專利名稱：一種篩選抗條銹病小麥的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抗條銹病小麥的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
小麥條銹病(Puccinia striiformis f.sp.tritici)是一種分布廣泛的氣傳病害，幾乎在所有小麥主產(chǎn)國家都有發(fā)生，冷涼和高海拔地區(qū)尤為嚴(yán)重。我國是世界上最大的小麥條銹病流行區(qū)，主要發(fā)生在我國的西北和西南地區(qū)。從20世紀(jì)50年代至今，我國曾發(fā)生15次中度流行和7次較大規(guī)模流行，其中1950、1964、1990和2002年四次大流行發(fā)生面積最大，危害也最重，前兩次發(fā)病面積達(dá)2億畝以上，后兩次發(fā)病1.1億畝以上，分別損失小麥600、300、265和100萬噸(萬安民等，2002年我國小麥條銹病發(fā)生回顧植物保護(hù)2003，29(2)5-8)。選育抗病品種是防治小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的方法。目前已經(jīng)命名的小麥抗條銹病基因有40個(gè)，分布于37個(gè)位點(diǎn)(有3個(gè)復(fù)等位基因)，這些命名的基因多是有生理?；缘拿缙诳共』?，苗期抗病基因由于其對(duì)條銹病害的高抗而深受育種家喜愛，但是當(dāng)大面積種植抗病基因單一的品種會(huì)加速病原物小種的定向化選擇，并哺育優(yōu)勢小種種群的增長，導(dǎo)致抗銹品種在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用幾年之后喪失其抗病性。由于“洛類”和“繁6”衍生系的大面積種植導(dǎo)致新致病小種CYR31和CYR32的出現(xiàn)而爆發(fā)了2002年的條銹病大流行。由于認(rèn)識(shí)到單一抗病基因的潛在危害，育種學(xué)家和植病學(xué)家希望通過利用多基因聚合、基因布局和多系品種來延長苗期抗病基因的抗性壽命。要實(shí)現(xiàn)多基因聚合、基因布局和多系品種，必須有豐富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因僅有Yr5、Yr10、Yr15、Yr24和Yr26，因此尋找和發(fā)掘新的抗源異常重要。
分子標(biāo)記(包括RAPD、RFLP、SSR和RGAP)在小麥的基因作圖中得到了廣泛應(yīng)用，近年來，利用分子標(biāo)記定位和標(biāo)記了多個(gè)小麥抗條銹病基因。SSR標(biāo)記由于其多態(tài)性高，適合基因定位和作圖，共顯性和重復(fù)性好而受到更廣泛的應(yīng)用，緊密連鎖的SSR標(biāo)記可用于標(biāo)記輔助選擇和聚合育種。
1987年育成的小麥品系周8425B是一個(gè)很好的抗病育種材料，是目前抗我國所有條銹菌流行小種。以周8425B為親本材料已育出7個(gè)推廣品種，其中周麥11和周麥12從1997到2005年每年平均種植面積50萬公頃。我們對(duì)周8425B進(jìn)行苗期基因推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)其可能含有新的抗條銹病基因，進(jìn)一步通過對(duì)周8425B和中國春雜交產(chǎn)生的F1、F2和F3進(jìn)行遺傳分析和分子標(biāo)記，將抗病基因定位于7BL染色體上，找到其緊密連鎖的SSR標(biāo)記，并用于標(biāo)記輔助育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于篩選抗條銹病小麥的引物。
本發(fā)明所提供的用于篩選抗條銹病小麥的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對(duì)以及由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)。
將由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對(duì)命名為cfa2040，序列表中SEQ ID №1由24個(gè)堿基組成，SEQ ID №2由20個(gè)堿基組成，將用引物對(duì)cfa2040經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的分子標(biāo)記命名為Xcfa2040；將由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)命名為barc32，序列表中SEQ ID №3由26個(gè)堿基組成，SEQ ID №4由26個(gè)堿基組成，將用引物對(duì)barc32經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的分子標(biāo)記命名為Xbarc32。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種篩選抗條銹病小麥的方法。
本發(fā)明所提供的篩選抗條銹病小麥的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對(duì)cfa2040的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有265bp大小的條帶，并且在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)barc32的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有238bp大小的條帶的侯選小麥品種為抗條銹病小麥。
其中，20μl PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U(北京天為時(shí)代公司)，上、下游引物(2μmol·L-1)各1.5μl，dNTPs(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃變性40s，55℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。
所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色。具體方法可為取20μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入4μl變性載樣指示劑(98％無離子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚藍(lán)和0.1％二甲苯青)，94℃變性5min后，立即放入冰水混合物中冷卻5-10min，每份變性的擴(kuò)增樣品6μl在濃度為6％的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有265bp和238bp大小的條帶。
本發(fā)明提供了一個(gè)新的小麥抗條銹病基因的SSR標(biāo)記Xcfa2040和Xbarc32，連鎖距離分別為1.4cM和4.8cM，該抗條銹病基因?qū)ξ覈壳暗牧餍行》N都表現(xiàn)抗病。利用該抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)有效抗病基因的累加，延長品種的抗病性。本發(fā)明的新抗病基因及其專用引物將在小麥抗病育種中發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為用微衛(wèi)星引物cfa2040對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2為用微衛(wèi)星引物Xbarc32對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為7個(gè)SSR標(biāo)記與該抗病基因的連鎖圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有引物合成均由大連寶生物(TaKaRa)公司或上海生工完成。小麥材料周8425B由河南省周口市農(nóng)科院選育，未注明來源的小麥材料均購自于國家種質(zhì)資源庫。
實(shí)施例1、小麥抗條銹病新基因的SSR標(biāo)記Xcfa2040和Xbarc32的獲得及基因來源鑒定一、小麥抗條銹病新基因的SSR標(biāo)記Xcfa2040和Xbarc32的獲得用我國目前流行的條銹病小種CYR32對(duì)小麥材料周8425B和中國春(親本)的F1、F2和F3代群體進(jìn)行苗期抗性鑒定，共鑒定F1群體8株，F(xiàn)2群體611株，F(xiàn)3家系97株，結(jié)果如表1所示，F(xiàn)1全部抗病，F(xiàn)2抗感分離符合3∶1(x2＝2.91，P＞0.05)，F(xiàn)3家系分離比例為純合抗∶抗感分離∶純合感＝1∶2∶1(x2＝1.268，P＞0.5)，表明周8425B中含有一個(gè)顯性抗病基因。從中選用20個(gè)典型抗病株和10個(gè)感病株分別組成抗病池和感病池。
表1 親本周8425B、中國春以及它們的后代F1和F2群體對(duì)小種CYR32的苗期侵染型

說明0；-2為抗病侵染型；3-4為感病侵染型選用790個(gè)SSR引物，其中GWM(Gatersleben wheat microsatellite)系列240個(gè)(http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes arg1=WMS*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，WMC(Wheat Microsatellite Consortium)系列543個(gè)(http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes arg1=WMC*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，5個(gè)BARC系列引物(barc10、barc32、barc94、barc123和barc182，http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes arg1=BARC*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，2個(gè)CFA系列引物(cfa2040和cfa2106，http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes arg1=CFA*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，以周8425B、中國春、抗病池和感病池的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測，20μl PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U(北京天為時(shí)代公司)，上、下游引物(2μmol·L-1)各1.5μl，dNTPs(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?4℃ 4min；然后94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min，4℃保存。
然后按下述方法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，取20μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入4μl變性載樣指示劑(98％無離子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚藍(lán)和0.1％二甲苯青)，94℃變性5min后，立即放入冰水混合物中冷卻5-10min，每份變性的擴(kuò)增樣品6μl在濃度為6％的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。結(jié)果位于染色體7BL上的7個(gè)標(biāo)記Xgwm577、Xwmc273、Xwmc276、Xwmc526、Xbarc32、Xbarc182和Xcfa2040在親本和抗感池之間有多態(tài)性，初步表明這些標(biāo)記和抗條銹病基因連鎖，其中，用微衛(wèi)星引物Xcfa2040(序列表中的序列1和序列2)和Xbarc32(序列表中的序列3和序列4)對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果如圖1和圖2所示(M為Marker，P1為周8425B，P2為中國春，Br為抗病池，Bs為感病池，R為抗病單株，S為感病單株)，用引物cfa2040擴(kuò)增，出現(xiàn)了3種電泳帶型，分別稱為帶型A(265bp)、B(286bp)和H(雜合帶型)，周8425B、抗病池和抗病單株可擴(kuò)增出265bp的DNA片段，見圖1中帶型A，P2、感病池和感病單株可擴(kuò)增出286bp的DNA片段，見圖1中帶型B；用引物Xbarc32擴(kuò)增，出現(xiàn)了3種電泳帶型，分別稱為帶型A(238bp)、B(213bp)和H(雜合帶型)，周8425B、抗病池和抗病單株可擴(kuò)增出238bp的DNA片段，見圖1中帶型A，P2、感病池和感病單株可擴(kuò)增出213bp的DNA片段，見圖1中帶型B。
再用染色體7BL上的7個(gè)引物Xgwm577、Xwmc273、Xwmc276、Xwmc526、Xbarc32、Xbarc182和Xcfa2040對(duì)F2群體611個(gè)單株分別進(jìn)行擴(kuò)增(反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上)，用Mapmanager QTX b20進(jìn)行處理，繪制基因連鎖圖，如圖3所示，表明這7個(gè)標(biāo)記都與抗病基因連鎖，遺傳距離從1.4cM到11.3cM。
用距離抗病基因較近的兩個(gè)標(biāo)記Xcfa2040和Xbarc32對(duì)97個(gè)F3家系進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示，用Mapmanager QTX b20進(jìn)行處理，表明這兩個(gè)標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離分別為5.7cM和5.6cM。
表2 97F3家系的苗期鑒定結(jié)果及SSR標(biāo)記Xcfa2040-7B和Xbarc32-7B在各個(gè)F3家系中帶型

說明RR表示純合抗病的家系，Rr表示發(fā)生抗感分離的家系，Rr表示純合感病的家系；A代表周8425B中的帶型，B代表中國春中的帶型，H代表雜合帶型。
二、小麥抗條銹病新基因的來源鑒定現(xiàn)檢測該抗條銹病基因的來源，對(duì)周8425B的兩個(gè)親本周78A和安農(nóng)7959用CYR32進(jìn)行苗期抗性鑒定，周78A由于沒有發(fā)芽沒有作鑒定，安農(nóng)7959對(duì)CYR32表現(xiàn)中抗，與周8425B反應(yīng)型相同，又分別用引物對(duì)cfa2040和barc32以周8425B、中國春、周78A和安農(nóng)7959的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果安農(nóng)7959與周8425B帶型一致，兩個(gè)引物分別擴(kuò)增出265bp和238bp與抗病基因連鎖的帶型，周78A和中國春的帶型相同，分別擴(kuò)增出286bp和213bp在感病植株里出現(xiàn)的帶，表明周8425B中的該抗條銹病基因來源于安農(nóng)7959。
實(shí)施例2、用Xcfa2040和Xbarc32分子標(biāo)記篩選抗條銹病小麥實(shí)驗(yàn)用小麥品種練豐一號(hào)、山前麥、St2422/464和安農(nóng)7959按常規(guī)方法種植上述小麥品種，收獲籽粒后提取各個(gè)小麥品種的基因組DNA，然后以其為模板，分別在由序列表中引物cfa2040和barc32的上下游核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μl PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U(北京天為時(shí)代公司)，上、下游引物(2μmol·L-1)各1.5μl，dNTPs(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?4℃ 4min；然后94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10min，4℃保存。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色，引物cfa2040擴(kuò)增出兩種帶型為A(265bp)和B(286bp)，在小麥品種練豐一號(hào)、山前麥和St2422/464中擴(kuò)增出了B帶(286bp)，在安農(nóng)7959擴(kuò)增出了A帶(265bp)；引物barc32擴(kuò)增出的兩種帶型為A(238bp)和B(213bp)，練豐一號(hào)、山前麥和St2422/464中擴(kuò)增出B帶(213bp)，安農(nóng)7959擴(kuò)增出A帶(238bp)，表明安農(nóng)7959含有實(shí)施例1中的抗條銹病新基因，另外幾個(gè)品種不含有該抗病基因，與抗病性鑒定結(jié)果一致，證明Xcfa2040的265bp擴(kuò)增片段和Xbarc32的238bp擴(kuò)增片段的有無同小麥品種的條銹病抗性有無密切相關(guān)。
序列表<160>4<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1tcaaatgatt tcaggtaacc acta 24<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2ttcctgatcc caccaaacat20<210>3<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<230>
<400>3gcgtgaatcc ggaaacccaa tctgtg 26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>4tggagaacct tcgcattgtg tcatta 2權(quán)利要求
1.用于篩選抗條銹病小麥的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對(duì)以及由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)。
2.一種篩選抗條銹病小麥的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，在權(quán)利要求1所述的由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有265bp大小的條帶，并且在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有238bp大小的條帶的侯選小麥品種為抗條銹病小麥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于20μl PCR反應(yīng)體系為模板DNA 60ng，Taq酶1U，2μmol·L-1上、下游引物各1.5μl，25μmol·L-1dNTPs 0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl；PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?4℃4min；然后94℃40s，55℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物方法為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選抗條銹病小麥的方法及其專用引物。用于篩選抗條銹病小麥的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對(duì)以及由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)。該篩選抗條銹病小麥的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，在由序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有265bp大小的條帶，并且在由序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中有238bp大小的條帶的小麥品種為抗條銹病小麥。SSR標(biāo)記Xcfa2040和Xbarc32的連鎖距離分別為1.4cm和4.8cm。本發(fā)明的新抗病基因及其專用引物將在小麥抗病育種中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1858256SQ20061005873
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者何中虎, 鄭天存, 夏先春, 李在峰, 李新平 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院