因傳遞體系。
實施例5按實施例1制備的膽固醇-聚乙二醇(CPEG)共混改性聚乙烯亞胺類基因納米粒子，由于表面PEG鏈段的存在導(dǎo)致ξ-電位顯著降低。采用動態(tài)光散射、原子力顯微鏡及紫外-可見光譜研究組裝體在生理鹽條件下的穩(wěn)定性。未經(jīng)CPEG共混改性的PEI25k/DNA組裝體在生理鹽條件下僅放置1小時，就形成很大的聚集體；而按實施例1制備的膽固醇-聚乙二醇(CPEG)共混改性的基因組裝體在測定的4h時間內(nèi)，尺寸依然保持在150-300nm間。
實施例6按實施例2制備的PEO-PPO-PEO共混改性的殼聚糖基因組裝體，在生理溶液中的溶解性和穩(wěn)定性顯著提高，生物相容性得到很大改善。由于殼聚糖僅溶于酸性溶液中，在pH為7.4的生理條件下，未經(jīng)共混改性的Chitason/DNA基因組裝體易從溶液中沉析出來。而經(jīng)PEO-PPO-PEO共混改性的殼聚糖基因組裝體由于表面的PEO鏈段具有很強的水合作用，在生理鹽溶液殼聚糖組裝體的溶解性及穩(wěn)定性得到很大提高，從而提高殼聚糖基因傳遞體系的體內(nèi)循環(huán)時間，提高其生物相容性。
實施例7按實施例3制備的CPEG共混改性的聚賴氨酸基因組裝體，采用動態(tài)光散射、原子力顯微鏡及紫外-可見光譜研究組裝體研究發(fā)現(xiàn)在生理鹽條件下的穩(wěn)定性得到很大提高，能延長體內(nèi)循環(huán)時間，生物相容性得到有效改善。
實施例8按實施例4制備的聚氧乙烯硬脂酸鹽共混改性的基因組裝體，由于表面PEG鏈段的存在導(dǎo)致ξ-電位顯著降低。動態(tài)光散射、原子力顯微鏡及紫外-可見光譜的研究結(jié)果表明，組裝體在生理鹽條件下的穩(wěn)定性顯著提高。凝膠電泳測定結(jié)果表明，組裝體能有效保護(hù)DNA分子，避免酶解。
實施例9按實施例1制備的膽固醇-聚乙二醇(CPEG)共混改性聚乙烯亞胺類基因納米粒子的基因轉(zhuǎn)染實驗。
首先將本發(fā)明實施例1制備的CPEG共混改性聚乙烯亞胺類基因納米粒子與未共混改性的基因納米粒子在生理鹽溶液中放置4h，體外轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。
圖1、圖2為未經(jīng)CPEG共混改性的PEI25k/DNA基因組裝體在生理鹽溶液中放置4h后的pEGFP的轉(zhuǎn)染結(jié)果。由于組裝體在生理鹽溶液中發(fā)生聚集，達(dá)到微米尺寸，綠色熒光蛋白的表達(dá)效率不高。
圖3、圖4為CPEG共混改性后的PEI25k/CPEG/DNA基因組裝體在生理鹽溶液中放置4h后的pEGFP的轉(zhuǎn)染結(jié)果。由于組裝體的生物相容性得到很大改善，在生理鹽溶液中尺寸保持穩(wěn)定，綠色熒光蛋白的表達(dá)效率顯著提高。
權(quán)利要求
1.一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法，其特征在于，它的步驟如下(1)配置含聚乙二醇鏈段的兩親聚合物與陽離子聚合物的混合溶液，其中陽離子聚合物濃度為0.1～1mg/mL，兩親聚合物與陽離子聚合物的摩爾比為1∶1～5∶1；(2)配置濃度為50～500μg/mL的質(zhì)粒DNA溶液；(3)步驟(1)溶液加入到等體積的步驟(2)溶液中，漩渦混合并靜置，獲得表面含聚乙二醇鏈段的非病毒基因組裝體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法，其特征在于所述的陽離子聚合物為天然或合成陽離子聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法，其特征在于所述的陽離子聚合物為聚乙烯亞胺、聚賴氨酸或殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法，其特征在于所述的含聚乙二醇鏈段的兩親聚合物為膽固醇-聚乙二醇、聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇或聚氧乙烯硬脂酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法，其特征在于所述的質(zhì)粒DNA為pEGFP。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備生物相容性非病毒基因傳遞體系的方法。它的步驟如下(1)配置含聚乙二醇鏈段的兩親聚合物與陽離子聚合物的混合溶液，其中陽離子聚合物濃度為0.1～1mg/mL，兩親聚合物與陽離子聚合物的摩爾比為1∶1～5∶1；(2)配置濃度為50～500μg/mL的質(zhì)粒DNA溶液；(3)步驟(1)溶液加入到等體積的步驟(2)溶液中，漩渦混合并靜置，獲得表面含聚乙二醇鏈段的非病毒基因組裝體。本發(fā)明通過含聚乙二醇鏈段的兩親聚合物的自組裝共混改性，制備聚乙二醇化的非病毒基因傳遞體系，可有效保護(hù)DNA分子的生物活性，降低細(xì)胞毒性，提高體內(nèi)的穩(wěn)定性，獲得高生物相容性非病毒基因傳遞體系。
文檔編號C12N15/63GK1936010SQ20061005383
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者王幽香, 陳平, 沈家驄 申請人:浙江大學(xué)