專利名稱：抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶及其在藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶及其在藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脫氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme，縮寫為DZ)是一種嶄新的能夠抑制細(xì)胞內(nèi)RNA(核糖核酸)表達(dá)的有效手段。它是通過對體外合成的隨機(jī)序列庫進(jìn)行篩選得到具有RNA切割功能的DNA(脫氧核糖核酸)分子，理論上能夠?qū)θ我庑蛄械腞NA分子進(jìn)行特異性切割。其中功能最強(qiáng)研究最多的是10-23型脫氧核酶簡稱10-23DZ。10-23DZ由15個(gè)核苷酸的催化核心和兩側(cè)各7-11個(gè)核苷酸組成的側(cè)翼序列構(gòu)成(見

圖1)。RNA底物在未配對的嘌呤(A，G)和配對的嘧啶殘基(C，U)之間被切割。這種切割具有高度的序列特異性，理論上可切斷任何靶RNA。自從第一例DZ報(bào)道以來，生物學(xué)家已將其廣泛應(yīng)用于抑制各種有害基因的表達(dá)，在動(dòng)物模型中亦有成功的報(bào)道。
人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，簡稱hRSV或RSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒及成人呼吸道感染的首要病原。血清學(xué)資料顯示，大約95％的兒童在2歲前曾感染過RSV，達(dá)成年時(shí)，感染率達(dá)100％。RSV感染每年造成全球超過1百萬兒童死亡。由于RSV感染引起的免疫應(yīng)答不能起到有效的保護(hù)作用，因此在整個(gè)成年階段都可再發(fā)感染。另外，在老年病人及免疫缺陷病人，尤其在接受骨髓移植的病人中，RSV感染的爆發(fā)正受到越來越多的重視。盡管經(jīng)過多年的努力，但是到目前為止，尚沒有針對RSV的可靠疫苗或特異性的抗RSV制劑問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶及其在藥中的應(yīng)用，在無細(xì)胞體系及細(xì)胞體系中對動(dòng)物和人類RSV的RNA具有剪切活性，能夠能特異性地抑制呼吸道合胞病毒的復(fù)制，對正常組織無毒副作用。
本發(fā)明所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，具有可在RSV RNA核苷酸序列中嘌呤嘧啶位點(diǎn)特定裂解RNA的催化活性域；催化域5′末端鄰接的第一結(jié)合域可與RSV RNA內(nèi)切位點(diǎn)一側(cè)堿基序列特異性互補(bǔ)結(jié)合；催化域3′末端鄰接的第二結(jié)合域可與RSV RNA內(nèi)切位點(diǎn)另一側(cè)堿基序列特異性互補(bǔ)結(jié)合；其特征是能裂解呼吸道合胞病毒的基因組RNA、或/和反基因組RNA、或/和mRNA；其催化活性域選自RSV基因組RNA的以下序列SEQ ID NO15’-caucuuuguauuugcccca-3’SEQ ID NO25’-ucaaauucuuauuugccccauuuuuugg-3’SEQ ID NO35’-caucuuuguauuugccccaucuucuaucu-3’
SEQ ID NO45’-ugaugauuuauuugccccauuuuuuauua-3’SEQ ID NO55’-auguuuccatauuugccccacccuuuccuu-3’SEQ ID NO65’-uccaaugauuauuugccccauguguauau-3’SEQ ID NO75’-gacauguuucauuugccccaauguuauug-3’SEQ ID NO85’-acuccauuguuauuugccccagaguuuauuuug-3’SEQ ID NO95’-uucgugacauauuugccccaguuuucauu-3’。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，有多種核苷酸序列，優(yōu)選的核苷酸序列為5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAA CGA AC AAA GAT G-3’。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，其5’端或/和3’端的2-3個(gè)核苷酸進(jìn)行了硫代修飾、或者全硫代修飾。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，其特征是5’端或/和3’端進(jìn)行膽固醇共扼修飾。
合成本發(fā)明所述的脫氧核酶的原料為A.T.C.G.(Adenine腺嘌呤，Thymine胸腺嘧啶，Cytosine胞嘧啶，Guanine鳥嘌呤)。制備包括以下步驟1、在核酸合成儀自動(dòng)合成脫氧核酶，它能作用于呼吸道合胞病毒(RSV)的第1133位核苷酸，其核苷酸序列為5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAA CGAAC AAA GAT G-3’；2、對上述脫氧核酶的5’端和3’端的2-3個(gè)核苷酸進(jìn)行了硫代修飾；以提高其穩(wěn)定性。
3、對上述脫氧核酶的3’端連接膽固醇進(jìn)行了硫代修飾；以提高細(xì)胞和組織的攝取并增加穩(wěn)定性。
所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶在藥中的應(yīng)用，其特征是含有0.01mg-20mg/50μl的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶的溶液。
使用前，加生理鹽水或磷酸緩沖液配制成需濃度為0.01mg-20mg/50ul的混合液，采用滴鼻的方式給藥。
上述脫氧核酶加pH7.0的磷酸緩沖液配制成0.01mg/50ul的藥液，采用滴鼻的方式給藥，可多次給藥。
或上述脫氧核酶加生理鹽水配置成0.4mg/50ul的藥液，采用滴鼻的方式給藥，可多次給藥。
或上述脫氧核酶加pH7.2的磷酸緩沖液配置成20mg/50ul的藥液，采用滴鼻的方式給藥，可多次給藥。
在本發(fā)明的第一方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合域與緊密側(cè)接裂解位點(diǎn)的區(qū)完全互補(bǔ)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，脫氧核酶結(jié)合并裂解RSV的RNA可以不要求嚴(yán)格互補(bǔ)。
本發(fā)明的脫氧核酶的催化域可以是任何適當(dāng)?shù)拇呋?。適當(dāng)?shù)拇呋虻睦尤鏢antoro和Joyce和美國專利5,807,718所述。在優(yōu)選的方案中，催化域具有核苷酸序列GGCTAGCTACAACGA。
在本發(fā)明的參數(shù)中，結(jié)合域長度(即“臂長度”)可以是任何排列，且可以相同或不同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合域長度為至少6個(gè)核苷酸，優(yōu)選兩個(gè)結(jié)合域的總長度為至少14個(gè)核昔酸。各種排列如7+7，8+8和9+9是可以設(shè)想的。人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，結(jié)合域越長，其越緊密地結(jié)合其互補(bǔ)mRNA序列。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，各域的長度是9-11個(gè)或更多個(gè)核苷酸。
本發(fā)明可以以RSV病毒標(biāo)準(zhǔn)株CH18537株為例證，但本發(fā)明可以由其它任何有已知基因組序列或未知基因組序列的RSV株實(shí)施。
本發(fā)明的裂解位點(diǎn)為RSV RNA的任意位點(diǎn)。RSV基因組RNA序列可由常規(guī)技術(shù)獲得，其反基因組RNA序列、mRNA序列可由基因組序列推知。RSV是具有多個(gè)基因的負(fù)鏈RNA病毒，進(jìn)入宿主細(xì)胞后基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生各種編碼病毒蛋白的mRNA，并且產(chǎn)生與基因組完全互補(bǔ)的反基因組，后代病毒的基因組由此轉(zhuǎn)錄獲得。本文所述的RSV的RNA包括其基因組RNA、反基因組RNA和mRNA。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本領(lǐng)域的研究人員可以知道，第一，該位點(diǎn)的選擇應(yīng)對病毒復(fù)制至關(guān)重要。即切割該位點(diǎn)，病毒復(fù)制將受到明顯的抑制，從而減輕RSV感染引起的病變，達(dá)到治療或預(yù)防RSV感染的目的。第二，靶序列在不同的RSV株間是高度保守的序列。第三，通過對RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助分析，靶位點(diǎn)是容易接近，且在一個(gè)不穩(wěn)定的位置以利于DZ的切割作用。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，脫氧核酶具有序列5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTACAA CGA AC AAA GAT G-3’，以裂解RSV基因組RNA 5’-C AUCUUU GUA UUU GCC CCA-3’堿基序列(SEQ ID NO1)，特異性裂解RSV N基因上述RNA序列中5’-AU-3’之間的堿基位點(diǎn)。
在應(yīng)用基于脫氧核酶的治療中，優(yōu)選脫氧核酶在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中應(yīng)盡可能地穩(wěn)定。實(shí)現(xiàn)其手段包括引入含有修飾的核苷酸或核苷酸鍵。修飾的核苷酸包括例如，硫代磷酸化(硫代)、N3’-P5’氨基磷酸酯鍵、2’-O-甲基取代、在脫氧核酶的一個(gè)或多個(gè)末端摻入3’-3’倒置和肽核酸鍵修飾或以上方法的組合。這些都是本領(lǐng)域公知的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用硫代修飾，包括全部及部分核苷酸使用硫代修飾。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明對脫氧核酶的5’端和3’端的2-3個(gè)核苷酸進(jìn)行了硫代修飾。
在第二方面，本發(fā)明提供包含第一方面的脫氧核酶和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
在本發(fā)明的上下文中，給予第二方面的藥物組合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法和遞送系統(tǒng)進(jìn)行。給藥方法包括但不局限于以下方法之一或以下方法的組合局部呼吸道氣霧劑吸入、鼻內(nèi)點(diǎn)滴或鼻腔噴霧、靜脈內(nèi)、口服、通過植入、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、局部、肌肉內(nèi)、皮下或體外進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，采用鼻內(nèi)點(diǎn)滴或鼻腔噴霧的方式遞送。在特別優(yōu)選的方案中，本發(fā)明采用呼吸道氣霧劑吸入給藥的方法。
局部呼吸道氣霧劑吸入遞送系統(tǒng)包括但不局限于凝膠和溶液，并且可以含有賦形劑如穩(wěn)定劑.滲透促進(jìn)劑籠例如，脂肪酸、脂肪酸醋、脂肪醇和氨基酸)，和親水聚合物(例如，polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中。藥學(xué)可接受的載體是脂質(zhì)體或可生物降解的聚合物?？梢杂糜诒景l(fā)明的脂質(zhì)體的例子可以包括但不局限于以下類型(1)CellFectin，陽離子脂質(zhì)四甲基四棕?cái)R基精胺和二油?；字嵋掖及?DOPE)(GIHCO BEL)的1∶1.5(M/M)脂質(zhì)體配方；(2)Cytofectin GSV，陽離子脂質(zhì)和DOPE(Glen Research)的2∶1(M/M)脂質(zhì)體配方；(3)DOTAP(N-(1-(2，3-二油酰氧基)-N，N，N-三甲基-甲基硫酸銨)(Eoehringer Manheim)；和(4)Lipofectamine，聚陽離子脂質(zhì)DOSPA和中性脂質(zhì)DOPE(GIBCO BEL)的3∶1(M/M)脂質(zhì)體配方。
核酸劑的遞送也可以通過一種或多種以下載體實(shí)現(xiàn)
(a)脂質(zhì)體和脂質(zhì)體-蛋白質(zhì)綴合物和混合物；(b)聚合物配方如聚氮丙啶(PEI)；(c)病毒脂質(zhì)體復(fù)合物，如仙臺(tái)病毒(d)肽-核酸綴合物；或(e)膽固醇-核酸綴合物(其中膽固醇優(yōu)選綴合于寡核苷酸的5’-末端)。
在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明采用膽固醇-核酸綴合物的方法投遞脫氧核酶。
在第三方面，本發(fā)明提供抑制RSV感染細(xì)胞中病毒滴度的方法，所述方法包括向細(xì)胞中引入第一方面的脫氧核酶和第二方面的藥物組合。
在第四方面，本發(fā)明提供抑制RSV感染細(xì)胞中細(xì)胞病變的方法，所述方法包括向細(xì)胞中引入第一方面的脫氧核酶和第二方面的藥物組合。
在第五方面，本發(fā)明提供抑制RSV感染細(xì)胞中病毒蛋白表達(dá)的方法，所述方法包括向細(xì)胞中引入第一方面的脫氧核酶和第二方面的藥物組合。
在第六方面，本發(fā)明提供抑制RSV感染細(xì)胞中病毒RNA表達(dá)的方法，所述方法包括向細(xì)胞中引入第一方面的脫氧核酶和第二方面的藥物組合。
在第七方面，本發(fā)明提供抑制受試動(dòng)物RSV感染的方法，包括預(yù)防和治療的目的，所述方法包括將第二方面的藥物組合給予受試動(dòng)物。
在第八方面，本發(fā)明提供抑制受試者RSV感染的方法，包括預(yù)防和治療的目的，所述方法包括將第二方面的藥物組合給予受試者。此處受試者指人類。
根據(jù)常規(guī)計(jì)算方法可以確定本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量含有約0.1毫克至約1克本發(fā)明的脫氧核酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量含有約1毫克至約100毫克本發(fā)明的脫氧核酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量含有約10毫克至約50毫克本發(fā)明的脫氧核酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量含有約25毫克本發(fā)明的脫氧核酶。單一治療有效劑量可以以更小劑量在一定時(shí)間內(nèi)給藥。
在第三到第六方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在體外進(jìn)行。
在第七、第八方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在體內(nèi)進(jìn)行。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)能裂解呼吸道合胞病毒的基因組RNA、或反基因組RNA、或mRNA，并能特異性地抑制呼吸道合胞病毒的復(fù)制，提高藥物敏感性，對正常組織無毒副作用。
圖2脫氧核酶3’端膽固醇連接的方式示意圖。
圖3脫氧核酶體外無細(xì)胞系統(tǒng)對底物RNA的剪切作用示意圖。
圖4脫氧核酶對RSV mRNA表達(dá)的影響示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1脫氧核酶構(gòu)建體的設(shè)計(jì)。靶RNA中DZ切割位點(diǎn)的選擇主要考慮三個(gè)因素第一，該位點(diǎn)對病毒復(fù)制至關(guān)重要。RSV的基因組是非階段性的負(fù)鏈RNA，含有大約15000個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)為3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2(M2-1-M2-2)-L-5’，編碼相應(yīng)的11個(gè)病毒蛋白核衣殼蛋白N、磷蛋白P、多聚酶亞單位L、轉(zhuǎn)錄延長因子M2-1、融合蛋白F、粘附蛋白G和小疏水蛋白SH、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2、基質(zhì)蛋白M和M2-2。在病毒復(fù)制過程中，核衣殼蛋白N發(fā)揮了重要功能。它是病毒多聚酶復(fù)合體(N、P、L蛋白)的重要組成部分，病毒mRNA在多聚酶復(fù)合體的作用下以負(fù)鏈基因組RNA為模板轉(zhuǎn)錄而來，此多聚酶復(fù)合體還以正鏈中間體RNA為模板復(fù)制出新的負(fù)鏈基因組RNA，進(jìn)入子代病毒。N蛋白與基因組RNA緊密結(jié)合以抵抗核酸酶對RNA的降解；在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程中與P-L多聚酶相互協(xié)同作用；與基質(zhì)蛋白M相互作用完成病毒組裝(Grosfeld et al.，1995)。RSV的M2基因包含兩個(gè)重疊的開放閱讀框，產(chǎn)生194個(gè)氨基酸的M2-1和90個(gè)氨基酸的M2-2兩種蛋白。M2-1蛋白為病毒復(fù)制所必需的轉(zhuǎn)錄延長因子，發(fā)揮促進(jìn)病毒RNA轉(zhuǎn)錄的功能。缺乏M2-1的病毒顆粒只能轉(zhuǎn)錄出NS1、NS2基因而不能轉(zhuǎn)錄其他基因(Collins et al.，1996，2001)。M2-1還促進(jìn)多聚酶復(fù)合體在各基因的連接處對基因組RNA的通讀能力，抑制轉(zhuǎn)錄衰減，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄(Hardy et al.，1999；Tang et al.，2001)。由于N和M2-1基因在病毒復(fù)制中的重要作用，在實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明選擇RSV N和M2-1基因組RNA作為Dz作用的靶位點(diǎn)。
第二，靶序列在不同的RSV株間應(yīng)高度保守。RSV基因組RNA中，除L基因外，每個(gè)基因開始都有一個(gè)保守的9nt基因起始序列3’-CCCCGUUUA-5’(L基因的起始序列為3’-CCCUGUUUUA-5’)(Collins et al.，1987)。轉(zhuǎn)錄均從此序列的第一個(gè)核苷酸開始(Kuo et al.，1997，1996)。RSV的這一特征對利用Dz催化降解RSV基因組RNA非常有利，因?yàn)槠浼仁遣《緩?fù)制所必需，也是高度保守的。在對2-5-A抑制RSV的研究中發(fā)現(xiàn)，阻斷此基因起始序列可有效抑制RSV復(fù)制(Player et al.，1998；Leaman et al.，2002)。
第三，通過對RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)輔助分析，靶位點(diǎn)應(yīng)容易接近，且在一個(gè)不穩(wěn)定的位點(diǎn)以利于Dz的切割作用。
根據(jù)上述靶位點(diǎn)選擇的三個(gè)基本規(guī)則，在我們的研究中，以Santoro和Joce的報(bào)道為基礎(chǔ)(1997；1998)，設(shè)計(jì)了特異性DZ，即DZ1133，以RSV基因組N基因的轉(zhuǎn)錄起始序列為切割靶位點(diǎn)。DZ兩邊側(cè)翼為9nt(DZ1133)與靶RNA嚴(yán)格配對的核苷酸序列。作為對照，設(shè)計(jì)了針對相同底物的19n的反義寡聚核苷酸(AS1133)和一個(gè)在15nt催化域有一個(gè)點(diǎn)突變的突變體DZ(mutDZ1133)。DZ、對照寡聚核苷酸及它們相應(yīng)的互補(bǔ)RNA底物。
脫氧核酶構(gòu)建體的合成本發(fā)明應(yīng)用的所有DZ在中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所合成，所用合成儀為ABI 392DNA/RNA合成儀，合成產(chǎn)物用高效液相色譜純化，0.22um濾器過濾消毒，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。
脫氧核酶的修飾。
所用3’-膽固醇-TEG CPG購自Glen Research公司(Sterling，美國)。脫氧核酶體內(nèi)應(yīng)用的主要問題是在保證高效的催化活性的同時(shí)，是否能被細(xì)胞有效攝取、是否能抵抗體內(nèi)核酸酶的降解即穩(wěn)定程度。這些問題可通過對脫氧核酶進(jìn)行修飾加以解決。為了提高DZ的穩(wěn)定性，本發(fā)明對5’端和3’端的2-3個(gè)堿基進(jìn)行了硫代修飾。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)模型中，我們應(yīng)用了3’端膽固醇連接的方法以提高細(xì)胞的攝取(圖2)。
實(shí)施例2脫氧核酶對RNA靶的體外裂解Hep-2人喉上皮癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10％滅活胎牛血清(FBS，Hyclon，Logan，UT)、2mM L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的極限必需培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium Dulbecco，DMEM)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃，5％CO2。
人類呼吸道合胞病毒B亞型標(biāo)準(zhǔn)株RSV CH18537，在含2％的胎牛血清和抗生素的DMEM(病毒維持液)中培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞中傳代。在細(xì)胞病變(CytopathicEffect，CPE)達(dá)到75％-100％，即CPE+++-++++(感染細(xì)胞病變程度評(píng)價(jià)方法0％-25％細(xì)胞發(fā)生病變，記做CPE+；25％-50％細(xì)胞發(fā)生病變，記做CPE++；50％-75％細(xì)胞發(fā)生病變，記做CPE+++；75％-100％細(xì)胞發(fā)生病變，記做CPE++++)時(shí)收集并分裝上清，檢測病毒滴度后儲(chǔ)存在-80℃?zhèn)溆谩?br> DZ細(xì)胞外剪切反應(yīng)體系5pmol RNA模板、5pmol DZ1133或DZ7601、10mMMgCl2、50mM Tris-HCl(pH＝7.4)，補(bǔ)DEPC水至總體積10ul，37℃反應(yīng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)(30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘和240分鐘)終止反應(yīng)(每個(gè)反應(yīng)管加入0.5M EDTA 1μl)。將反應(yīng)產(chǎn)物70℃變性15分鐘后置冰上，以含7M尿素的8％變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，常規(guī)方法銀染顯色(Palfner et al.，1995)，用Totallab程序包(Nonlinear Dynamics公司，英國)分析電泳條帶密度。DZ的剪切效率以產(chǎn)物RNA/總底物RNA密度之比顯示。
對于有RNA切割活性的DZ，進(jìn)一步檢測在不同濃度Mg離子體系中的切割效率。反應(yīng)體系中Mg離子濃度分別為2mM、10mM、25mM，體系中其他條件同前，37℃反應(yīng)240分鐘，以含7M尿素的8％變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，常規(guī)方法銀染顯色，分析方法同前。
針對RSV基因組RNA N基因和M2基因的轉(zhuǎn)錄啟始序列所設(shè)計(jì)的脫氧核酶(即DZ1133)，對其剪切相應(yīng)的底物RNA的活性進(jìn)行了檢測。結(jié)果DZ1133在既定的位點(diǎn)將453nt的底物RNA切割，產(chǎn)生了兩個(gè)片段5’端297nt和3’端156nt的切割產(chǎn)物。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，可見底物RNA逐漸減少，切割產(chǎn)物逐漸增加。在30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘和240分鐘，剪切產(chǎn)物RNA/總RNA底物的百分比分別為15.09％、26.45％、42.13％、53.20％和67.90％。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，切割效率不再增加。反應(yīng)體系中不加DZ，則底物RNA沒有降解。這些數(shù)據(jù)表明了DZ1133切割RSV N基因RNA的序列特異性和時(shí)間依賴性(圖3)。
實(shí)施例3脫氧核酶對對感染細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制作用Hep-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含有抗生素和10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行。RSV A2標(biāo)準(zhǔn)株、CH 18537株、六株重慶地區(qū)野生株于住院病人的鼻煙分泌物中分離；另外四株RSV野生株于北京地區(qū)2001-2002年流行季節(jié)分離，這四株臨床分離株未做分型。以上病毒均在Hep-2細(xì)胞中于37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)，培養(yǎng)基為含抗生素和2％FBS的DMEM(病毒維持液)。在細(xì)胞病變達(dá)到75％-100％(CPE+++-++++)時(shí)收集上清，分裝后于-80℃保存。病毒滴度用空斑形成實(shí)驗(yàn)在Hep-2培養(yǎng)細(xì)胞上測定。所用病毒的滴度為1.7×105至6.5×107/ml。
用不同株的RSV感染6孔培養(yǎng)板中的單層Hep-2細(xì)胞(MOI＝0.1)。病毒吸附2小時(shí)后加入等倍稀釋成不同濃度的DZ1133或其對照寡核苷酸(用病毒維持液稀釋，使其終濃度為0.25μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。感染后12小時(shí)以含有同樣濃度藥物的培養(yǎng)基換液一次。逐日在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。待病毒感染未處理組細(xì)胞的CPE達(dá)到+++-++++時(shí)終止實(shí)驗(yàn)并攝像，通常情況下為5天，不同株的RSV CPE出現(xiàn)時(shí)間和嚴(yán)重程度有所不同。
感染細(xì)胞出現(xiàn)融合病變是RSV一個(gè)標(biāo)志性的特征，RSV因此得名。為觀察DZ對細(xì)胞融合病變形成的抑制作用，在病毒感染后12小時(shí)分別加入不同濃度的DZ1133或其對照寡核苷酸。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，結(jié)果是DZ1133能夠抑制RSV引起的Hep-2細(xì)胞特異性合胞病變，并且呈劑量依賴性。DZ1133可能參與了抑制RSV F糖蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合病變形成的兩個(gè)過程即(a)病毒膜與細(xì)胞膜的融合和(b)細(xì)胞膜與細(xì)胞膜的之間的融合。
實(shí)施例4脫氧核酶對對感染細(xì)胞中病毒RNA表達(dá)的抑制作用以編碼F蛋白基因的特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測。
操作方法如下每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞生長24-36小時(shí)后感染RSV A2株或CH 18537株(MOI＝0.1)。于感染后2和12小時(shí)分別加入等倍稀釋的DZ1133(使其終濃度為0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM)。隨后將培養(yǎng)板在37℃孵育3天。
以TRIzol試劑(Gibco BRL)提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA2.5μl RNA模板，200mM dNTP(上海生工公司)，200ng/μl 6mer隨機(jī)引物(PdN6，上海生工公司)→混合后于65℃反應(yīng)5分鐘，置冰上1分鐘→加入5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μl，40u RNasn(Promega公司，美國)，200u Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)，0.1M DTT→充分混勻后25℃反應(yīng)10分鐘，42℃反應(yīng)50分鐘→70℃15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
PCR反應(yīng)應(yīng)用Ex TaqTM DNA聚合酶(Takara公司，日本)和如下引物(分別為上游引物和下游引物)1)18537株F基因5’GCCTATAACAAATGACCAGAAAA 3’和5’CACATAGTCACAACCATTAGAAAA 3’；2)A2株F基因5’CCATAATAAAAGAGGAAGTC3’和5’CACGATTTTTATTGGATG 3’；3)Human β-act in5’ATGGATGATGATATCGCCGCG 3’和5’TAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC 3’CH 18537株引物設(shè)計(jì)參考Johnson報(bào)道的序列(Johnson et al.，1988)；A2株引物設(shè)計(jì)參考GeneBank中的序列(accession no.M74568)。引物設(shè)計(jì)應(yīng)用軟件Genestar。
PCR反應(yīng)體系為50μl反應(yīng)混合物包括cDNA 2μl、10×TaqTM DNA聚合酶緩沖液5μl、TaqTM DNA聚合酶2u，上游引物和下游引物各1μM，補(bǔ)水至50μl。
RSV CH18537株F基因PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3min，94℃變性45s，44℃退火45s，72℃延伸1min，共24個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min。
RSV A2株F基因PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3min，94℃變性45s，44℃退火45s，72℃延伸1min，共24個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min。
β-actin擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2min，60℃退火2min，94℃變性45s，60℃退火2min，72℃延伸3min，共24個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min。
A2株F基因、18537株F基因、Human β-actin PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為420bp、535bp和1126bp。反應(yīng)結(jié)束后各取5μl進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察。
DZ1133能夠特異性地降低人類呼吸道合胞病毒A亞型和B亞型RSV mRNA的表達(dá)。病毒感染后檢測了RSV F基因特異性片段，其中A2株為420bp，18537株為535bp，當(dāng)DZ1133濃度從0.5μM等倍增加至2μM時(shí)，A2株擴(kuò)增片段表達(dá)量抑制率為42.51％、65.56％、83.62％，在4μM和8μM時(shí)則完全抑制目的基因的表達(dá)；當(dāng)DZ1133濃度從0.5μM等倍增加至4μM時(shí)對18537株F基因表達(dá)抑制率分別為21.14％、55.1％、60.84％和82.16％，至8μM時(shí)完全抑制目的基因表達(dá)?？醇一颚?actin沒有出現(xiàn)相應(yīng)表達(dá)量的降低，證明DZ1133對RSV基因的抑制是特異性的(圖4)。
實(shí)施例5脫氧核酶對對感染細(xì)胞中病毒蛋白表達(dá)的抑制作用在96孔培養(yǎng)板中每孔加入50μl等倍稀釋的DZ1133及其對照化合物(使其終濃度為0.125μM，0.25μM，0.5μM 1μM，2μM，4μM)，每種濃度設(shè)四個(gè)復(fù)孔。每孔加入5×103個(gè)Hep-2細(xì)胞懸液(25μl)和100TCID50的病毒(25μl)。將培養(yǎng)板于室溫下700g離心5分鐘后置于5％CO2，37℃培養(yǎng)。每種藥物另設(shè)兩個(gè)未感染未處理孔和四個(gè)病毒感染未處理孔作為對照。
感染后48小時(shí)進(jìn)行ELISA檢測(Kang et al.，1989)。具體操作如下細(xì)胞以0.05％戊二醛4℃固定20分鐘，以含1％BSA的PBS室溫封閉30分鐘。一抗為針對RSV F蛋白的小鼠單克隆抗體(Cat.No R1595-36，USBiological，美國)或針對整個(gè)病毒抗原的山羊多克隆抗體(Cat.No R1595-35，USBiological，美國)。以含1％BSA的PBS稀釋(前者稀釋倍數(shù)為1∶500，后前者稀釋倍數(shù)為1∶10000)。37℃孵育1小時(shí)后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中山生物技術(shù)公司)，二抗以含1％BSA的PBS稀釋，其中羊抗鼠IgG稀釋度為1∶7000，鼠抗羊IgG為1∶20000。37℃孵育1小時(shí)后以TMB(3’3’5’5’-tetramethylbenzidine，TMB)顯色。記錄450nm吸光值。ELISA試驗(yàn)的數(shù)據(jù)根據(jù)保護(hù)百分率計(jì)算每種藥物的EC50。保護(hù)百分率計(jì)算公式為[(ODC)V-(ODT)V][(ODC)V-(ODC)M]×100%]]>其中(ODT)V、(ODC)V、(ODC)M分別代表病毒感染加藥組、病毒感染未加藥組和未感染未加藥組的吸光值。
ELISA方法檢測DZ1133對RSV蛋白表達(dá)的抑制，藥物平均EC50見表1和表2。

表1 DZ1133對RSV蛋白表達(dá)的抑制作用baAverage for three independent experiments.
bThe first antibody was a mouse anti-RSV monoclonal antibody directedagainst the F protein of RSV(both for subgroup A and subgroup B).

表2 DZ1133對RSV蛋白表達(dá)的抑制作用baAverage for three independent experiments.
bThe first antibody was a goat anti-RSV polyclonal antibody against thewhole viral antigens(both for subgroup A and subgroup B).
實(shí)施例6脫氧核酶對RSV感染小鼠模型中對病毒滴度的抑制作用SPF級(jí)8-12周齡、體重18-22g、雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分組，鼻腔緩慢滴入50μl 2×106PFU/ml RSV A2株(A亞型)、RSV CH18537株(B亞型)、RSV BeiJing01地方分離株病毒液，各組陰性對照滴入50μl 2％FBS DMEM。感染后24h、48h給予0.4mg DZ1133兩次滴鼻治療，各組對照滴入50μl PBS。感染后72h處死各組小鼠。無菌條件下取右肺稱重，按10ml/g(wt/vol)加入預(yù)冷肺組織平衡液勻漿，4℃，2500g離心10分鐘收集上清，空斑形成實(shí)驗(yàn)分析小鼠肺組織病毒滴度和DZ1133治療后空斑形成抑制率。
表4 DZ1133對RSV不同標(biāo)準(zhǔn)株和地方株廣譜抗病毒作用

★表示與各自對照組比較差別有顯著性，p＜0.05根據(jù)上面實(shí)施例1到6的結(jié)果可得出結(jié)論(1)根據(jù)呼吸道合胞病毒設(shè)計(jì)的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，能裂解呼吸道合胞病毒的基因組RNA、或反基因組RNA、或mRNA。
(2)特異性地抑制呼吸道合胞病毒的復(fù)制，提高藥物敏感性，對正常組織無毒副作用。
(3)在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)RSV基因特定部位設(shè)計(jì)出的特定抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，其核苷酸序列為5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAACGA AC AAA GAT G-3’，5’端和3’端的2-3個(gè)核苷酸進(jìn)行了硫代修飾，并應(yīng)用了3’端連接膽固醇的修飾；能夠在期望的位點(diǎn)裂解RNA靶；特異性地抑制呼吸道合胞病毒的復(fù)制，提高藥物敏感性，對正常組織無毒副作用。
權(quán)利要求
1.抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，具有可在RNA核苷酸序列中嘌呤嘧啶位點(diǎn)特定裂解RSV RNA的催化活性域；催化域5′末端鄰接的第一結(jié)合域可與RSV RNA內(nèi)切位點(diǎn)一側(cè)堿基序列特異性互補(bǔ)結(jié)合；催化域3′末端鄰接的第二結(jié)合域可與RSVRNA內(nèi)切位點(diǎn)另一側(cè)堿基序列特異性互補(bǔ)結(jié)合；其特征是能裂解呼吸道合胞病毒的基因組RNA、或/和反基因組RNA、或/和mRNA；其催化活性域選自RSV基因組RNA的以下序列SEQ ID NO15’-caucuuuguauuugcccca-3’SEQ ID NO25’-ucaaauucuuauuugccccauuuuuugg-3’SEQ ID NO35’-caucuuuguauuugccccaucuucuaucu-3’SEQ ID NO45’-ugaugauuuauuugccccauuuuuuauua-3’SEQ ID NO55’-auguuuccatauuugccccacccuuuccuu-3’SEQ ID NO65’-uccaaugauuauuugccccauguguauau-3’SEQ ID NO75’-gacauguuucauuugccccaauguuauug-3’SEQ ID NO85’-acuccauuguuauuugccccagaguuuauuuug-3’SEQ ID NO95’-uucgugacauauuugccccaguuuucauu-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，其特征是核苷酸序列為5’-TGG GGC AAA GGC TAG CTA CAA CGA AC AAA GAT G-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，其特征是5’端或/和3’端的2-3個(gè)核苷酸進(jìn)行了硫代修飾、或者全硫代修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶，其特征是5’端/和3’端進(jìn)行膽固醇共扼修飾。
5.抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶在藥中的應(yīng)用，其特征是含有0.01mg-20mg/50μl的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶的溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶及其在藥中的應(yīng)用。所述的脫氧核酶具有可在RSV RNA核苷酸序列中嘌呤嘧啶位點(diǎn)特定裂解RNA的催化活性域；催化域5′末端鄰接的第一結(jié)合域可與RSV RNA內(nèi)切位點(diǎn)一側(cè)堿基序列特異性互補(bǔ)結(jié)合；催化域3′末端鄰接的第二結(jié)合域可與RSV RNA內(nèi)切位點(diǎn)另一側(cè)堿基序列特異性互補(bǔ)結(jié)合；其特征是能裂解呼吸道合胞病毒、抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶在藥中的應(yīng)用，其特征是含有0.01mg－20mg/50μl的抗呼吸道合胞病毒的脫氧核酶的溶液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)能裂解呼吸道合胞病毒的基因組RNA、或反基因組RNA、或mRNA，并能特異性地抑制呼吸道合胞病毒的復(fù)制，提高藥物敏感性，對正常組織無毒副作用。
文檔編號(hào)C12N9/22GK101029313SQ20061005410
公開日2007年9月5日 申請日期2006年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者楊錫強(qiáng), 趙曉東, 蔣利萍, 解元元, 周娟, 崔玉霞, 劉崇海, 王莉佳, 趙耀 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院