專利名稱：含密碼子優(yōu)化型hpv16l1基因的重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和腫瘤治療領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及含含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒及其制備方法。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)屬乳多空病毒科，是無包膜的閉環(huán)雙鏈DNA病毒。根據(jù)核苷酸序列同源性，HPV可分為80多個型，引起多種疾病。現(xiàn)已明確，其中高危型的HPV，如HPV16、18的持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，被確定為導(dǎo)致宮頸癌的主要病因，其中又以HPV16型最為常見(Bosch F X，J Natl Cancer Inst，1995，87796-802.)。
人乳頭瘤病毒(HPV)感染是一種常見的性傳播疾病，可導(dǎo)致生殖器疣及子宮頸癌(ZurHausen H，Nat Rev Cancer，2002，2342-350.；Clifford G M，Br J Cancer，2003，8863-73.；Bosch F X，J Natl Cancer Inst，1995，87796-802.)。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料表明，宮頸癌在全球婦女癌癥死亡率中位居第二，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位，每年全球大約有50萬例新發(fā)宮頸癌病例，約20萬人死于宮頸癌，其中，80％的死亡發(fā)生在發(fā)展中國家(WorldHealth Report 2004Changing History.Statistical Annex)。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國現(xiàn)有宮頸癌病人約13.8萬，每年約有5萬人死于宮頸癌。大量研究資料證明，宮頸癌的發(fā)生與生殖道的HPV持續(xù)感染之間有著十分密切的關(guān)系，其中又以HPV16型最為常見，超過50％的宮頸癌病例與HPV16感染有關(guān)(Bosch F X，J Natl Cancer Inst，1995，87796-802.)。目前，臨床上尚無預(yù)防HPV16感染的有效措施，因此，研制開發(fā)出高效、廉價的HPV預(yù)防性疫苗，通過免疫接種激發(fā)機體產(chǎn)生特異性抗體，阻斷HPV病毒侵入機體，從而降低宮頸癌的發(fā)生率，顯得尤為重要。
HPV16主要衣殼蛋白L1是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，它與次要衣殼蛋白L2一起共同構(gòu)成病毒的顆粒結(jié)構(gòu)。真核表達系統(tǒng)制備的L1蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒(Virus-Like Particles)，具有與天然病毒顆粒十分相似的空間結(jié)構(gòu)和抗原表位，是理想的誘發(fā)體液免疫反應(yīng)的抗原。但是，由于野生型L1基因在密碼子偏好上與哺乳動物細胞有著明顯差異，因而導(dǎo)致HPV16L1基因在哺乳動物細胞內(nèi)表達水平低下。因此，對HPV16 L1基因的密碼子進行改造提高其在哺乳動物細胞內(nèi)的表達水平，具有十分重要的意義。
HPV16主要衣殼蛋白L1可自我裝配形成病毒樣顆粒(VLPs)結(jié)構(gòu)，其有著與天然病毒顆粒十分相似的空間結(jié)構(gòu)和抗原表位，且不含HPV DNA。動物實驗結(jié)果表明，病毒樣顆粒免疫可在動物體內(nèi)可產(chǎn)生高滴度的血清中和抗體，能保護動物免受HPV的實驗性攻擊。而且，這種保護作用可隨著動物的血清傳遞。
雖然HPV16 L1蛋白自我裝配形成的病毒樣顆粒(VLPs)疫苗具有良好的免疫效果，但其純化工藝繁瑣，成本高昂，不利于在發(fā)展中國家進行推廣。因此，本發(fā)明人試圖構(gòu)建一種成本低廉，同時可有效激發(fā)機體產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)的疫苗，作為HPV16 L1病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的替代疫苗。
鑒于高危型HPV的嗜粘膜特性以及與宮頸癌的密切關(guān)系，有效預(yù)防HPV感染的疫苗應(yīng)能在病毒入侵的生殖道粘膜局部提供免疫保護作用。分泌型IgA(SIgA)能夠與病毒結(jié)合，阻止其附著上皮細胞，因此，HPV預(yù)防性疫苗的研究重點已逐漸轉(zhuǎn)向于在生殖道粘膜表面激發(fā)足夠強度的具有病毒中和活性的SIgA上。
研究表明，復(fù)制缺陷型重組腺病毒嗜性廣泛，能感染包括粘膜上皮細胞在內(nèi)的多種細胞，介導(dǎo)外源基因在細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達并刺激機體產(chǎn)生特異性體液及細胞免疫反應(yīng)，重組腺病毒能通過消化道和呼吸道途徑感染，被認為是誘導(dǎo)機體粘膜免疫中最為理想的載體之一，它不僅能介導(dǎo)外源基因的有效表達，還可通過自然感染途徑將抗原呈遞給免疫系統(tǒng)，有效激發(fā)局部和遠端粘膜表面的特異性免疫反應(yīng)(Xiang Z Q，Pasquini S，Ertl H C J.Induction ofgenital immunity by DNA priming and intranasal booster immunization with a replication-defective adenoviralrecombinant[J].J Immunol，1999，1626716-6723)。而且，重組腺病毒基因不與受體細胞基因組發(fā)生整合，具有良好的生物安全性(McConnell M J，Human Gene Therapy，2004，15(11)1022-1033.)。便于大規(guī)模培養(yǎng)制備，成本低廉等優(yōu)點，因此是理想的HPV候選預(yù)防性疫苗之一。所以我們確定以重組腺病毒作為密碼子優(yōu)化型HPV16 L1基因的病毒載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種密碼子優(yōu)化型編碼HPV16主要衣殼蛋白L1的基因序列。
本發(fā)明提供了一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒，其中含有所述的密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因序列。
一個方面，本發(fā)明提供了一種密碼子優(yōu)化型的編碼乳頭瘤病毒16型(HPV16)主要衣殼蛋白L1的基因序列(mod.HPV L1)，該基因是在不改變HPV16主要衣殼蛋白L1氨基酸序列的條件下，用哺乳動物高頻使用的密碼子取代HPV16 L1基因序列的密碼子得到的。
在一個實施方案中，所述基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
增強疫苗的體液免疫效果可通過提高相關(guān)抗原的表達水平來實現(xiàn)，對于HPV16預(yù)防性疫苗而言就是提高HPV主要衣殼蛋白L1在哺乳動物細胞中的表達水平。對野生型HPV16L1基因的分析表明，其密碼子使用偏好與哺乳動物存在較大差異，這會導(dǎo)致宿主細胞中同工tRNA的使用效率低下，從而降低蛋白質(zhì)翻譯的速度。Tan等人發(fā)現(xiàn)在HPV16 L1開放閱讀框中存在限制蛋白表達的抑制性元件(Tan W，J Virol，1995，695607-5620.)。我們的研究也證明，野生型HPV16 L1基因在哺乳動物細胞中的表達水平極低，即使是在腺病毒載體介導(dǎo)下也無法通過Western印跡檢測到明顯的蛋白表達。因此，對HPV16 L1基因的密碼子進行優(yōu)化可以通過提高同工tRNA的使用效率以及突變基因序列中的抑制性元件來提高基因在哺乳動物細胞中的表達水平。我們在進行密碼子優(yōu)化時，在L1蛋白N端第30、41、71、74位的精氨酸使用了次高頻密碼子CGC和CGG，而其余氨基酸密碼子均替換為哺乳動物高頻使用的密碼子(如SEQ ID NO1所示)。優(yōu)化基因GC含量由38％提高至64％，這與哺乳動物密碼子第三位堿基偏好G、C結(jié)尾的報道相一致(Nakamura Y，Nucleic AcidsRes，2000，28292.)。通過序列同源比對證明本發(fā)明的密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因(mod.HPV16L1)的核苷酸序列與現(xiàn)有技術(shù)中的重組HPV16L1基因(WO 01/14416 A2，以及Leder C，J Virol，2001，759201-9209)均不相同。
另一方面，本發(fā)明提供了一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒，其中含有所述的優(yōu)化型的編碼乳頭瘤病毒16型(HPV16)主要衣殼蛋白L1的基因。
為了得到攜帶密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，我們首先通過全基因合成獲得密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因，并將其定向克隆到重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC316中，然后與已知的重組腺病毒骨架質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染己知的腺病毒包裝細胞。，并在由所述的包裝細胞提供的E1蛋白的反向作用下包裝病毒(參見圖2)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，其中所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒是質(zhì)粒PDC316。
在一個優(yōu)選的實施方案中，其中所述的重組腺病毒骨架質(zhì)粒是質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre。
在一個優(yōu)選的實施方案中，其中所述的腺病毒包裝細胞是293細胞。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒的病毒滴度不小于108PFU/ml。
Western印跡試驗檢測結(jié)果顯示與野生型基因相比，本發(fā)明所述的優(yōu)化型HPV16L1基因(mod.HPV16L1)在哺乳動物細胞中的表達水平提高了約50倍。這表明我們對HPV16L1基因的改造是成功的，并且mod.HPV16L1基因可在腺病毒載體介導(dǎo)下在哺乳動物細胞中獲得高效表達。所以，本發(fā)明所述的含mod.HPV16L1基因的復(fù)制缺陷型腺病毒可作為開發(fā)預(yù)防和/或治療宮頸癌的疫苗和藥物的有效候選物。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的含優(yōu)化型HPV16L1基因重組腺病毒在制備用于預(yù)防和/或治療宮頸癌的疫苗和藥物中的用途另一方面，本發(fā)明提供了一種含mod.HPV L1的復(fù)制缺陷型重組腺病毒(rAd-mod.HPVL1)的方法，該方法包括(1)通過用哺乳動物高頻使用的密碼子取代HPV16L1基因序列的密碼子，得到密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因序列；(2)將步驟(1)得到的攜帶密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因序列克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒，得到攜帶密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因序列的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；(3)用步驟(2)得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染適當?shù)南俨《景b細胞，得到攜帶有優(yōu)化型HPV16L1基因序列的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒是質(zhì)粒PDC316。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述的重組腺病毒骨架質(zhì)粒是質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，其中所述的腺病毒包裝細胞是293細胞。
附圖簡述

圖1圖示的是重組腺病毒穿梭質(zhì)粒(圖1A)和重組腺病毒骨架質(zhì)粒(圖1B)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2圖示的是重組腺病毒包裝(構(gòu)建)流程圖。
圖3顯示的是通過RT-PCR和SDS-PAGE方法檢測，得到的本發(fā)明重組腺病毒(rAd-mod.HPV16L1)感染的293細胞中密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因轉(zhuǎn)錄水平。泳道1是正常293細胞總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；泳道2是感染野生型腺病毒(Ad5)的293細胞總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；泳道3是感染本發(fā)明重組腺病毒(rAd-mod.HPV16L1)的293細胞總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；泳道4是DL2000DNA Marker。
圖4顯示的是免疫印記法檢測rAd-mod.HPV16L1感染的293T細胞內(nèi)L1蛋白的表達。其中泳道1是Ad5感染的293T細胞；泳道2是含野生型HPV16L1基因的重組腺病毒rAd-wt.HPV16L1感染的293T細胞；泳道3是rAd-mod.HPV16L1感染的293T細胞。泳道4是蛋白預(yù)染Marker。
圖5圖示的是電鏡觀察rAd-mod.HPV16L1感染的293T細胞內(nèi)L1蛋白自我組裝形成的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。
下列實施例旨在進一步舉例說明而不是限制本發(fā)明。應(yīng)明確指出的是，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的個別非必要技術(shù)特征所做的任何改動和改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。另外，如前所述，由于用于實現(xiàn)本發(fā)明的分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)和載體質(zhì)粒均是已知的，可從各種來源直接獲得，并且本說明書的詳細描述部分和相關(guān)實施例部分也己對本發(fā)明的方法作了完整、清楚的描述，所以申請人相信本領(lǐng)域技術(shù)人員在仔細閱讀了本說明書后完全可以重復(fù)和再現(xiàn)本發(fā)明。
實施例材料和方法質(zhì)粒大量提取試劑盒QIAGEN Plasmid Midi Kits購自德國QIAGEN公司。常用限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、rTaq酶、核酸凝膠純化試劑盒及RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Opti-MEM及TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。小鼠抗HPV16L1單克隆抗體(camvir-1)購自Chemicon公司。Brij58、Benzonase購自Sigma公司。Optiprep購自Axis-shield公司。BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司。辣根酶標記羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。低分子量蛋白預(yù)染marker購自晶美生物公司。硝酸纖維素膜購自Pall公司。
重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC316、重組腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre以及腺病毒包裝細胞(293細胞)均購自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司。
本發(fā)明所涉及的分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)如核酸操作技術(shù)，蛋白質(zhì)定性和定量分析等在科學(xué)文獻中都已有充分描述(如參見J·薩姆布魯克E·F·弗里奇T·曼尼要蒂斯，分子克隆實驗指南(第二版))。
實施例1密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因的制備根據(jù)哺乳動物細胞使用密碼子的偏嗜性和HPV16L1的已知序列(GenBank登錄號AY686583)，在不改變氨基酸序列的前提下，對野生型HPV16L1基因的密碼子進行了改造，除第30位，第41、71、74位的精氨酸分別使用了次高頻密碼子CGC和CGG以外，其余氨基酸的密碼子均替換為哺乳動物細胞高頻使用的密碼子。改造后序列由上海博亞生物技術(shù)有限公司全基因合成，命名為mod.HPV16L1并克隆到PUC18載體，命名為PUC-mod.HPV16L1。序列測定表明合成序列與設(shè)計完全一致，優(yōu)化后的基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。優(yōu)化基因GC含量由38％提高至64％。
實施例2含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建以下按分步驟詳細描述含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建流程(參見圖2)。
1.含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建(1)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板上挑取DH5α單菌落，接種于5ml不含抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜(12～16h)。次日從上述培養(yǎng)物中吸取0.5ml按1∶100轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約3h，至菌液的OD600值為3時，在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一無菌、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴30min。在4℃條件下，4000rpm離心10min，棄上清，將管倒置1min，使殘留培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預(yù)冷的100mmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm離心10min，棄上清，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，分裝成200μl每管，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)PUC-mod.HPV16L1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用無菌吸頭吸取1μl含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因的質(zhì)粒(PUC-mod.HPV16L1，由上海博亞生物技術(shù)有限公司全基因合成并克隆到PUC18質(zhì)粒上)加入200μl DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。將管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培養(yǎng)基，將管轉(zhuǎn)移至37℃搖床上，溫育45min(轉(zhuǎn)速＜150rpm)。取50μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，用一無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含相應(yīng)抗生素的瓊脂平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)12～16h。
(3)PUC-mod.HPV16L1質(zhì)粒的小量制備、酶切和電泳分析挑取單個PUC-mod.HPV16L1轉(zhuǎn)化菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm離心30-60s，倒去培養(yǎng)液，倒置離心管，使上清流盡，用100μl預(yù)冷的溶液I[50mmol/L Glucose，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200μl新鮮配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150μl預(yù)冷的溶液III(100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)溫和混勻，冰浴10min，12000rpm離心10min，小心吸取上清，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用70％乙醇洗一次，室溫晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，37℃水浴30～60min后置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 按照供應(yīng)商提供的條件，使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化如上小量制備的質(zhì)粒PUC-mod.HPV16L1，然后用1％瓊脂糖凝膠分離酶切產(chǎn)物，在紫外燈下切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，使用TaKaRa公司Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒對1500bp大小的目的DNA mod.HPV16L1進行回收，具體操作參見相關(guān)說明書。
(4)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC316，然后將所回收片段與同樣用EcoRI和HindIII雙酶切回收的mod.HPV16L1片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4 DNA連接酶緩沖液和T4 DNA連接酶，反應(yīng)體積為10μl，16℃連接過夜，取10μl連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。從接種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜，按前述質(zhì)粒的快速小量制備方法提取質(zhì)粒。并用內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對質(zhì)粒進行酶切鑒定，挑選陽性重組子。命名為PDC-mod.HPV16L1。
2.含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因重組腺病毒的構(gòu)建(1)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC-mod.HPV16L1和骨架質(zhì)粒的制備使用質(zhì)粒大量提取試劑盒QIAGEN Plasmid Midi Kits分別提取重組腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre和含mod.HPV16L1基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC-mod.HPV16L1。具體實驗步驟見QIAGEN Plasmid Midi Kits使用手冊。
(2)重組腺病毒的包裝轉(zhuǎn)染前一天傳代293細胞于25cm2細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基用不含抗生素、含5％FCS的DMEM。配制轉(zhuǎn)染液A液溶于純水的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒DNA各5μl(各4μg)和Opti-MEM培養(yǎng)基共250μl；B液5μl LipofectamineTM2000和Opti-MEM培養(yǎng)液共250μl。B液室溫放置5min，A和B液輕輕混勻，室溫放置20min。吸棄舊細胞培養(yǎng)液，換2ml新鮮的不含抗生素、含5％ FCS的DMEM，然后將A+B混合液加入培養(yǎng)細胞上，于37℃，5％ CO2孵育8h，補充新鮮的培養(yǎng)基2.5ml。24h后換含2％FCS的DMEM維持。轉(zhuǎn)染后7～10天，用細胞刮將細胞刮下，800rpm離心5min，棄上清，用2ml無菌PBS重懸細胞沉淀；-20℃和37℃反復(fù)凍融4次；3000rpm離心10min，吸取上清，即為原代病毒，命名為rAd-mod.HPV16L1，-70℃保存?zhèn)溆?。?ml上清接種293細胞，37℃，5％ CO2孵育1h，然后加入含2％小牛血清的DMEM維持液(6ml)并觀察細胞病變。
觀察結(jié)果顯示，被轉(zhuǎn)染的293細胞出現(xiàn)細胞腫脹、圓縮等典型的細胞病變。
實施例3重組腺病毒rAd-mod.HPV16L1的鑒定、病毒滴度分析和HPV16L1蛋白病毒樣顆粒的電鏡觀察(1)重組腺病毒感染的293細胞內(nèi)mod.HPV16L1基因的轉(zhuǎn)錄TRIzol一步法分別提取正常293細胞和感染了rAd-mod.HPV16L1和Ad5(不含本發(fā)明所述mod.HPV L1的腺病毒，對照用)的293細胞的總RNA，進行RT-PCR鑒定。RT-PCR反應(yīng)參數(shù)如下逆轉(zhuǎn)錄體系為20μl。以1μg細胞總RNA為模板，Oligod(T)15為引物，50℃ 30min進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，94℃ 2min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，以合成的cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 90s，30個循環(huán)，取5μl PCR及RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，rAd-mod.HPV16L1感染的293細胞總DNA和RNA及病毒裂解液中均可擴增到1500bp左右特異性條帶，而Ad5野毒株和正常293細胞結(jié)果均為陰性，這表明mod.HPV16L1基因正確插入腺病毒基因組中，并且能有效轉(zhuǎn)錄(參見圖3)。
(2)重組腺病毒感染的293T細胞內(nèi)mod.HPV16L1基因的表達分別以1PFU/cell滴度的rAd-mod.HPV16L1、rAd-wt.HPV16L1和Ad5病毒感染1×106293細胞，48h后將細胞刮下，冰預(yù)冷PBS洗2遍，按照TRIzol試劑說明提取細胞總蛋白，溶于1％SDS溶液中，0.1％ SDS透析3次，4℃ 10000g離心10min，收集上清。BCA細胞總蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度至5mg/ml。以50μg TRIzol提取的細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。用鼠抗HPV 16 L1單克隆抗體(camvir-1)為一抗，辣根酶標記羊抗小鼠IgG抗體為二抗，進行Western印跡分析。
Western印跡檢測結(jié)果顯示rAd-wt.HPV16L1的幾乎看不見條帶，而rAd-mod.HPV16L1可見明顯的55kD條帶，Ad5未檢測到目的蛋白的表達(參見圖4)。mod.HPV16L1基因在重組腺病毒介導(dǎo)下獲得了高效表達。
通過比較Western blot各條帶信號的強弱，我們推算出優(yōu)化基因表達水平至少提高了50倍。這表明優(yōu)化基因mod.HPV16L1在哺乳動物細胞中的表達較野生型基因有十分顯著的提高，證明我們對HPV16L1基因的改造是成功的，mod.HPV16L1基因可在腺病毒載體介導(dǎo)下在哺乳動物細胞中獲得高效表達。
(3)重組腺病毒滴度的測定TCID50實驗的基礎(chǔ)是應(yīng)用極限稀釋法使293細胞出現(xiàn)病變從而估計滴度。細胞的準備準備10ml含2％胎牛血清的DMEM重懸細胞，將細胞濃度調(diào)至1×105/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100μl。細胞貼壁后，將上清棄去。病毒的稀釋第一管中加入0.9ml含2％胎牛血清的DMEM，其余則加入1.8ml。第一管中加入0.1ml病毒原液。上下抽吸5次使它們混勻。每一次稀釋后都更換吸頭。從第一管中吸取0.2ml加入第二管。重復(fù)這個稀釋步驟直到最高稀釋度。96孔板的每一排10孔作為一個稀釋度。11，12列不加病毒作為陰性對照。實驗孔每孔加入0.1ml不同稀釋度病毒。把96孔板放在37℃孵箱培養(yǎng)10天，觀察病變。只要有一個小病變此孔即作為陽性對待，如果不易判斷可跟陰性對照比較。最后按公式T＝101+d(s-0.5)計算病毒的滴度(d為稀釋度的對數(shù)值，s為病變比例的和)。
檢測結(jié)果顯示，第六代病毒滴度達到4×108PFU/ml。
(4)HPV16L1蛋白病毒樣顆粒的電鏡觀察rAd-mod.HPV16L1重組腺病毒以1PFU/cell滴度感染5×108293T細胞，48h收獲細胞，參照Pyeon D報道的純化方法(Pyeon D，Proc Natl Acad Sci USA，2005，1029311-9316.)，用1ml含10mmol/L MgCl2的D-PBS重懸細胞，加入Brij58至終濃度0.25％，37℃孵育24h，加入0.2％ Benzonase核酸酶37℃孵育30min。裂解產(chǎn)物加入0.17體積5mol/L NaCl，置冰上10min，4℃ 4000g離心10min，收集上清置4℃?zhèn)溆?。Ultra-Clear離心管中依次鋪上27％、33％、39％的Optiprep(用含0.8mol/L NaCl的PBS配制)，室溫避光靜置4h后將500μl離心收集的裂解上清小心加入密度梯度介質(zhì)上，Beckman Optima L-XP超速離心機SW41轉(zhuǎn)頭16℃ 215000g離心3.5h，由下至上用針刺分別收集離心管中下部浮力密度約1.15～1.18g/ml之間各組分，置1.5ml硅化離心管內(nèi)，1ml/管共收集5管，取5μl進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。免疫印跡法檢測HPV16L1蛋白。取20μl純化的HPV16L1病毒樣顆粒(VLPs)懸液用磷鎢酸負染，在透射電鏡下觀察病毒樣顆粒的形態(tài)。結(jié)果顯示，電鏡下可見直徑約55nm的病毒樣顆粒的存在，證明重組腺病毒載體介導(dǎo)表達的HPV16L1蛋白可正確組裝成病毒樣顆粒(參見圖5)。
序列表<110>曾毅<120>含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因的重組腺病毒<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1518<212>DNA<213>人乳頭瘤病毒(HPV)16型<220>
<221>CDS<222>(1)..(1518)<223>
<400>1atg agc ctg tgg ctg ccc agc gag gcc acc gtg tac ctg ccc ccc gtg 48Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val1 5 10 15ccc gtg agc aag gtg gtg agc acc gac gag tac gtg gcc cgg acc aac 96Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn20 25 30atc tac tac cac gcc ggc acc agc cgc ctg ctg gcc gtg ggc cac ccc144Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro35 40 45tac ttc ccc atc aag aag ccc aac aac aac aag atc ctg gtg ccc aag192Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys50 55 60gtg agc ggc ctg cag tac cgg gtg ttc cgg atc cac ctg ccc gac ccc240Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro65 70 75 80aac aag ttc ggc ttc ccc gac acc agc ttc tac aac ccc gac acc cag288Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln85 90 95
agg ctg gtg tgg gcc tgc gtg ggc gtg gag gtg ggc agg ggc cag ccc 336Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro100 105 110ctg ggc gtg ggc atc agc ggc cac ccc ctg ctg aac aag ctg gac gac 384Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp115 120 125acc gag aac gcc agc gcc tac gcc gcc aac gcc ggc gtg gac aac agg 432Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Ash Arg130 135 140gag tgc atc agc atg gac tac aag cag acc cag ctg tgc ctg atc ggc 480Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly145 150 155 160tgc aag ccc ccc atc ggc gag cac tgg ggc aag ggc agc ccc tgc acc 528Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr165 170 175aac gtg gcc gtg aac ccc ggc gac tgc ccc ccc ctg gag ctg atc aac 576Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn180 185 190acc gtg atc cag gac ggc gac atg gtg gac acc ggc ttc ggc gcc atg 624Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met195 200 205gac ttc acc acc ctg cag gcc aac aag agc gag gtg ccc ctg gac atc 672Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile210 215 220tgc acc agc atc tgc aag tac ccc gac tac atc aag atg gtg agc gag 720Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu225 230 235 240ccc tac ggc gac agc ctg ttc ttc tac ctg agg agg gag cag atg ttc 768Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe245 250 255gtg agg cac ctg ttc aac agg gcc ggc gcc gtg ggc gag aac gtg ccc 816Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro260 265 270gac gac ctg tac atc aag ggc agc ggc agc acc gcc aac ctg gcc agc 864
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser275 280 285agc aac tac ttc ccc acc ccc agc ggc agc atg gtg acc agc gac gcc 912Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala290 295 300cag atc ttc aac aag ccc tac tgg ctg cag agg gcc cag ggc cac aac 960Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn305 310 315 320aac ggc atc tgc tgg ggc aac cag ctg ttc gtg acc gtg gtg gac acc 1008Ash Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr325 330 335acc agg agc acc aac atg agc ctg tgc gcc gcc atc agc acc agc gag 1056Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu340 345 350acc acc tac aag aac acc aac ttc aag gag tac ctg agg cac ggc gag 1104Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu355 360 365gag tac gac ctg cag ttc atc ttc cag ctg tgc aag atc acc ctg acc 1152Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr370 375 380gcc gac gtg atg acc tac atc cac agc atg aac agc acc atc ctg gag 1200Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu385 390 395 400gac tgg aac ttc ggc ctg cag ccc ccc ccc ggc ggc acc ctg gag gac 1248Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp405 410 415acc tac agg ttc gtg acc agc cag gcc atc gcc tgc cag aag cac acc 1296Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr420 425 430ccc ccc gcc ccc aag gag gac ccc ctg aag aag tac acc ttc tgg gag 1344Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu435 440 445gtg aac ctg aag gag aag ttc agc gcc gac ctg gac cag ttc ccc ctg 1392Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu450 455 460
ggc agg aag ttc ctg ctg cag gcc ggc ctg aag gcc aag ccc aag ttc 1440Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe465 470 475 480acc ctg ggc aag agg aag gcc acc ccc acc acc agc agc acc agc acc 1488Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr485 490 495acc gcc aag agg aag aag agg aag ctg tga 1518Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu500 50權(quán)利要求
1.一種密碼子優(yōu)化型的編碼乳頭瘤病毒16型(HPV16)主要衣殼蛋白L1的基因，該基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因，該基因是在不改變HPV16主要衣殼蛋白L1氨基酸序列的條件下，用哺乳動物高頻使用的密碼子取代HPV16L1基因序列的密碼子得到的。
3.一種復(fù)制缺陷型重組腺病毒，該病毒攜帶有權(quán)利要求1所述的基因。
4.一種制備權(quán)利要求3所述復(fù)制缺陷型重組腺病毒的方法，該方法包括(1)通過用哺乳動物高頻使用的密碼子取代HPV16L1基因序列的密碼子，得到密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因；(2)將步驟(1)得到的攜帶密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒，得到攜帶密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因序列的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；(3)用步驟(2)得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染適當?shù)南俨《景b細胞，得到攜帶有優(yōu)化型HPV16L1基因序列的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的腺病毒穿梭質(zhì)粒是質(zhì)粒PDC316。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的重組腺病毒骨架質(zhì)粒是質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的腺病毒包裝細胞是293細胞。
8.權(quán)利要求3所述的重組腺病毒在制備用于預(yù)防和/或治療宮頸癌的疫苗和藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程和腫瘤治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明公開了密碼子優(yōu)化型的編碼HPV16主要衣殼蛋白L1的基因序列，本發(fā)明還公開了含密碼子優(yōu)化型HPV16L1基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒及其制備方法。
文檔編號C12N15/861GK1821410SQ200610056900
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者曾毅, 周玲, 周玉柏, 吳小兵 申請人:曾毅