專利名稱：嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生菌及嘌呤類物質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及5′-肌苷酸及5′-鳥苷酸代表的嘌呤核苷酸，及在作為這種合成原料的重要物質(zhì)的肌苷和鳥苷等嘌呤核苷等的嘌呤類物質(zhì)的制備方法中使用的芽孢桿菌屬細(xì)菌。嘌呤類物質(zhì)適用于調(diào)料、醫(yī)藥及其原料等。
背景技術(shù)：
關(guān)于通過發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷和鳥苷，使用需要腺嘌呤的菌株，或者而且對(duì)以嘌呤類似物為起始的各種藥劑有抗性的芽孢桿菌屬微生物(參考專利文獻(xiàn)1～8)以及短桿菌屬的微生物(參考專利文獻(xiàn)9，10或非專利文獻(xiàn)1)等的方法是已知的。
為得到這種突變株，現(xiàn)有技術(shù)中通常進(jìn)行紫外線照射、亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)處理等誘導(dǎo)突變的處理，采用合適的選擇性培養(yǎng)基，得到目的突變株的方法。
一方面，揭示了用芽孢桿菌屬的微生物(參考專利文獻(xiàn)11～20)、短桿菌屬的微生物(參考專利文獻(xiàn)21)以及大腸桿菌屬的微生物(參考專利文獻(xiàn)22)采用基因工程技術(shù)對(duì)嘌呤類物質(zhì)的產(chǎn)生株進(jìn)行育種。具體而言，例如，揭示了使用嘌呤操縱子的阻遏物蛋白基因(purR)被破壞的芽孢桿菌屬細(xì)菌，有效地制備次黃嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤以及腺嘌呤等的核酸類物質(zhì)的方法(參考專利文獻(xiàn)23)。
在枯草芽孢桿菌中，上述阻遏物蛋白，除已知調(diào)節(jié)嘌呤操縱子基因組以外，還調(diào)節(jié)與AMP生物合成有關(guān)的purA基因(參考非專利文獻(xiàn)2)、與甲酰四氫葉酸生物合成有關(guān)的glyA基因(參考非專利文獻(xiàn)3)以及編碼次黃嘌呤/鳥嘌呤的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的pbuG基因(參考非專利文獻(xiàn)4)等的表達(dá)。
進(jìn)一步，揭示了通過除了破壞purR基因，破壞琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，給予腺嘌呤要求性，以及破壞嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)，抑制肌苷分解為次黃嘌呤，有效地制備肌苷的方法(參考專利文獻(xiàn)8)。
氧化磷酸戊糖途徑，是把葡萄糖通過葡萄糖激酶磷酸化生物合成葡萄糖-6-磷酸，該葡萄糖-6-磷酸的氧化轉(zhuǎn)換成核糖-5-磷酸的途徑。該途徑和嘌呤類物質(zhì)的生物合成途徑的關(guān)系還不太清楚，還沒有嘗試改變微生物的氧化的磷酸戊糖途徑，來培養(yǎng)嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生菌。
特公昭38-23099號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)2]特公昭54-17033號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)3]特公昭55-2956號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)4]特公昭55-45199號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)5]特公昭57-14160號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)6]特公昭57-41915號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)7]特開昭59-42895號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)8]特開2004-242610號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)9]特公昭51-5075號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)10]特公昭58-17592號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)11]特開昭58-158197號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)12]特開昭58-175493號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)13]特開昭59-28470號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)14]特開昭60-156388號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)15]特開平1-27477號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)16]特開平1-174385號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)17]特開平3-58787號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)18]特開平3-164185號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)19]特開平5-84067號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)20]特開平5-192164號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)21]特開昭63-248394號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)22]國(guó)際公開第99/03988號(hào)小冊(cè)子[專利文獻(xiàn)23]美國(guó)專利第6,284,495號(hào)[非專利文獻(xiàn)1]Agric.Biol.Chem.，1978，42，399-405[非專利文獻(xiàn)2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，7455-7459[非專利文獻(xiàn)3]J.Bacteriol.，2001，183，6175-6183[非專利文獻(xiàn)4]J.Bacteriol.，2003，185，5200-5209，

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的課題是為通過發(fā)酵法制備嘌呤核苷以及/或嘌呤核苷酸等的嘌呤類物質(zhì)，建立合適的芽孢桿菌屬細(xì)菌，并提供使用該細(xì)菌的嘌呤類物質(zhì)的制備方法。
解決課題的手段本發(fā)明人，為解決上述課題進(jìn)行深入研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于芽孢桿菌屬細(xì)菌，通過增強(qiáng)氧化磷酸戊糖途徑的酶活性，尤其葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或核糖-5-磷酸異構(gòu)酶的活性，來提高嘌呤核苷、嘌呤核苷酸的產(chǎn)生能力。又發(fā)現(xiàn)通過改變以提高編碼磷酸核糖焦磷酸(ホスホリボシルピロリン酸)(PRPP)合成酶、或者與嘌呤核苷酸生物合成有關(guān)的酶的基因的表達(dá)，或者改變以降低嘌呤核苷磷酸化酶活性，可以進(jìn)一步地提高芽孢桿菌屬細(xì)菌的嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力，達(dá)到完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明為以下幾點(diǎn)。
(1)、芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，具有產(chǎn)生嘌呤類物質(zhì)的能力，改變以提高氧化磷酸戊糖途徑的酶活性；(2)、(1)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷的嘌呤核苷；(3)、(1)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷酸、黃苷酸、鳥苷酸、腺苷酸的嘌呤核苷酸；(4)、(1)～(3)的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，上述氧化磷酸戊糖途徑的酶是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或核糖-5-磷酸異構(gòu)酶；(5)、(1)～(4)的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，通過增加編碼上述酶的基因的拷貝數(shù)(コピ一數(shù))或者改變?cè)摶虻谋磉_(dá)調(diào)節(jié)序列而增強(qiáng)氧化磷酸戊糖途徑的酶活性；(6)、(5)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述酶是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，編碼該葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因?yàn)樵谙铝?A)或(B)中表示的編碼蛋白質(zhì)的基因；(A)具有序列號(hào)48中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)
(B)在序列號(hào)48中記載的氨基酸序列中，具有含1個(gè)或者多個(gè)的氨基酸殘基的置換、缺失、插入、添加、或者倒位的氨基酸序列，并且，具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)(7)、(5)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述酶是核糖5-磷酸異構(gòu)酶，編碼該核糖5-磷酸異構(gòu)酶的基因是下列(E)或(F)中所示的編碼蛋白質(zhì)的基因；(E)具有序列號(hào)50中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(F)在序列號(hào)50中記載的氨基酸序列中，具有含1個(gè)或者多個(gè)的氨基酸殘基的置換、缺失、插入、添加、或者倒位的氨基酸序列，并且，具有核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)(8)、(6)及(7)的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述多個(gè)氨基酸為2～20個(gè)氨基酸；(9)、(5)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述酶為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，編碼該葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因?yàn)橄铝?a)或(b)中所示的DNA；(a)含有序列號(hào)47中記載的堿基序列的DNA(b)是在含有序列號(hào)47中記載的堿基序列或者從該堿基序列制備得到的探針和嚴(yán)格條件下雜交的DNA，而且編碼具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA(10)(5)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，前述酶是核糖5-磷酸異構(gòu)酶，編碼該核糖5-磷酸異構(gòu)酶的基因是下列(e)或(f)中所示的DNA；(e)含有序列號(hào)49中記載的堿基序列的DNA(f)是含有序列號(hào)49中記載的堿基序列或者從該堿基序列制備得到的探針和嚴(yán)格條件下雜交的DNA，并且編碼具有核糖5-磷酸異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的DNA(11)、(1)～(10)的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，更進(jìn)一步地改變以提高磷酸核糖焦磷酸合成酶活性；(12)、(1)～(11)的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，更進(jìn)一步地改變以提高嘌呤操縱子的表達(dá)量；(13)、(12)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，通過破壞編碼嘌呤操縱子的阻遏物的基因即purR基因，或者除去嘌呤操縱子的弱化子(プリンオペロンのアテニユエ一タ一)區(qū)域的一部分，來提高嘌呤操縱子的表達(dá)量；(14)、(1)～(13)的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，更進(jìn)一步地改變以降低嘌呤核苷磷酸化酶活性；(15)、嘌呤類物質(zhì)的制備方法，特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(1)～(14)的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，使嘌呤類物質(zhì)蓄積，回收嘌呤類物質(zhì)；(16)、(15)的制備方法，嘌呤類物質(zhì)是嘌呤核苷或者嘌呤核苷酸；(17)、(16)的制備方法，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷的嘌呤核苷；(18)、(16)的制備方法，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷酸、黃苷酸、鳥苷酸、腺苷酸的嘌呤核苷酸；(19)、嘌呤核苷酸的制備方法，特征在于，通過(17)的方法制備嘌呤核苷，該嘌呤核苷與選自多磷酸、苯磷酸、氨甲酰磷酸的磷酸供體，通過具有產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯能力的微生物或酸性磷酸酶的作用，生成嘌呤核苷酸，得到該嘌呤核苷酸。
發(fā)明效果通過使用本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，能有效率地制備嘌呤核苷、嘌呤核苷酸等的嘌呤類物質(zhì)。


圖1顯示嘌呤操縱子的構(gòu)造圖。方框框圍起的序列為嘌呤操縱子引物，上面實(shí)線表示的序列為抗終止因子對(duì)(antiterminator dyad)，下面的虛線表示的序列為終止子對(duì)(terminator dyad)。缺失序列(75bp)用大寫字母表示。
圖2顯示各種改變型嘌呤操縱子啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的圖。WT顯示KMBS296的活性，ΔrpurR顯示KMBS295的活性，ΔR+Ppur1顯示KMBS296的活性，ΔR+Ppur3顯示KMBS297的活性，ΔR+Ppur5顯示KMBS298的活性，ΔR+Ppur-Δatt顯示KMBS299的活性，以及ΔR+Ppur1-Δatt顯示KMBS300的活性。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案<1>本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌(I)賦予嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，是具有嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力，增強(qiáng)氧化磷酸戊糖途徑的酶活性的變異的芽孢桿菌屬細(xì)菌。
作為“嘌呤類物質(zhì)”，是指含有嘌呤骨架的物質(zhì)，例舉嘌呤核苷、嘌呤核苷酸等。文中所述嘌呤核苷，指肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷等，所述嘌呤核苷酸，指嘌呤核苷的5′-磷酸酯，例如肌苷酸(肌苷-5′-磷酸，以下稱為“IMP”)、黃苷酸(黃苷5′-磷酸，以下稱為“XMP”)、鳥苷酸(鳥苷-5′-單磷酸、以下稱為“GMP”)、腺苷酸(腺苷-5′-單磷酸，以下稱為“AMP’)等。
所述“嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力”，是指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌時(shí)，以能從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收嘌呤類物質(zhì)的程度，向細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)基中分泌、生成、蓄積的能力。還有，本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，具有上述嘌呤類物質(zhì)中的2種或2種以上的產(chǎn)生能力的也是可以的。
作為具有嘌呤類物質(zhì)的產(chǎn)生能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌，具有本來的嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力的細(xì)菌是可以的，如以下所示，通過利用突變法、重組DNA法，使芽孢桿菌屬細(xì)菌改變?yōu)榫哂朽堰暑愇镔|(zhì)產(chǎn)生能力而得到的細(xì)菌也是可以的。而且，如下列描述的那樣，通過氧化磷酸戊糖合成途徑的酶活性增強(qiáng)的改變，被賦予嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌也是可以的。
作為用于得到本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌的芽孢桿菌屬細(xì)菌，例舉枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等。作為枯草芽孢桿菌，例舉枯草芽孢桿菌168Marburg(ATCC6051)、枯草芽孢桿菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等，而作為解淀粉芽孢桿菌，可舉出解淀粉芽孢桿菌T(ATCC23842)以及解淀粉芽孢桿菌N(ATCC23845)等。
具有肌苷產(chǎn)生能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌，是通過對(duì)如上述芽孢桿菌屬細(xì)菌賦予，例如，腺嘌呤需要性、或更進(jìn)一步對(duì)嘌呤類似物等的藥劑的抗性而得出的細(xì)菌。(參考特公昭38-23099、特公昭54-17033、特公昭55-45199、特公昭57-14160、特公昭57-41915、特公昭59-42895、US2004-0166575A)。具有營(yíng)養(yǎng)需求性以及藥劑抗性的芽孢桿菌屬細(xì)菌，是通過用于N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、或者EMS(甲基磺酸乙酯)等的常規(guī)突變處理的突變劑處理得到。
作為屬于芽孢桿菌屬的肌苷產(chǎn)生菌株的具體實(shí)例，能使用枯草芽孢桿菌KMBS16菌株。該菌株，是導(dǎo)入了編碼嘌呤操縱子阻遏物的purR基因的缺失(purR::spc)、編碼琥珀酰-AMP合成酶purA基因的缺失(purA::erm)、以及編碼嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因的缺失(deoD::kan)的已知的枯草芽孢桿菌trpC2菌株(168 Marburg)的衍生菌株(特開2004-242610)。另外，還可以使用枯草芽孢桿菌菌株AJ 3772(FERM P-2555)(特開昭62-014794)等。
作為具有鳥苷產(chǎn)生能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌，可以舉出IMP脫氫酶的活性增強(qiáng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌(特開平3-58787)、在腺嘌呤要求性突變株中導(dǎo)入了嘌呤類似物抗性或德夸菌素抗性基因的重組的載體的芽孢桿菌屬細(xì)菌(特公平4-28357)等。
此外，作為產(chǎn)生嘌呤核苷酸的芽孢桿菌屬細(xì)菌，例舉如下。作為肌苷酸產(chǎn)生菌，報(bào)告了枯草芽孢桿菌的磷酸酶(フオスフアタ一ゼ)的活性減弱的肌苷產(chǎn)生菌株(Uchida，K.et al.，Agr.Biol.Chem.，1961，25，804-805、Fujimoto，M.Uchida，K.，Agr.Biol.Chem.，1965，29，249-259)。作為鳥苷酸生產(chǎn)菌，例舉具有腺嘌呤需要性并且對(duì)德夸菌素或?qū)琢虬彼醽嗧烤哂锌剐裕⑶揖哂?’-鳥苷酸(鳥苷-5’-單磷酸，以下稱為“GMP”)產(chǎn)生能力的芽孢桿菌屬的突變株(特公昭56-12438號(hào)公報(bào))。
此外，作為培育具有嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力的芽孢桿菌屬細(xì)菌的方法，例舉以下的方法。例舉與嘌呤核苷和嘌呤核苷酸共同的嘌呤生物合成有關(guān)的酶、即，使嘌呤生物合成酶在細(xì)胞內(nèi)的活性提高的方法。該酶在細(xì)胞內(nèi)的活性，優(yōu)選比芽孢桿菌屬細(xì)菌的非改變株(例如野生型的芽孢桿菌屬細(xì)菌)的活性還高。所述“活性提高”，相當(dāng)于例如，每個(gè)細(xì)胞的酶分子數(shù)的增加的情況、每個(gè)酶分子的比活性提高的情況。例如，通過使上述酶的基因的表達(dá)量提高，可以提高活性。
作為與上述嘌呤生物合成有關(guān)的酶，例舉磷酸核糖焦磷酸(PRPP)酰胺轉(zhuǎn)移酶、PRPP合成酶等。
磷酸戊糖類來源的葡萄糖等的糖原通過代謝生成的分解代謝物的一部分，經(jīng)核酮糖-5-磷酸，成為核糖-5-磷酸。通過生物合成的核糖-5-磷酸，能生成嘌呤核苷、組氨酸以及作為色氨酸的生物合成的不可缺少的前體物質(zhì)的PRPP。具體而言，核糖-5-磷酸，通過磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP synthetase[EC2.7.6.1])轉(zhuǎn)換成PRPP。因此，通過改變以提高PRPP合成酶的活性，能給予芽孢桿菌屬細(xì)菌嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力，如果與強(qiáng)化的磷酸戊糖類生物合成類酶、組合起來更有效。
所述的“增強(qiáng)磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性”，指對(duì)于野生菌株或親株等非改變株磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加。磷酸核糖焦磷酸酸合成酶的活性，例如，根據(jù)Switzer等的方法(Methods Enzymol.，1978，51，3-11)、Roth等的方法(Methods Enzymol.，1978，51，12-17)，進(jìn)行測(cè)定。磷酸核糖焦磷酸酸合成酶的活性增強(qiáng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，例如，與特開2004-242610號(hào)公報(bào)中記載的方法一樣，通過使用質(zhì)粒的方法、在染色體上重組的方法等，通過使編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因在芽孢桿菌屬細(xì)菌中高表達(dá)而制備。本發(fā)明中所用的編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因，可舉出序列號(hào)57中記載的芽孢桿菌屬細(xì)菌來源的prs基因(Genbank Accession No.NC_000964(15913..17376)，就連其他的細(xì)菌來源的基因、動(dòng)植物來源的基因，只要是芽孢桿菌屬中編碼具有磷酸核糖焦磷酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的基因，可以任意使用。
一方面，生成嘌呤核苷、組氨酸、以及色氨酸生物合成中不可缺少的前體物質(zhì)的PRPP，其一部分，通過與嘌呤生物合成有關(guān)的酶類，轉(zhuǎn)換成嘌呤核苷、嘌呤核苷酸。作為編碼這樣的酶類的基因，例如是枯草芽孢桿菌的purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD操縱子的基因(Ebbole DJ and ZalkinH，J.Biol.Chem.，1987，262，17，8274-87)(現(xiàn)在，也稱為purEKBCSQLFMNHDBacillus subtilis and Its Closest Relatives，Editor inChiefA.L.Sonenshein，ASM Press，Washington D.C.，2002)、以及大腸桿菌的嘌呤操縱子基因(Escherichia and Salmonella，Second Edition，Editor in ChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。
因此，通過增強(qiáng)這些基因的表達(dá)，能賦予嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力。此外，本發(fā)明中可以使用的嘌呤操縱子基因不限于此，也可以使用其他的微生物、動(dòng)植物來源的基因。
作為使嘌呤操縱子的表達(dá)量增大的方法，與下文的使氧化磷酸戊糖途徑的酶活性增加一樣，例如，通過使用質(zhì)粒的方法、在染色體上重組的方法等，使嘌呤操縱子基因在芽孢桿菌屬細(xì)菌中高表達(dá)的方法。
作為使嘌呤操縱子的表達(dá)量增大的第2種方法，例舉將嘌呤操縱子固有的啟動(dòng)子置換為更強(qiáng)的啟動(dòng)子、將固有的啟動(dòng)子的-35、-10區(qū)域置換為共有序列。
例如，枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)中，嘌呤操縱子的-35序列是共有序列(TTGACA)，而-10序列是TAAGAT，與共有序列TATAAT是不同的(Ebbole，D.J.and H.Zalikn，J.Biol.Chem.，1987，262，8274-8287)。因此，由于將-10序列(TAAGAT)改變?yōu)楣灿行蛄蠺ATAAT或者TATGAT、TAAAAT，能使嘌呤操縱子的轉(zhuǎn)錄活性提高。此外，啟動(dòng)子序列的置換，可以用與下列的基因置換相同的方法進(jìn)行。
作為使嘌呤操縱子的表達(dá)量增大的第3種方法，例舉使嘌呤操縱子的阻遏物的表達(dá)量降低的方法(US6,284,495號(hào))。
為使嘌呤阻遏物的表達(dá)量降低，例如，通過紫外線照射或NTG或EMS等通常的突變處理中使用的突變劑處理芽孢桿菌屬細(xì)菌，可以采用篩選嘌呤阻遏物的表達(dá)量降低的突變株的方法。
此外，嘌呤阻遏物的表達(dá)量降低的芽孢桿菌屬細(xì)菌，突變處理以外，例如，能通過使用基因重組的方法的同源重組方法(Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory press(1972)Matsuyama，S.andMizushima，S.，J.Bacteriol.，1985，162，1196-1202)，將編碼染色體上的嘌呤阻遏物的基因(purR；GenBank Accession NC_000964序列號(hào)51)用無正常功能的基因(以下，稱為“破壞型基因”)置換得到。
用破壞型基因置換宿主染色體上的正?；?，例如如下。另外，以下的實(shí)例作為purR基因的實(shí)例進(jìn)行說明，對(duì)于其他的基因，例如下文的purA或deoD基因，也同樣能進(jìn)行基因破壞。
同源重組，是將具有和染色體上的序列同源性的序列，在芽孢桿菌屬細(xì)菌內(nèi)不能復(fù)制的質(zhì)粒等導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，在具有一定頻度同源性的序列處開始重組，導(dǎo)入的質(zhì)粒全部被整合到染色體上。然后，進(jìn)一步地在具有染色體上的同源性的序列處開始重組，質(zhì)粒再次從染色體上脫落，此時(shí)通過引起重組的位置而破壞的基因的部分在染色體上固定，原來的正?；蚝唾|(zhì)粒一起從染色體上脫落。通過篩選這樣的菌株，能得到染色體上正常的purR基因被置換成破壞型purR基因的菌株。
通過這樣的同源重組的基因破壞技術(shù)已經(jīng)確立，能利用使用直鏈DNA的方法、使用溫度敏感性質(zhì)粒的方法等。此外，即使通過使用包含在內(nèi)部插入藥物抗性等的標(biāo)記基因的purR基因，而且在作為目的微生物細(xì)胞內(nèi)不復(fù)制的質(zhì)粒，也能進(jìn)行purR基因的破壞。即，用上述質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得藥物抗性的轉(zhuǎn)化體，標(biāo)記基因整合在染色體DNA中。該標(biāo)記基因，因?yàn)槠鋬啥说膒urR基因序列和染色體上的purR基因通過同源重組而整合的可能性高，能高效篩選到破壞型基因株。
在基因破壞中使用的破壞型purR基因，具體而言，篩選通過限制性內(nèi)切酶消化和再結(jié)合，使purR基因的一定區(qū)域缺失，向purR基因插入其他的DNA片段(標(biāo)記基因等)，或點(diǎn)突變法(Kramer，W.and Fritz，H.J.，MethodsEnzymol.，1987，154，350-367)，或重組體PCR法(PCR Technology，StocktonPress(1989))、硫代硫酸鈉、羥胺等的化學(xué)藥劑處理(Shortle，D.and Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75，2170-2174)，在purR基因的編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)等的堿基序列中引起1個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、插入、添加或倒位，被編碼的阻遏物的活性降低或消失，或purR基因的轉(zhuǎn)錄下降或消失基因而能得到。在這些實(shí)施中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和再結(jié)合使purR基因的一定區(qū)域缺失的方法或者向purR基因插入其他的DNA片段的方法，可靠性和穩(wěn)定性的方面來說是令人滿意的。
此外，purR基因，從具有嘌呤操縱子的微生物的染色體DNA，能通過以根據(jù)已知的purR基因的堿基序列合成的寡核苷酸為引物的PCR法得到。此外，從具有嘌呤操縱子的微生物的染色體DNA庫，通過以根據(jù)已知的purR基因的堿基序列合成的寡核苷酸為探針的雜交法，能得到purR基因。關(guān)于枯草芽孢桿菌168 Marburg菌株，報(bào)告了purR基因的堿基序列(GenBankaccession No.D26185(編碼區(qū)堿基號(hào)118041～118898)、NC_000964(編碼區(qū)堿基號(hào)54439～55296))。purR基因的堿基序列以及該基因編碼的氨基酸序列，在序列表的序列號(hào)51及52中顯示(參考特開2004-242610號(hào))。
作為得到purR基因使用的PCR引物，如果擴(kuò)增purR基因的一部分的也是可以的，具體而言，舉出具有序列號(hào)59(GAAGTTGATGATCAAAA)及序列號(hào)60(ACATATTGTTGACGATAAT)中表示的堿基序列的寡核苷酸等。
制備破壞型基因使用的purR基因，不一定含有全長(zhǎng)，只要含有引起基因破壞的必要的長(zhǎng)度就可以了。此外，得到各基因而使用的微生物，該基因，不特別限于具有與基因破壞株的建立使用的芽孢桿菌屬細(xì)菌的purR基因發(fā)生同源重組程度的同源性。但是，通常優(yōu)選使用與作為目的的芽孢桿菌屬細(xì)菌相同的細(xì)菌來源的基因。
能與芽孢桿菌屬細(xì)菌的purR基因發(fā)生同源重組得到的DNA，也可以是編碼在序列號(hào)52中所示的氨基酸序列中，可以是編碼含有1或多個(gè)氨基酸置換、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的DNA。所述“多個(gè)”，例如2～50個(gè)，優(yōu)選2～30個(gè)，更優(yōu)選2～10。
作為與上述芽孢桿菌屬細(xì)菌的purR基因發(fā)生同源重組得到的DNA，具體而言，例舉與具有序列號(hào)51表示的堿基序列的DNA，具有例如70％或70％以上，優(yōu)選80％或80％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，最優(yōu)選95％或95％以上的同源性的DNA。更具體而言，例舉與具有序列號(hào)51表示的堿基序列的DNA，在嚴(yán)格的條件下，雜交的DNA。作為嚴(yán)格的條件，例舉60℃，用相當(dāng)于1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC、0.1％SDS的鹽濃度進(jìn)行洗滌的條件。
作為前述標(biāo)記基因，例舉大觀霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等藥物抗性基因。屎腸球菌(Enterococcus faecalis)來源的大觀霉素抗性基因，從芽孢桿菌ジエネチツクストツクセンタ一(BGSC)出售的大腸桿菌ECE101菌株，來制備質(zhì)粒pDG1726，通過從該質(zhì)粒作為組件(カセツト)取出，能夠得到。此外，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的紅霉素抗性基因，從芽孢桿菌ジエネチツクストツクセンタ一(BGSC)出售的大腸桿菌ECE91菌株，來制備質(zhì)粒pDG646，通過從該質(zhì)粒作為組件取出，能夠得到。更進(jìn)一步地，卡那霉素抗性基因，糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)來源的卡那霉素抗性基因，由從芽孢桿菌ジエネチツクストツクセンタ一(BGSC)出售的大腸桿菌ECE94菌株，來制備質(zhì)粒pDG783，通過從該質(zhì)粒作為組件取出，能夠得到。
使用作為標(biāo)記基因的藥劑抗性基因時(shí)，如果用將該基因插入到質(zhì)粒中的purR基因的合適的位置而得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物，若篩選藥物抗性的轉(zhuǎn)化體，則得到purR基因破壞株。染色體上的purR基因被破壞，通過Southern印跡雜交(サザンブロツテイング)或PCR法，經(jīng)解析染色體上的purR基因或標(biāo)記基因而能確認(rèn)。確認(rèn)前述大觀霉素抗性基因、紅霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因被重組在染色體DNA上，能通過使用能擴(kuò)增這些基因的引物的PCR進(jìn)行。
此外，已知嘌呤操縱子的表達(dá)，被在啟動(dòng)子下游位置的終止子-抗終止子序列(terminator-antiterminator序列)(以下，稱為抗終止子序列)抑制(Ebbole，D.J.and Zalkin，H.，J.Biol.Chem.，1987，262，8274-8287、Ebbole，D.J.andZalkin，H.，J.Biol.Chem.，1988，263，10894-10902、Ebbole，D.J.and Zalkin，H.，J.Bacteriol.，1989，171，2136-2141)(參考圖1)。因此，通過使抗終止子序列缺失，能提高嘌呤操縱子的表達(dá)量。抗終止子序列的缺失，可以用與purR破壞相同的方法進(jìn)行。
還有，為使嘌呤操縱子轉(zhuǎn)錄更進(jìn)一步增大，可以使上述方法組合，例如，破壞purR基因并進(jìn)一步用質(zhì)粒擴(kuò)增使抗終止子序列缺失的嘌呤操縱子，或者，可以使這樣的嘌呤操縱子在染色體上多拷貝。
此外，與嘌呤生物合成有關(guān)的酶活性增強(qiáng)，可以解除與嘌呤生物合成有關(guān)的酶的調(diào)節(jié)，例如，可以通過解除前述酶的反饋(フイ一ドバツク)阻礙的方法進(jìn)行(WO99/03988)。
更進(jìn)一步，減少嘌呤類物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)攝取，也能增強(qiáng)嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力。例如，嘌呤核苷的細(xì)胞內(nèi)攝取，能通過阻斷嘌呤核苷的細(xì)胞內(nèi)攝取有關(guān)的反應(yīng)而減少。與上述嘌呤核苷的細(xì)胞內(nèi)攝取有關(guān)的反應(yīng)，例如是核苷滲透酶(パ一ミア一ゼ)催化的反應(yīng)。
更進(jìn)一步，為使嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力增強(qiáng)，可以使分解嘌呤類物質(zhì)的酶活性降低。作為這樣的酶，例如是嘌呤核苷磷酸化酶。
通過與嘌呤生物合成有關(guān)的酶類，從PRPP生物合成得到的嘌呤核苷酸被脫磷酸化，得到嘌呤核苷。為有效地蓄積嘌呤核苷，優(yōu)選降低將嘌呤核苷更進(jìn)一步地分解成次黃嘌呤等的嘌呤核苷磷酸化酶的活性。即，優(yōu)選改變以起始肌苷的嘌呤核苷為底物的嘌呤核苷磷酸化酶減少或缺失。
具體而言，用芽孢桿菌屬細(xì)菌，能破壞編碼嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因與pupG基因。本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，可以變異為將上述的deoD基因和pupG基因單獨(dú)或同時(shí)破壞的細(xì)菌。deoD基因、pupG基因，能利用例如芽孢桿菌屬來源的基因(deoD；Genbank Accession No.NC 000964(序列號(hào)55)，pupG；Genbank Accession No.NC_000964(序列號(hào)53))，用與上述破壞purR基因同樣的方法得到基因破壞菌株。
更進(jìn)一步地，為使嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力增強(qiáng)，可以使肌苷單磷酸(IMP)脫氫酶的活性降低。作為編碼IMP脫氫酶的基因，例舉guaB基因。作為guaB基因，例如，可以例舉具有GenBank Accession No.NC_000964(15913..17376)中注冊(cè)的堿基序列的基因(序列號(hào)61)。
此外，作為使嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力增強(qiáng)的方法，考慮擴(kuò)增編碼具有排出嘌呤類物質(zhì)活性的蛋白質(zhì)的基因。作為擴(kuò)增這樣的基因細(xì)菌，例如，擴(kuò)增rhtA基因的芽孢桿菌屬細(xì)菌(特開2003-219876)。
用于本發(fā)明中的微生物，若進(jìn)一步使編碼核苷酶或核苷酸酶的基因缺失，可以蓄積與它們各自對(duì)應(yīng)的核苷或核苷酸，或者若滿足肌苷的需求，則可以蓄積這些生物合成體系途徑上的前體以及與其有關(guān)的物質(zhì)。
(II)為提高氧化的磷酸戊糖途徑的酶活性而產(chǎn)生變異的菌株本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，通過提高氧化磷酸戊糖途徑的酶活性的改變，能得到具有上述那樣的嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌株。但是，不論改變的順序，在進(jìn)行提高氧化磷酸戊糖途徑的酶活性的改變的時(shí)候，可以賦予嘌呤核苷酸產(chǎn)生能力也是可以的。
本文中所述的“氧化磷酸戊糖途徑”，是指被攝入到細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖，通過葡萄糖激酶磷酸化，生物合成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸被轉(zhuǎn)換為氧化核糖-5-磷酸的途徑。所述的氧化磷酸戊糖酸途徑的酶，具體而言，指葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC1.1.1.49)或6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)，或者核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(EC5.3.1.6)等酶，本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，可以是改變以提高這些酶中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和核糖-5-磷酸異構(gòu)酶任一個(gè)的活性的菌株。
氧化磷酸戊糖途徑的酶活性，優(yōu)選更提高野生株或非改變株的活性。提高酶活性，用如下的方法測(cè)定。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活性，用如實(shí)施例6的(1)中記載的NADPH生成測(cè)定方法，或者，核糖-5-磷酸異構(gòu)酶的酶活性，用如實(shí)施例6的(2)中記載的核酮糖5-磷酸鹽(ribulose 5-phosphate)生成測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。
對(duì)于氧化磷酸戊糖途徑的酶活性提高的改變，例如，也可以使編碼氧化磷酸戊糖途徑的酶的基因擴(kuò)增。能使用的基因不特別限于編碼具有氧化磷酸戊糖途徑的酶活性的蛋白質(zhì)的基因，例舉如芽孢桿菌屬來源的基因。
枯草芽孢桿菌的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，例舉由序列號(hào)48表示的489個(gè)氨基酸構(gòu)成的，用于改變編碼該蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選具有序列號(hào)47(zwf基因；Genbank Accession No.NC_000964)的堿基序列的基因。另外，zwf基因，存在于枯草芽孢桿菌染色體上的第212位(度)。
此外，作為核糖-5-磷酸異構(gòu)酶，例舉由序列號(hào)50中所示的149個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，能用于改變編碼該蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選具有序列號(hào)49的堿基序列的基因(ywlF基因；Genbank Accession No.NC_000964)。另外，ywlF基因，在枯草芽孢桿菌染色體上第324位，與編碼絲氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶的glyA基因近接存在。而且，核糖-5-磷酸異構(gòu)酶，包含稱為核糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶的酶。
此外，也能使用芽孢桿菌屬以外的細(xì)菌，例如編碼其他的微生物或動(dòng)植物來源的氧化磷酸戊糖途徑的酶的基因。編碼微生物或動(dòng)植物來源的氧化磷酸戊糖途徑的酶的基因，能使用該堿基序列已經(jīng)被決定的基因，或根據(jù)與那些堿基序列同源性(ホモロジ一)等編碼具有氧化磷酸戊糖途徑的酶活性的蛋白質(zhì)的基因從微生物、動(dòng)植物等的染色體上分離，決定堿基序列的基因等。此外，堿基序列被決定后，能使用該序列因此合成的基因。這能通過雜交法、PCR法擴(kuò)增該啟動(dòng)子及含ORF部分的區(qū)域而得到。序列信息利用Genbank等數(shù)據(jù)庫得到。
對(duì)于芽孢桿菌屬細(xì)菌，使這些作為目的的酶的細(xì)胞內(nèi)活性提高，通過編碼該酶的基因表達(dá)增強(qiáng)而達(dá)到。該基因的表達(dá)量的增強(qiáng)，通過提高該基因的拷貝數(shù)而達(dá)到。例如，將編碼前述酶的基因片段與芽孢桿菌屬細(xì)菌中功能載體，優(yōu)選多拷貝(マルチコピ一)型的載體連結(jié)制備重組DNA，也可以將其在芽孢桿菌屬細(xì)菌宿主中導(dǎo)入而轉(zhuǎn)化。
導(dǎo)入的基因，可以使用芽孢桿菌屬細(xì)菌來源的基因以及只要具有芽孢桿菌屬細(xì)菌的作用、大腸桿菌屬細(xì)菌等其他生物來源的基因的任何基因。
作為目的基因，例如，通過以芽孢桿菌屬細(xì)菌的染色體DNA為模板的PCR法(參考PCRpolymerase chain reaction；White，T.J.et al.，Trends Genet.，1989，5，185-189)，能夠得到。染色體DNA，例如根據(jù)斎藤、三浦的方法(參考H.Saito and K.Miura，Biochem.B iophys.Acta，1963，72，619-629、生物工學(xué)實(shí)験書、日本生物工學(xué)會(huì)編、97～98頁、培風(fēng)館、1992年)等，能從作為DNA供給體的細(xì)菌制備。PCR用的引物，根據(jù)芽孢桿菌屬細(xì)菌的已知基因序列，或根據(jù)其他的細(xì)菌等中序列在已知的基因間被保存的區(qū)域的信息能夠制備。
作為在芽孢桿菌屬細(xì)菌中導(dǎo)入目的基因的自我復(fù)制可能的載體，例如，舉例pUB110、pC194、pE194等。此外，作為整合目的基因到染色體DNA上的載體，例舉如pHSG398(寶酒造(株))、pBluescript SK-(Stratagene)等的大腸桿菌用載體等。
連結(jié)裝有目的基因與芽孢桿菌屬細(xì)菌中功能標(biāo)記的載體，制備重組DNA，用與目的基因的末端匹配的限制性內(nèi)切酶切割載體。連結(jié)通常用T 4DNA連接酶等的連接酶進(jìn)行。
作為前述芽孢桿菌屬中功能的標(biāo)記基因，例舉大觀霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等的藥物抗性基因。乳酸球菌來源的大觀霉素抗性基因，從芽孢桿菌ジエネチツクストツクセンタ一(BGSC)出售的大腸桿菌ECE101菌株，構(gòu)建質(zhì)粒pDG1726，通過從該質(zhì)粒作為組件取出，能夠得到。此外，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的紅霉素抗性基因，從芽孢桿菌ジエネチツクストツクセンタ一(BGSC)出售的大腸桿菌ECE91株，構(gòu)建質(zhì)粒pDG646，通過從該質(zhì)粒作為組件取出，能夠得到。進(jìn)一步地，卡那霉素抗性基因，糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)來源的卡那霉素抗性基因，從芽孢桿菌ジエネチツクストツクセンタ一(BGSC)出售的大腸桿菌ECE94株，構(gòu)建質(zhì)粒pDG783，通過從該質(zhì)粒作為組件取出，能夠得到。
將如上述制備的重組DNA導(dǎo)入芽孢桿菌屬細(xì)菌，可以根據(jù)在此前報(bào)告的轉(zhuǎn)化法進(jìn)行。例如，從增殖階段的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞，導(dǎo)入DNA的方法(Dubnau，D.，and Davidoff-Abelson，R.，J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)，或者在使宿主細(xì)胞處于容易整合重組DNA的原生質(zhì)體(プロトプラスト)或者原生質(zhì)球(スフエロプラスト)狀態(tài)下將重組DNA導(dǎo)入DNA接受菌的方法(Chang，S.and Cohen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，1979，168，111-115)。
提高目的基因拷貝數(shù)，也能達(dá)到使該基因在芽孢桿菌屬細(xì)菌的染色體DNA上存在多拷貝。在芽孢桿菌屬細(xì)菌的染色體DNA上多拷貝地導(dǎo)入目的基因，利用在染色體DNA上存在多拷貝的序列為靶標(biāo)通過同源重組進(jìn)行。作為在染色體DNA上多拷貝存在的序列，在轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列、在轉(zhuǎn)移因子的末端存在的反向重復(fù)序列(インバ一テツド·リピ一ト)等能利用。
目的酶的活性增強(qiáng)，除擴(kuò)增上述基因以外，通過將染色體DNA上或質(zhì)粒上的目的基因的啟動(dòng)子等的表達(dá)調(diào)節(jié)序列置換成更強(qiáng)的而達(dá)到。啟動(dòng)子的強(qiáng)度，由RNA合成起始的頻度來定義。啟動(dòng)子的強(qiáng)度的評(píng)價(jià)法及更強(qiáng)的啟動(dòng)子的實(shí)例，記載于Goldstein等的論文(Prokaryotic promoters inbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中。此外，如國(guó)際公開W 000/18935中揭示的那樣，目的基因的啟動(dòng)子區(qū)中導(dǎo)入多堿基的堿基置換，能改變?yōu)楦鼜?qiáng)的啟動(dòng)子。更進(jìn)一步，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和起始密碼子之間的間隔，尤其對(duì)起始密碼子近上游的序列的多個(gè)的核苷酸的置換對(duì)mRNA的翻譯效率有很大的影響。這些表達(dá)調(diào)節(jié)序列的改變，也可以與提高目的基因的拷貝數(shù)組合。
例如，作為芽孢桿菌中功能的啟動(dòng)子，例舉veg啟動(dòng)子、spac啟動(dòng)子、xyl啟動(dòng)子等。
另外，在本發(fā)明的微生物中提高活性的氧化磷酸戊糖途徑的酶，只要不損害它們各自酶活性，可以是含有在序列號(hào)48或50的序列中1個(gè)或多個(gè)位置上的1個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失、插入或添加的酶蛋白。此處，所說“多個(gè)”，是指對(duì)于氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的立體構(gòu)型，根據(jù)位置、種類不同，具體而言，2～30個(gè)，優(yōu)選2～20個(gè)，更優(yōu)選2～10個(gè)。
上述的氧化磷酸戊糖途徑的酶蛋白的突變，是維持酶活性的保留突變。所述置換，是氨基酸序列中至少1個(gè)殘基被除去，在該處插入其他的殘基的變化。置換酶蛋白本來的氨基酸，并且，作為被認(rèn)為是保留置換的氨基酸，例如從ala向ser或thr的置換、從arg向gln、his或lys的置換、從asn向glu、gln、lys、his或asp的置換、從asp向asn、glu或gln的置換、從cys向ser或ala的置換、從gln向asn、glu、lys、his、asp或者arg的置換、從glu向gly、asn、gln、lys或asp的置換、從gly向pro的置換、從his向asn、lys、gln、arg或tyr的置換、從ile向leu、met、val或phe的置換、從leu向ile、met、val或phe的置換、從lys向asn、glu、gln、his或arg的置換、從met向ile、leu、val或phe的置換、從phe向trp、tyr、met、ile或leu的置換、從ser向thr或ala的置換、從thr向ser或ala的置換、從trp向phe或tyr的置換、從tyr向his、phe或trp的置換、以及從val向met、ile或leu的置換。
編碼與上述的氧化磷酸戊糖途徑的酶蛋白基本相同的蛋白質(zhì)的DNA，例如通過點(diǎn)突變法，特定位置上含有置換、缺失、插入、付加或倒位的氨基酸殘基，能通過改變編碼這樣的酶的堿基序列得到。此外，如上述的被改變的DNA，通過以前已知的突變處理而得到。作為突變處理，用羥胺等體外處理突變處理前的DNA的方法，以及將保持突變處理前的DNA的微生物，例舉，大腸桿菌屬細(xì)菌通過紫外線照射或N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸等用于常規(guī)突變處理的突變劑處理的方法。
將具有上述的突變的DNA用合適的細(xì)胞表達(dá)，根據(jù)研究表達(dá)產(chǎn)物的活性，能得到編碼與氧化磷酸戊糖途徑的酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA。此外，從有突變的編碼氧化磷酸戊糖途徑的酶的DNA或保持其的細(xì)胞，與例如序列表的序列號(hào)47，或者49中所示的堿基序列或者具有其一部分的探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且，能得到編碼具有氧化磷酸戊糖途徑的酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。此處所述“嚴(yán)格的條件”，是指形成所謂特異的雜交體，而不形成非特異的雜交體的條件。將該條件明確地?cái)?shù)值化是困難的，舉一個(gè)例子，同源性高的DNA之間，例如具有50％或50％以上，優(yōu)選70％或70％以上，更優(yōu)選80％或80％以上，特別優(yōu)選90％或90％以上，最優(yōu)選95％或95％以上的同源性的DNA之間雜交，比其同源性低的DNA之間不雜交的條件，或者常規(guī)的Southern雜交的洗滌條件例如為60℃，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC、0.1％SDS相當(dāng)?shù)柠}濃度的雜交條件。
作為探針，可以使用序列號(hào)47、49的堿基序列的一部分的序列。該探針，能將根據(jù)序列號(hào)47、49的堿基序列制成的寡核苷酸作為引物，以含有序列號(hào)47、49的堿基序列的DNA片段為模板通過PCR制備。作為探針，在使用300bp長(zhǎng)的DNA片段的情況下，雜交洗滌條件例如為50℃、2×SSC、0.1％SDS。
作為編碼與氧化磷酸戊糖途徑的酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA，具體而言，例如與序列號(hào)48、50中所示的氨基酸序列，具有優(yōu)選50％或50％以上，更優(yōu)選70％或70％以上，更優(yōu)選80％或80％以上，特別優(yōu)選90％或90％以上，最優(yōu)選95％或95％以上的同源性，并且編碼具有氧化磷酸戊糖途徑的酶產(chǎn)物活性的蛋白質(zhì)的DNA。
<2>嘌呤類物質(zhì)的制備方法本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，有效地產(chǎn)生嘌呤類物質(zhì)。因此，通過將本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能使嘌呤核苷和嘌呤核苷酸等的嘌呤類物質(zhì)在培養(yǎng)基中生成蓄積。
作為本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基，能通過使用含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類、其他必要的氨基酸、維生素等有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)素的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的常規(guī)方法進(jìn)行。能使用合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基中的任一種。在培養(yǎng)基中使用的碳源及氮源，只要是能利用的培養(yǎng)的菌株即可。
作為碳源，可以使用葡萄、果糖，蔗糖，麥芽糖，甘露糖，半乳糖，阿拉伯糖，木糖，海藻糖，核糖，淀粉水解物，糖蜜等糖類，甘油、甘露糖醇等醇類，此外，也能單獨(dú)使用葡萄糖酸、乙酸、檸檬酸，馬來酸，富馬酸，琥珀酸等有機(jī)酸等單獨(dú)或與其他碳源聯(lián)合使用。
作為氮源，可以使用氨，硫酸銨，碳酸銨，氯化銨，磷酸銨，乙酸銨等銨鹽，硝酸鹽或大豆水解物等的有機(jī)氮等。
作為有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)素，可以使用氨基酸，維生素，脂肪酸，核酸，并且含有這些物質(zhì)的胨，酪蛋白水解物，酵母提取物，大豆蛋白分解物等，使用有在生長(zhǎng)發(fā)育中需要的氨基酸、核苷酸等的營(yíng)養(yǎng)要求性的突變株的情況下，有必要輔加需要的營(yíng)養(yǎng)素。
作為無機(jī)鹽類，可以使用磷酸鹽，鎂鹽，鈣鹽，鐵鹽，錳鹽等。
培養(yǎng)條件根據(jù)使用的芽孢桿菌屬細(xì)菌的種類，例如是枯草芽孢桿菌時(shí)，發(fā)酵溫度20～50℃，將pH調(diào)節(jié)至4～9同時(shí)進(jìn)行通氣培養(yǎng)。在培養(yǎng)中pH低下的情況下，用氨氣等堿中和。通過如此培養(yǎng)40小時(shí)～3日，在培養(yǎng)液中蓄積嘌呤核苷。
培養(yǎng)完成后，作為采取培養(yǎng)液中蓄積的肌苷等嘌呤類物質(zhì)的方法，可以根據(jù)已知的方法進(jìn)行。例如，可以根據(jù)沉淀法或離子交換色譜等分離。
進(jìn)一步，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的方法制備的肌苷或鳥苷，通過使嘌呤核苷磷酸化酶以及磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶起作用，得到5’-肌苷酸或5’-鳥苷酸。
此外，對(duì)于使用本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的嘌呤核苷，通過選自多磷酸，苯磷酸，氨基甲酰磷酸的磷酸供給體和具有生成核苷-5’-磷酸酯能力的微生物、酸性磷酸酶的作用，可能產(chǎn)生嘌呤核苷酸(核苷-5’-磷酸酯)。具有生成核苷-5’-磷酸酯的能力的微生物，不特別限于具有嘌呤核苷轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账岬哪芰?，例如，例舉國(guó)際公開小冊(cè)子WO9637603號(hào)中記載的微生物。此外，可以使用特開平07-231793中公開的Escherichia blattae JCM 1650，Serratiaficaria ATCC 33105，Klebsiella planticola IFO 14939(ATCC 33531)，Klebsiellapneumoniae IFO 3318(ATCC 8724)，Klebsiella terrigena IFO 14941(ATCC33257)，Morganella morganii IFO 3168，Enterobacter aerogenes IFO 12010，Enterobacter aerogenes IFO 13534(ATCC 13048)，Chromobacterium fluviatileIAM 13652，Chromobacterium violaceum IFO 12614，Cedecea lapagei JCM1684，Cedecea davisiae JCM 1685，Cedecea neteri JCM 5909等。
作為酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)，例如，可以使用特開2002-000289、US6010851、US6015697、WO01/18184中公開的，更優(yōu)選對(duì)核苷親和性提高的酸性磷酸酶(參考特開平10-201481)、核苷酸酶活性低下的突變型酸性磷酸酶(參考WO9637603)，磷酸酯水解活性低下的突變型酸性磷酸酶(US6010851)等。
實(shí)施例以下，根據(jù)實(shí)施例更進(jìn)一步地具體說明本發(fā)明。
實(shí)施例1<嘌呤核苷磷酸化酶缺失株的構(gòu)建和培養(yǎng)評(píng)價(jià)>
(1)嘌呤核苷磷酸化酶(pupG)缺失株的構(gòu)建來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，在缺失嘌呤操縱子阻遏物基因(purR)、琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)的重組體KMBS16(特開2004-242610號(hào))中，導(dǎo)入pupG基因缺失的菌株，根據(jù)以下進(jìn)行制備。
(i)pupG的5′端區(qū)域的克隆根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備了具有以下堿基序列各20mer，29mer的PCR使用的引物。
ATTGCACGGCCGTTCGTCGG(序列號(hào)1)cgcagatctCCGGATTTTCGATTTCGTCC(小寫字母的堿基表示含有BglII位點(diǎn)的尾端(タグ)，序列號(hào)2)將枯草芽孢桿菌168Marburg株的染色體DNA作為模板，使用上述引物PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR System Model 9600(パ一キンエルマ一社制))進(jìn)行，得到含有pupG基因翻譯起始密碼子上游的約610bp和其下游約120bp的擴(kuò)增片段。
PCR擴(kuò)增片段，使用Perfectly Blunt Cloning Kit(NOVAGEN)通過苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀進(jìn)行純化，在付屬的pT7Blue質(zhì)粒中克隆。得到該質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的兩端是EcoRI和HindIII，pupG基因上游區(qū)存在EcoRI端的質(zhì)粒pKM48。
(ii)pupG的3′端區(qū)域的克隆根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession NC_000964)的信息，制備具有以下堿基序列，各20mer，29mer的PCR使用的引物。
CAAAGATCTGTCCAGCCTGG(序列號(hào)3)cgcctgcagTGCCTTTATCTAAAGCTTCC(小寫字母的堿基表示含有PstI位點(diǎn)的尾端，序列號(hào)4)以枯草芽孢桿菌168Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有pupG基因翻譯終止密碼子上游的約340bp和其下游約400bp的擴(kuò)增片段。
與pupG的5′端區(qū)域克隆的情況同樣地，得到在pT7Blue質(zhì)粒中克隆，pupG基因下游區(qū)域存在于EcoRI端的質(zhì)粒pKM49。
(iii)ΔpupG片段的克隆將pKM49用SpeI處理后，通過克列諾片段(Klenow fragment)平滑化后，并且用PstI處理，剪切約740bp的DNA片段。將該片段pKM48用BglII處理，通過克列諾片段(Klenow fragment)平滑化后，使用經(jīng)過PstI處理的質(zhì)粒片段與T4 DNA連接酶連結(jié)，得到pKM75。該質(zhì)粒保持了含有pupG缺失DNA的約1470bp的插入片段，所述pupG缺失DNA為pupG構(gòu)造基因內(nèi)缺失約360bp。
(iv)pupG破壞用質(zhì)粒的構(gòu)建將pKM75用SacI和PstI處理，剪切出插入片段，將該片段使用經(jīng)過該酶處理的染色體重組用載體pJPM1(Mueller et.al.，J.Bacteriol.，1992，174，4361-4373)和T4 DNA連接酶連結(jié)，得到pKM76。
用得到的質(zhì)粒pKM76，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS16株的感受態(tài)細(xì)胞，取得在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB瓊脂板上生長(zhǎng)的菌落(1次重組株)。
將得到的1次重組株在含有氯霉素的10ml LB培養(yǎng)基中接種，在37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)幾天，篩選LB瓊脂培養(yǎng)基上成為氯霉素敏感性的菌落。從得到的氯霉素敏感性菌落提取染色體DNA，使用序列號(hào)5和6的引物，進(jìn)行上述同樣的PCR，鑒定染色體上的pupG基因，通過2次重組而置換為內(nèi)部缺失的pupG基因(ΔpupG)的菌株(purR::spc purA::erm deoD::kan ΔpupG)。這樣得到的2次重組株中的一個(gè)菌株，命名為KMBS93。
GGTCTGAGCTTTGCGAACC(序列號(hào)5)CGCCTGCAGTGCCTTTATCTAAAGCTTCC(序列號(hào)6)(2)在來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，缺失嘌呤操縱子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)的重組體KMBS13(特開2004-242610號(hào)公報(bào))中，導(dǎo)入pupG基因缺失的菌株，如下進(jìn)行制備。
用pKM76，轉(zhuǎn)化根據(jù)Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS13株的感受態(tài)細(xì)胞，取得在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落(1次重組株)。
將得到的1次重組株接種到10ml的LB培養(yǎng)基中，37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)幾天，篩選含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上成為氯霉素敏感性的菌落。從得到的氯霉素敏感性菌落提取染色體DNA，使用序列號(hào)5和6的引物，進(jìn)行上述同樣的PCR，鑒定染色體上的pupG基因，通過2次重組而置換為內(nèi)部缺失的pupG基因(ΔpupG)的菌株(purR::spc purA::erm ΔpupG)。這樣得到的2次重組株中的一個(gè)菌株，命名為KMBS113。
(3)pupG基因缺失株的嘌呤核苷的產(chǎn)生將pupG基因缺失株(KMBS93株和KMBS113)以及作為對(duì)照株的KMBS16，在PS培養(yǎng)基平板(可溶性淀粉(Soluble starch)30g/L，酵母菌提取物(Yeast extract)5g/L，多蛋白胨(Polypeptone)5g/L，瓊脂(Agar)20g/L，用KOH調(diào)至pH 7.0)上毫無遺漏地涂布，34℃過夜培養(yǎng)。將1/8平板部分的菌體，接種到500ml容量的坂口燒瓶中的20ml發(fā)酵培養(yǎng)基，然后，將碳酸鈣加至50g/L，在34℃振搖培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始后100小時(shí)取樣，用已知的方法測(cè)定培養(yǎng)液中含有的肌苷以及次黃嘌呤量。對(duì)于對(duì)照株KMBS16株，培養(yǎng)液中多量的次黃嘌呤被檢測(cè)出來，但作為pupG基因缺失株的KMBS93株和KMBS113的次黃嘌呤的蓄積量，是非常低的，不能作為HPLC峰明確檢出(表1)。此外，KMBS93株和KMBS113的肌苷的蓄積，比對(duì)照株的KMBS16株的高。
葡萄糖80g/LKH2PO41g/LNH4Cl 32g/L大豆提取物(豆?jié)?T-N))*1.35g/LDL-蛋氨酸 0.3g/LL-色氨酸 0.02g/L腺嘌呤0.1g/LMgSO40.4g/LFeSO40.01g/LMnSO40.01g/L
GD1130.01ml/L(用KOH調(diào)至pH 7.0)碳酸鈣 50g/L*蛋白水解物表1

*1在使用的HPLC的條件下，不能明確地檢出峰。
實(shí)施例2(1)突變型guaB基因的導(dǎo)入在來源于上述的枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，缺失嘌呤操縱子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)的重組體KMBS1113中，導(dǎo)入IMP脫氫酶基因guaB中的guaB(A1)突變的菌株，如下進(jìn)行制備。另外，所說的guaB(A1)突變菌株是指，在序列號(hào)62的第226位置上的丙氨酸被纈氨酸置換了滲漏突變體(降低IMP脫氫酶活性的變異)。
(i)在來源于B.subtilis 168 Marburg的野生菌株的guaB基因中間插入卡那霉素抗性基因的菌株的制備guaB基因上游區(qū)的擴(kuò)增，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(data bank)(GenBank AccessionNC_000964及V01547)的信息，用具有以下的堿基序列的各34mer，50mer的PCR所用的引物制備。
cgcggatccGGCTTAACGTTCGACGATGTGCTGC(小寫字母的堿基是含BamHI位點(diǎn)的尾端(tag)-序列號(hào)7)gctttgcccattctatagatatattGAGTCATTGTATCGCCAGTTACACC(小寫字母堿基是在pDG783(BGSC)上克隆的卡那霉素抗性基因(kan)的啟動(dòng)子上游區(qū)的序列，序列號(hào)8)
以枯草芽孢桿菌168Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到guaB基因5′端區(qū)的擴(kuò)增片段(約710bp)。
在guaB基因3′端區(qū)的擴(kuò)增中，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank AccessionNC_000964和V01547)的信息，用具有以下的堿基序列的各50mer，34mer的PCR所用的引物制備。cctagatttagatgtctaaaaagctGTGATTGTTATCGATACAGCTCACG(序列號(hào)9；小寫字母的堿基是在pDG783(BGSC)上克隆的卡那霉素抗性基因(kan)的結(jié)構(gòu)基因下游區(qū)的序列)cgcgaattcGTAATCTGTACGTCATGCGGATGGC(小寫字母的堿基是含有EcoRI位點(diǎn)的尾端，序列號(hào)10)以枯草芽孢桿菌168Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到guaB基因3′端區(qū)的擴(kuò)增片段(約730bp)。
通過PCR法擴(kuò)增kan基因3′端區(qū)，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank AccessionNo.V01277以及NC_000964)的信息，制作具有以下堿基序列各50mer的PCR用引物。
ggtgtaactggcgatacaatgactcAATATATCTATAGAATGGGCAAAGC(小寫字母的堿基是用guaB上游區(qū)的序列與序列號(hào)8的3’末端區(qū)域互補(bǔ)設(shè)計(jì)，序列號(hào)11)cgtgagctgtatcgataacaatcacAGCTTTTTAGACATCTAAATCTAGG(小寫字母的堿基是用guaB下游區(qū)的序列與序列號(hào)9的3’末端區(qū)域互補(bǔ)設(shè)計(jì)的，序列號(hào)12)裝入卡那霉素抗性基因(kan)的質(zhì)粒，例如以pDG783等的質(zhì)粒DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；GeneAmp PCR System Model 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含kan基因約1150bp的擴(kuò)增片段。
通過插入kan基因的guaB區(qū)域的重組PCR法擴(kuò)增，上述擴(kuò)增的3種DNA片段用MicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)純化后，將適量混合物作為模板，用序列號(hào)7及10，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR System Model 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到插入kan基因的guaB區(qū)域的擴(kuò)增片段。
將得到的插入kan基因的guaB區(qū)域(guaB::kan)的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段從凝膠中提取出來。使用這樣純化的DNA片段，根據(jù)Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，將該株的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，得到在含有2.5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的腺嘌呤的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從該菌落提取染色體DNA，通過用序列號(hào)7及10的PCR法，鑒定染色體上的guaB區(qū)域?yàn)橥ㄟ^2次重組置換內(nèi)部經(jīng)過卡那霉素抗性基因置換的guaB區(qū)域(guaB::kan)的菌株。這樣得到的重組株為需要腺嘌呤菌株，將其中的一個(gè)菌株命名為KMBS193。
(ii)插入來源于枯草芽孢桿菌168Marburg的菌株的guaB突變(A1)的菌株的制備guaB基因5′端區(qū)擴(kuò)增，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession NC_000964)的信息，制備具有以下的堿基序列各25mer，46mer的PCR用引物。
CATAAAATGTACGCATAGGCCATTC(序列號(hào)13)TTGTATCGCCAGTTACACCAACTaCCGCGCCAACGATCAGGCGGCC(小寫字母的堿基表示突變點(diǎn)，序列號(hào)14)以枯草芽孢桿菌168Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到guaB基因5’末端區(qū)域及5′末端區(qū)的擴(kuò)增片段(約1210bp)。
然后擴(kuò)增guaB基因下游區(qū)域。根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank AccessionNC_000964)的信息，制備具有以下堿基序列各46mer，26mer的PCR用引物。
GGCCGCCTGATCGTTGGCGCGGtAGTTGGTGTAACTGGCGATACAA(小寫字母的堿基表示突變點(diǎn)，與序列號(hào)14引物互補(bǔ)，序列號(hào)15)CCTTGATCAATTGCTTCCAATAACAG(序列號(hào)16)以枯草芽孢桿菌168Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到guaB基因3’末端區(qū)域及下游區(qū)的擴(kuò)增片段(約1220bp)。
通過導(dǎo)入guaB突變(A1)的guaB區(qū)域的重組PCR法的擴(kuò)增，將如上述擴(kuò)增的2種DNA片段進(jìn)行瓊脂糖電泳后，純化目的DNA片段。以兩DNA片段適量混合物為模板，用序列號(hào)13及16，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR System Model 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到導(dǎo)入guaB突變(A1)的guaB區(qū)域擴(kuò)增片段。
將得到的導(dǎo)入guaB突變(A1)的guaB區(qū)域(guaB(A1))的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段從凝膠中提取出來。使用這樣純化的DNA片段，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS193的感受態(tài)細(xì)胞，取得最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這些菌落提取染色體DNA，通過用序列號(hào)13及16的PCR法，鑒定染色體上的guaB::kan區(qū)域由2次重組置換為含有g(shù)uaB(A1)突變的guaB區(qū)域的菌株。這樣得到的重組株為鳥嘌呤非需要株，這樣得到的菌株中的一個(gè)菌株，命名為YMBS9。
(iii)肌苷產(chǎn)生菌KMBS113中導(dǎo)入guaB突變(A1)的菌株的制備提取KMBS193(guaB::kan)的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS113株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有2.5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的鳥嘌呤的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。這樣的菌株成為鳥嘌呤滲漏(グアニンリ一き一)需要，這樣的菌株內(nèi)的一個(gè)株命名為YMBS6(purR::spc purA::erm ΔpupGguaB::kan trpC2)。
其次，提取YMBS9(guaB(A1))的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的YMBS6株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有20μg/ml的腺嘌呤的最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。這樣得到的菌株需要鳥嘌呤類(グアニンリ一キ一)，這樣的菌株內(nèi)的一株命名為YMBS2(purR::spc purA::erm guaB(A1)ΔpupG trpC2)。
(2)導(dǎo)入guaB突變的肌苷生產(chǎn)菌株的嘌呤類核酸的產(chǎn)生將導(dǎo)入guaB突變(A1)的肌苷產(chǎn)生菌株(YMBS2株)以及作為對(duì)照株的KMBS113，在PS培養(yǎng)基平板(可溶淀粉30g/L，酵母提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，用KOH調(diào)至pH 7.0)上毫無遺漏地涂布，34℃過夜培養(yǎng)。將1/8平板部分的菌體接種到500ml容量的坂口燒瓶中的20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后，將碳酸鈣加至50g/L，在34℃振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后96小時(shí)取樣，用已知方法測(cè)定培養(yǎng)液中含有的肌苷及次黃嘌呤量。
葡萄糖60g/LKH2PO41g/LNH4Cl 32g/L大豆提取物((T-N))*1.35g/LDL-蛋氨酸 0.3g/LL-色氨酸 0.02g/L腺嘌呤0.1g/LMgSO40.4g/LFeSO40.01g/LMnSO40.01g/LGD113 0.01ml/L(用KOH調(diào)至7.0)碳酸鈣50g/L*蛋白水解物表2

實(shí)施例3<嘌呤操縱子擴(kuò)增株的制備>
(1)<Ppur破壞株的制備>
用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168Marburg株；ATCC6051)，如下進(jìn)行破壞嘌呤操縱子啟動(dòng)子(Ppur)的菌株的制備。
(i)通過PCR法擴(kuò)增Ppur上游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession NC_000964以及V01277)的信息，制備具有以下堿基序列的各34mer，50mer的PCR用引物。
cgcggatccTTATTTAGCGGCCGGCATCAGTACG(序列號(hào)17；小寫字母的堿基是含有BamHI位點(diǎn)的尾端)cgtttgttgaactaatgggtgctttATGGATAATGTCAACGATATTATCG(序列號(hào)18；小寫字母的堿基是在pC194上克隆的氯霉素抗性基因(cat)的啟動(dòng)子上游區(qū)的序列)以B.subtilis 168 Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有Ppur-35序列和上游的約730bp的擴(kuò)增片段。
(ii)通過PCR法擴(kuò)增Ppur下游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession NC_000964以及V01277)的信息，制備含有以下堿基序列各50mer，34mer的PCR用引物。
acagctccagatccatatccttcttCCTCATATAATCTTGGGAATATGGC(序列號(hào)19；小寫字母的堿基是在pC194上克隆的氯霉素抗性基因(cat)的結(jié)構(gòu)基因下游區(qū)的序列)cgcggatccTCTCTCATCCAGCTTACGGGCAAGG(序列號(hào)20；小寫字母的堿基是含有BamHI位點(diǎn)的尾端)以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有purE基因翻譯啟始密碼子上游的約230bp和其下游約440bp的擴(kuò)增片段。
(iii)通過PCR法擴(kuò)增cat基因根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.V01277以及NC_000964)的信息，制備含有以下堿基序列各50mer的PCR用引物。
cgataatatcgttgacattatccatAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(序列號(hào)21；小寫字母的堿基是用Ppur上游區(qū)的序列與序列號(hào)18的3’末端區(qū)域互補(bǔ)設(shè)計(jì))gccatattcccaagattatatgaggAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(序列號(hào)22；小寫字母的堿基是用purE基因翻譯起始密碼子上游區(qū)的序列與序列號(hào)19的3’末端區(qū)域互補(bǔ)設(shè)計(jì)的)裝入氯霉素抗性基因(cat)的質(zhì)粒，例如以pC194等的質(zhì)粒DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene AmpPCR System Model 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有cat基因的約980bp的擴(kuò)增片段。
(iv)通過重組PCR法擴(kuò)增插入cat基因的Ppur區(qū)域(i)～(iii)擴(kuò)增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)純化后，將適量混合物作為模板，使用序列號(hào)17及20，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到插入cat基因的Ppur區(qū)域的擴(kuò)增片段。
(v)破壞的Ppur的菌株的制備將(iv)中得到的插入cat基因的Ppur區(qū)域(Ppur::cat)的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段從凝膠中提取出來。用這樣純化的DNA片段，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的B.subtilis標(biāo)準(zhǔn)株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這樣的菌落提取染色體DNA，通過(iv)中顯示的PCR法鑒定了菌株，菌株染色體上的Ppur區(qū)域，經(jīng)過2次重組置換為在內(nèi)部由氯霉素抗性基因插入的Ppur區(qū)域(Ppur::cat)。這樣得到的重組株為腺嘌呤需要株，其中的一種菌株命名為KMBS198。
(2)<嘌呤操縱子啟動(dòng)子突變株的制備>
用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，如下進(jìn)行將Ppur的-10序列轉(zhuǎn)變?yōu)楣灿行蛄蠺ATAAT(Ppur1)，或TATGAT(Ppur3)、TAAAAT(Ppur5)的菌株的制備。
(i)通過PCR法擴(kuò)增含有-10序列改變的Ppur上游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備含有以下的堿基序列的序列號(hào)42表示的25mer的PCR用引物、含有3種改變型Ppur序列、38mer的改變用引物。
AATAGATATAAAGAGGTGAGTCTGC(序列號(hào)42)<Ppur1改變用>
TTTTGATTTCATGTTTattataACAACGGACATGGATA(序列號(hào)23；小寫字母的堿基表示Ppur1序列)<Ppur3改變用>
TTTTGATTTCATGTTTatcataACAACGGACATGGATA(序列號(hào)24；小寫字母的堿基表示Ppur3序列)<Ppur5改變用>
TTTTGATTTCATGTTTattttaACAACGGACATGGATA(序列號(hào)25；小寫字母的堿基表示Ppur5序列)以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有Ppur和其上游序列(約1060bp)的擴(kuò)增片段。
(ii)通過PCR法擴(kuò)增含有-10序列改變的Ppur下游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備含有以下堿基序列的序列號(hào)26表示的25mer的PCR用引物，含有3種改變型Ppur序列的、38mer的改變用引物。
GGGTAATAAGCAGCAGCTCACTTCC(序列號(hào)26)<Ppur1改變用>
TATCCATGTCCGTTGTtataatAAACATGAAATCAAAA(序列號(hào)27；小寫字母的堿基表示Ppur1序列，與序列號(hào)23表示的引物互補(bǔ))<Ppur3改變用>
TATCCATGTCCGTTGTtatgatAAACATGAAATCAAAA(序列號(hào)28；小寫字母的堿基表示Ppur3序列，與序列號(hào)24表示的引物互補(bǔ))<Ppur5改變用>
TATCCATGTCCGTTGTtaaaatAAACATGAAATCAAAA(序列號(hào)29；小寫字母的堿基表示Ppur5序列，與序列號(hào)25表示的引物互補(bǔ))以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有Ppur-10序列和其下游序列(約1070bp)的擴(kuò)增片段。
(iii)通過PCR法擴(kuò)增含有-10序列改變的Ppur區(qū)域(i)和(ii)中擴(kuò)增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)純化后，以適量混合物為模板，用序列號(hào)42及26，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到-10序列改變?yōu)镻pur1，Ppur3，或Ppur5的Ppur區(qū)域的擴(kuò)增片段。
(iv)-10序列改變?yōu)镻pur1，Ppur3，或Ppur5的菌株的制備將(iii)中得到的含有-10序列改變的Ppur區(qū)域(Ppur1，Ppur3，或Ppur5)的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段從凝膠中提取出來。用這樣純化的DNA片段，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS198株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這樣的菌落染色體提取DNA，通過(iii)中顯示的PCR法，鑒定染色體上的Ppur::cat區(qū)域，由2次重組置換為Ppur1，Ppur3，或Ppur5的菌株。這樣得到的重組株為腺嘌呤非需要株，其中的一個(gè)菌株各命名為KMBS210，KMBS211，KMBS222。
(3)嘌呤操縱子的弱化子序列缺失株的制備用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，如下進(jìn)行缺失位于Ppur下游的弱化子序列的菌株的制備。圖1表示缺失的序列。
(i)通過PCR法擴(kuò)增部分缺失的弱化子序列及其上游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備序列號(hào)17表示的PCR用引物和含有以下堿基序列的序列號(hào)30表示的52mer的引物。
GCTTTTGTTTTCAGAAAATAAAAAATAcgATATATCCATGTCAGTTTTATCG(序列號(hào)30；小寫字母的堿基是通過弱化子序列的部分序列(75bp)缺失而新制成的連接(ジヤンクシヨン))以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；53℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有部分缺失的弱化子序列和其上游序列(約840bp)的擴(kuò)增片段。
(ii)通過PCR法擴(kuò)增部分缺失的弱化子序列及其下游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備序列號(hào)26表示的PCR用引物和含有以下堿基序列的序列號(hào)31表示的52mer引物。
CGATAAAACTGACATGGATATATcgTATTTTTTATTTTCTGAAAACAAAAGC(序列號(hào)31；小寫字母的堿基是通過弱化子序列的部分序列(75bp)的缺失而新形成的連接，這樣的引物與序列號(hào)30表示的引物互補(bǔ))以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物用進(jìn)行PCR(94℃，30秒；53℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有部分缺失的弱化子序列及其下游序列(約850bp)的擴(kuò)增片段。
(iii)通過PCR法擴(kuò)增含有弱化子序列部分缺失的Ppur區(qū)域(i)和(ii)中擴(kuò)增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)純化后，以適量混合物為模板，用序列號(hào)17及26，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；53℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有弱化子序列部分缺失的Ppur區(qū)域的擴(kuò)增片段。
(iv)弱化子序列部分缺失的菌株的制備將(iii)中得到的含有弱化子序列部分缺失的Ppur區(qū)域(Ppur-Δatt)的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，從凝膠中提取目的片段。用這樣純化的DNA片段，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS198株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這樣的菌落中提取染色體DNA，通過(iii)表示的PCR法，鑒定染色體上的Ppur::cat區(qū)域由2次重組置換為Ppur-Δatt的菌株。這樣得到的重組株為腺嘌呤非需要株，其中的一個(gè)菌株被命名為KMBS252。
(4)用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，將Ppur的-10序列改變?yōu)楣灿行蛄蠺ATAAT(Ppur1)，而且部分缺失弱化子序列的菌株，如下制備。
(i)通過PCR法擴(kuò)增含有-10序列改變(Ppur1)的Ppur上游區(qū)以(3)中制備的部分缺失弱化子序列的菌株，例如KMBS252的染色體DNA為模板，使用根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息制備的序列號(hào)42和序列號(hào)23表示的引物，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR System Model 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有Ppur1的Ppur上游區(qū)的擴(kuò)增片段(約1060bp)。
(ii)通過PCR法擴(kuò)增Ppur1及部分缺失的弱化子區(qū)域及其下游區(qū)以(3)中制備的部分缺失弱化子序列的菌株，例如KMBS252的染色體DNA為模板，使用根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息制備的序列號(hào)26及序列號(hào)27表示的引物，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR System Model 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到Ppur1及部分缺失的弱化子序列及其下游區(qū)的擴(kuò)增片段(約990bp)。
(iii)通過PCR法擴(kuò)增Ppur1及含部分缺失弱化子序列的Ppur區(qū)域?qū)?i)及(ii)中擴(kuò)增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)純化后，以適量混合物為模板，使用序列號(hào)42及26，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，2分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到Ppur1及含有弱化子序列部分缺失的Ppur區(qū)域的擴(kuò)增片段。
(iv)制備-10序列改變?yōu)镻pur1，并且部分缺失弱化子序列的菌株將(iii)中得到的Ppur1及含有部分缺失弱化子序列的Ppur區(qū)域(Ppur1-Δatt)的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段從凝膠中提取出來。用這樣純化的DNA片段，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS198株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這些菌落提取染色體DNA，通過(iii)顯示的PCR法，鑒定染色體上的Ppur::cat區(qū)域通過2次重組置換為Ppur1-Δatt的菌株。這樣得到的重組株為不需要腺嘌呤菌株，其中的一株命名為KMBS261。
(5)構(gòu)建嘌呤操縱子轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定用質(zhì)粒根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備具有以下堿基序列各29mer的PCR用引物。
cgcaagcttTATTTTCTGAAAACAAAAGC(序列號(hào)32；小寫字母的堿基為含有HindIII位點(diǎn)的尾端)cgcggatccTTTCTCTTCTCTCATCCAGC(序列號(hào)33；小寫字母的堿基為含有BamHI位點(diǎn)的尾端)以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有purE結(jié)構(gòu)基因的一部分(445bp)，及其上游的SD序列的區(qū)域(40bp)的擴(kuò)增片段。
將PCR擴(kuò)增片段，通過MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)純化，用HindIII和BamHI限制處理。用純化的DNA片段，與該酶處理的pMutin4(Vagner，V.，et.al.，Microbiology，1998，144，3097-3104)的lacZ的上游，用T4 DNA連接酶連結(jié)，得到pKM191。pKM191含有purE結(jié)構(gòu)基因(445bp)的一部分，而它的上游區(qū)(40bp)包含SD序列。
(6)制備嘌呤操縱子轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定用菌株嘌呤操縱子轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定用菌株的構(gòu)建如下進(jìn)行。
(i)導(dǎo)入Ppur破壞的菌株的制備提取KMBS198(Ppur::cat)的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的帶有purR缺失(purR::spc)的KMBS4株(特開2004-242610)，得到在含有2.5μg/ml的氯霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。這樣得到的重組株缺失purR，而且為腺嘌呤需要株，將其中的一株命名KMBS278。
(ii)具有purR缺失及改變型Ppur區(qū)域的菌株的制備提取KMBS210，KMBS211，KMBS222，KMBS252，KMBS261株染色體的DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS278株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)，而且在LB瓊脂平板上大觀霉素抗性的菌落。從這些菌落提取染色體DNA，通過(1)(iv)中所示的PCR法，鑒定染色體上的Ppur::cat通過2次重組置換為改變型Ppur區(qū)域的菌株。其中的一株各命名為KMBS283，KMBS284，KMBS285，KMBS286，KMBS287。
(iii)導(dǎo)入pKM191的菌株的制備使用嘌呤操縱子轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定用質(zhì)粒pKM191，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的B.subtilis168 Marburg株，KMBS4、KMBS283、KMBS284、KMBS285、KMBS286、KMBS287的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有2.5μg/ml氯霉素LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。這樣得到的菌落，是含有pKM191的lacZ的purE基因被置換為野生型purE基因的1次重組株，lacZ通過Ppur來表達(dá)，成為含有80μg/ml的X-Gal的LB瓊脂平板上的藍(lán)色菌落。其中的一株各命名為KMBS292，KMBS295，KMBS296，KMBS297，KMBS298，KMBS299，KMBS300。
(7)嘌呤操縱子轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定用(6)(iii)中制備的菌株，通過lacZ進(jìn)行Ppur轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定。即，對(duì)照株，是具有168 Marburg株的背景(バツクグランド)KMBS292，或具有嘌呤操縱子阻遏物PurR基因缺失背景的KMBS295。其他的菌株，為purR缺失的背景下，改變-10序列的菌株(KMBS296，KMBS297，KMBS298)、弱化子序列部分缺失的菌株(KMBS299)、同時(shí)導(dǎo)入-10序列的共有序列化(Ppur1)與弱化子序列部分缺失的菌株(KMBS300)。
將這些6株在含有鳥嘌呤(20mg/L)的LB培養(yǎng)基(20ml)中，37℃下培養(yǎng)至指數(shù)增長(zhǎng)后期(OD600＝1.1-1.4)，取樣適量培養(yǎng)液，進(jìn)行β-半乳糖甘酶活性測(cè)定。β-半乳糖甘酶活性測(cè)定，根據(jù)Fouet等(Fouet，A.and Sonenshein，A.L.J.Bacteriol.，1990，172，835-844)的方法進(jìn)行。結(jié)果在圖2中表示。與168M株相比，ΔpurR株的活性增加約4.5倍。并且，由于-10序列改變成為Ppur1，增加約3倍。此外，通過弱化子序列的部分缺失，活性達(dá)到約15倍，有兩方面的變異的菌株，活性增加至26.5倍。
實(shí)施例4<改變型Ppur區(qū)域?qū)胫甑臉?gòu)建和評(píng)價(jià)>
(1)用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操縱子阻遏物基因(purR)、琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)，使用在IMP脫氫酶基因(guaB)中導(dǎo)入鳥嘌呤類(リ一キ一)需要突變guaB(A1)的重組體YMBS2，如下進(jìn)行改變嘌呤操縱子引物并且部分缺失弱化子序列的菌株的制備。
提取枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA，使用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS113株(purR::spc purA::erm ΔpupG trpC2)的感受態(tài)細(xì)胞，得到在最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)(即腺嘌呤非需要)，并且為L(zhǎng)B瓊脂平板上大觀霉素抗性的菌落。從這些菌落提取染色體DNA，通過實(shí)施例1(1)(iv)中所示的PCR法，鑒定ΔpupG的菌株。其中的一株被命名為KMBS180(purR::spc ΔpupGtrpC2)。
接著，提取KMBS198株的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS180株的感受態(tài)細(xì)胞，取得在含2.5μg/ml的氯霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這些菌落提取染色體DNA，通過實(shí)施例3(1)(iv)中所示的PCR法，鑒定染色體上的Ppur區(qū)域通過2次重組置換為Ppur::cat的菌株。這樣的菌株需要腺嘌呤，其中的一株被命名為KMBS216(Ppur::cat purR::spc ΔpupG trpC2)。
接著，提取KMBS252(Ppur-Δatt)的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS216株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。從這些菌落提取染色體DNA，通過實(shí)施例3(1)(iv)中所示的PCR法，鑒定染色體上的Ppur::cat通過2次重組置換為Ppur-Δatt區(qū)域的菌株。這樣的菌株為腺嘌呤非需要，其中的一株被命名為KMBS264(Ppur-Δatt purR::spc ΔpupG trpC2)。對(duì)于導(dǎo)入Ppur1-Δatt的菌株KMBS261，也依照同樣的程序得到。
接著，提取KMBS9(purA::erm trpC2；特開2004-242610號(hào))的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS264株或KMBS261株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有0.5μg/ml的紅霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。這樣的菌株為腺嘌呤非需要，其中的一株被命名為KMBS265(Ppur-Δatt purR::spc purA::erm ΔpupGtrpC2)和KMBS267(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm ΔpupG trpC2)。
接著，提取KMBS193(guaB::kan)的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS265株或KMBS267株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有2.5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的鳥嘌呤的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。這樣的菌株為鳥嘌呤需要，其中的一株被命名為KMBS270(Ppur-Δatt purR::spc purA::erm guaB::kanΔpupG trpC2)和KMBS271(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm guaB::kan ΔpupGtrpC2)。
最后，提取YMBS2(guaB(A1))的染色體DNA，用其轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS270株或KMBS271株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有20μg/ml的腺嘌呤的最小培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。這樣的菌株需要鳥嘌呤類，其中的一株被命名為KMBS279(Ppur-Δatt purR::spc purA::erm guaB(A1)ΔpupG trpC2)和KMBS280(Ppur1-Δatt purR::spc purA::erm guaB(A1)ΔpupG trpC2)。
(2)具有改變型Ppur區(qū)域的菌株的嘌呤核苷產(chǎn)生的確認(rèn)將具有改變型Ppur區(qū)域的菌株(KMBS279株和KMBS280)以及對(duì)照株的YMBS2，在PS培養(yǎng)基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，用KOH調(diào)至pH 7.0)上毫無遺漏地涂布，34℃過夜培養(yǎng)。將1/8平板部分的菌體接種在500ml容量的坂口燒瓶中的20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后，將碳酸鈣加至50g/L，34℃振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后96小時(shí)取樣，用已知的方法測(cè)定培養(yǎng)液中含有的肌苷和次黃嘌呤的量。
葡萄糖60g/LKH2PO41g/LNH4Cl 32g/L大豆提取物((T-N))*1.35g/LDL-蛋氨酸 0.3g/LL-色氨酸 0.02g/L腺嘌呤0.1g/L鳥嘌呤0.05g/LMgSO40.4g/LFeSO40.01g/LMnSO40.01g/LGD113 0.01ml/L(用KOH調(diào)至pH 7.0)碳酸鈣50g/L*蛋白水解物表3

實(shí)施例5<PRPP合成酶活性增強(qiáng)株的制備>
(1)用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操縱子阻遏物基因(purR)、琥珀酰-AMP合成基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)，并且在IMP脫氫酶基因(guaB)中導(dǎo)入guaB突變(A1)，并且使用改變了嘌呤操縱子啟動(dòng)子區(qū)域的重組體KMBS280，制備改變PRPP合成酶基因(prs)的SD序列的菌株，如下進(jìn)行。
(i)通過PCR法擴(kuò)增含有SD序列改變的SD序列上游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備含有以下的堿基序列的序列號(hào)34中所示的34mer的PCR用引物，含有3種的改變型Ppur序列，46mer的改變用引物。
cgcggatccAACATACACAAAGAGAAGCGAAAGC(小寫字母的堿基為含有BamHI位點(diǎn)的尾端的序列號(hào)34)<SD1改變用>
GATTAGACATGGATAAA TTTAGGATTATTTTTTATGAA(小寫字母的堿基為突變點(diǎn)，框內(nèi)序列表示改變的SD序列1的序列號(hào)35)<SD2改變用>
GATTAGACATGGATAAA TTTAGGATTATTTTTTATGAA(小寫字母的堿基為突變點(diǎn)，框內(nèi)序列表示改變的SD序列2的序列號(hào)36)<SD3改變用>
GATTAGACATGGATAAA TTTAGGATTATTTTTTATGAA(小寫字母的堿基為突變點(diǎn)，框內(nèi)序列表示改變的SD序列3的序列號(hào)37)以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1.5分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有prs起始密碼子上游序列(約1040bp)和下游序列(10bp)的擴(kuò)增片段。
(ii)通過PCR法擴(kuò)增含有SD序列改變的SD序列下游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964)的信息，制備含有以下的堿基序列的序列號(hào)38中所示的34mer的PCR用引物，含有3種的改變型SD序列的46mer的改變用引物。
cgcggatccGGTTTAGCTGAACAGATAGCTGACTGATTGC(小寫字母的堿基為含有BamHI位點(diǎn)的尾端的序列號(hào)38)<SD1改變用>
TTCATAAAAAATAATCCTAAA TTTATCCATGTCTAATC(小寫字母的堿基為突變點(diǎn)，框內(nèi)序列表示改變的SD序列1，該引物是與序列號(hào)35互補(bǔ)的序列號(hào)為39)<SD2改變用>
TTCATAAAAAATAATCCTAAA TTTATCCATGTCTAATC(小寫字母的堿基為突變點(diǎn)，框內(nèi)序列表示改變SD序列2，該引物是與序列號(hào)36互補(bǔ)的序列號(hào)為40)<SD3改變用>
TTCATAAAAAATAATCCTAAA TTTATCCATGTCTAATC(小寫字母的堿基為突變點(diǎn)，框內(nèi)序列表示改變SD序列3，該引物是與序列號(hào)37互補(bǔ)的序列號(hào)為41)以B.subtilis 168 Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1.5分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有prs起始密碼子上游序列(36bp)和下游序列(約960bp)的擴(kuò)增片段。
(iii)通過PCR法擴(kuò)增含有改變型SD序列區(qū)域?qū)?i)及(ii)擴(kuò)增的DNA片段用MicroSpin Column S-400(AmershamPharmacia Biotech)純化后，以適量的混合物為模板，用序列號(hào)34及38，進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2.5分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到SD序列改變?yōu)镾D序列1、2或3(SD1，SD2，SD3)的DNA的擴(kuò)增片段。
(iv)含有改變型SD序列的區(qū)域的克隆將含有改變型SD序列(SD1，SD2，SD3)的區(qū)域的DNA片段純化，將用BamHI處理的DNA片段，用該酶處理，與通過牛小腸磷酸酶而脫磷酸化的染色體重組用的載體pJPM1(Mueller et.al.，J.Bacteriol.，1992，174，4361-4373)用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，得到pKM196(SD1)、pKM197(SD2)、pKM198(SD3)。
(v)導(dǎo)入改變型SD序列的肌苷產(chǎn)生菌株的制備用得到的質(zhì)粒pKM196(SD1)、pKM197(SD2)或pKM198(SD3)，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的KMBS280株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有2.5μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落(1次重組)。
將得到的1次重組株接種到10mlLB培養(yǎng)基中，37℃進(jìn)行傳代培養(yǎng)幾天，篩選LB瓊脂培養(yǎng)基上氯霉素敏感性的菌落。提取得到的氯霉素敏感性菌落的染色體DNA，用序列號(hào)34和38的引物進(jìn)行上述同樣的PCR，通過解析DNA序列，鑒定染色體上的prs基因的SD序列，通過2次重組置換為改變型SD序列的菌株。這樣得到的2次重組株內(nèi)的一株被命名為KMBS310(SD1)，KMBS318(SD2)，KMBS322(SD3)。
(2)導(dǎo)入改變型SD序列的肌苷產(chǎn)生菌株的嘌呤核苷的產(chǎn)生將導(dǎo)入了改變型SD序列SD1、SD2或SD3的肌苷產(chǎn)生菌株(KMBS310株、KMBS318株和KMBS322株)以及對(duì)照株KMBS280，在PS培養(yǎng)基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，用KOH調(diào)至pH 7.0)上毫無遺漏地涂布，34℃下過夜培養(yǎng)。將1/8平板部分的菌體，接種到500ml容量的坂口燒瓶中的20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后，將碳酸鈣加至50g/L，34℃下振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后120小時(shí)取樣，用已知方法測(cè)定培養(yǎng)液中含有的肌苷及次黃嘌呤量。
葡萄糖60g/LKH2PO41g/LNH4Cl 32g/L大豆提取物((T-N))*1.35g/LDL-蛋氨酸 0.3g/LL-色氨酸 0.02g/L腺嘌呤0.1g/L鳥苷 0.075g/LMgSO40.4g/LFeSO40.01g/LMnSO40.01g/LGD113 0.01ml/L
(用KOH調(diào)至pH 7.0)碳酸鈣50g/L*蛋白水解物表4

實(shí)施例6氧化的磷酸戊糖途徑酶活性提高的菌株的構(gòu)建(1)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性提高株的構(gòu)建用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操縱子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG和deoD)，而且在IMP脫氫酶基因(guaB)中導(dǎo)入guaB突變(A1)，而且用改變嘌呤操縱子啟動(dòng)子區(qū)域及PRPP合成酶基因(prs)的SD序列的重組體，導(dǎo)入裝入編碼氧化磷酸戊糖途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因zwf的質(zhì)粒菌株的制備，如下進(jìn)行。
(i)通過PCR擴(kuò)增zwf結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964 CAB14317.glucose-6-phospha...[gi2634820])的信息，制備含有以下堿基序列各29mer的PCR用引物。
cgcggatccGCCTCTGAAAAGAACAATCC(序列號(hào)43；小寫字母的堿基為含有BamHI位點(diǎn)的尾端)
cgcggatccAAGCTCTTAAGCTTTGGGGG(序列號(hào)44；小寫字母堿基為含有BamHI位點(diǎn)的尾端)以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，2分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有zwf結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)(約160bp)的擴(kuò)增片段。
(ii)zwf結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)的克隆將zwf結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)的DNA片段純化，將BamHI處理過的DNA片段用該酶處理，與使用通過牛腸磷酸酶(Calf intestinal phosphatase)脫磷酸化的E.coli-Bacillus的穿梭載體(シヤトルベクタ一)pHY300PLK(ヤクルト社制)用T4 DNA連接酶連結(jié)，得到擴(kuò)增的zwf基因用質(zhì)粒。
(iii)導(dǎo)入zwf基因擴(kuò)增用質(zhì)粒的肌苷產(chǎn)生菌株的制備用得到的質(zhì)粒，或者pHY300PLK載體，轉(zhuǎn)化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制備的實(shí)施例5中記載的肌苷產(chǎn)生菌KMBS321株的感受態(tài)細(xì)胞，得到含有12.5μg/ml的四環(huán)素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。導(dǎo)入裝有zwf的質(zhì)粒的菌株內(nèi)的一株命名為TABS125，導(dǎo)入pHY300PLK的菌株的一株命名為TABS100。確認(rèn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的提高，用以下的方法進(jìn)行。
葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(zwf基因產(chǎn)物)活性測(cè)定法反應(yīng)溶液50mM Tris-HCl(pH7.6)10mM MgSO4·7H2O0.3mM NADP4mM葡萄糖6-磷酸鹽酶溶液制備上述反應(yīng)溶液(1ml)，開始37℃反應(yīng)。在340nm的吸收測(cè)定生成的NADPH的濃度變化。
(iv)導(dǎo)入裝有zwf的質(zhì)粒的肌苷生產(chǎn)菌株的嘌呤類核酸生產(chǎn)將TABS125和TABS100，在含有12.5μg/ml的四環(huán)素的PS培養(yǎng)基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，用KOH調(diào)至pH 7.0)上毫無遺漏地涂布，34℃過夜培養(yǎng)。將1/8平板部分的菌體接種在500ml容量的坂口燒瓶中的20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后，將碳酸鈣加至50g/L，34℃振搖培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始后120時(shí)間取樣，用已知的方法測(cè)定培養(yǎng)液中含有的肌苷及次黃嘌呤量(表5)。用這樣的方法得到提高嘌呤核苷產(chǎn)生能力的菌株。
葡萄糖60g/LKH2PO41g/LNH4Cl 32g/L大豆提取物((T-N))*1.35g/L酵母提取物1g/LDL-蛋氨酸 0.3g/LL-色氨酸 0.02g/L腺嘌呤0.1g/L鳥苷 0.075g/LMgSO40.4g/LFeSO40.01g/LMnSO40.01g/LGD113 0.01ml/L(用KOH調(diào)至pH 7.0)碳酸鈣50g/L*蛋白水解物表5

(2)核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活性增強(qiáng)株的構(gòu)建用來源于枯草芽孢桿菌(B.subtilis 168 Marburg株；ATCC6051)，使缺失嘌呤操縱子阻遏物基因(purR)，琥珀酰-AMP合成酶基因(purA)，嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG和deoD)，而且在IMP脫氫酶基因(guaB)中導(dǎo)入guaB突變(A1)，而且使用改變嘌呤操縱子啟動(dòng)子區(qū)域及PRPP合成酶基因(prs)的SD序列的重組體，制備導(dǎo)入裝有氧化磷酸戊糖途徑基因ywlF的質(zhì)粒的菌株，如下進(jìn)行。
(i)通過PCR擴(kuò)增ywlF結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GenBank Accession No.NC_000964CAB15709.[gi2636217])的信息，制備含有以下堿基序列各34mer的PCR用引物。
cgcgaattcGTAGATAAGTTGTCAGAAAATCTGC(序列號(hào)45；小寫字母的堿基為含有EcoRI位點(diǎn)的尾端)cgcgaattcTGTTTCAACTCATTCATTAAACAGC(序列號(hào)46；小寫字母的堿基為含有EcoRI位點(diǎn)的尾端)以枯草芽孢桿菌168 Marburg株的染色體DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR(94℃，30秒；55℃，1分；72℃，1分；30循環(huán)；Gene Amp PCR SystemModel 9600(パ一キンエルマ一社制))，得到含有ywlF結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)(約160bp)的擴(kuò)增片段。
(ii)ywlF結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)的克隆將ywlF結(jié)構(gòu)基因及其上游區(qū)的DNA片段純化，EcoRI處理過的DNA片段用同酶處理，與通過牛小腸磷酸酶而脫磷酸化的大腸桿菌-芽孢桿菌(E.coli-Bacillus)的穿梭載體pHY300PLK(ヤクルト社制)用T4 DNA連接酶連接，得到y(tǒng)wlF基因擴(kuò)增用質(zhì)粒。
(iii)導(dǎo)入了ywlF基因擴(kuò)增用質(zhì)粒的肌苷產(chǎn)生菌株的制備用得到的質(zhì)粒，或pHY300PLK，轉(zhuǎn)化KMBS321株的感受態(tài)細(xì)胞，得到在含有12.5μg/ml的四環(huán)素的LB瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。導(dǎo)入裝有ywlF的質(zhì)粒的菌株的一株命名為TABS102。把導(dǎo)入了對(duì)照的pHY300PLK的菌株中的一個(gè)命名為TABS100。
KMBS321株為通過以下方法進(jìn)行制備。
根據(jù)Fouet和Sonenshein的方法(J.Bacteriol.，1990，172，835-844)，使用由KMBS16(purR::spc purA::erm deoD::kan；US2004-0166575A)制備得到的基因組DNA，轉(zhuǎn)化枯草桿菌[(B.subtilis)168 Marburg株]的感受態(tài)細(xì)胞，刮取在含有5μg/ml的卡那霉素的LB瓊脂板上生長(zhǎng)的菌落。在如此培育而得到的幾個(gè)菌落中篩選未達(dá)到大觀霉素抗藥性或紅霉素抗藥性的菌落，將其中的一株命名為KMBS5(deoD::kan)。
根據(jù)Fouet和Sonenshein的方法(J.Bacteriol.，1990，172，835-844)，使用由KMBS5(deoD::kan)制備得到的基因組DNA，轉(zhuǎn)化上述KMBS310株的感受態(tài)細(xì)胞，刮取在含有5μg/ml的卡那霉素和20μg/ml鳥嘌呤的LB瓊脂板上生長(zhǎng)的菌落。在如此培育而得到的幾個(gè)菌落中篩選菌落，野生型deoD基因被deoD::kan置換且來源于KMBS310的所有變異當(dāng)確認(rèn)了未被置換為野生型序列的轉(zhuǎn)化體時(shí)，將其中的一株命名為KMBS321。
確認(rèn)提高核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活性，通過以下的方法進(jìn)行。
核糖5-磷酸異構(gòu)酶(ywlF基因產(chǎn)物)活性測(cè)定法反應(yīng)溶液50mM HEPES(pH7.5)0.1M NaCl10mM核糖5-磷酸鹽酶溶液制備上述的反應(yīng)溶液(1ml)，在37℃開始反應(yīng)。在290nm吸收測(cè)定生成的核酮糖5-磷酸鹽的濃度變化。
(iv)導(dǎo)入裝有ywlF的質(zhì)粒的肌苷產(chǎn)生菌株的嘌呤類核酸產(chǎn)生將TABS100或TABS102株，在含12.5μg/ml的四環(huán)素的PS培養(yǎng)基平板(可溶淀粉30g/L，酵母菌提取物5g/L，多蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，用KOH調(diào)至pH 7.0)上毫無遺漏地涂布，在34℃過夜培養(yǎng)。將1/8平板部分的菌體，接種到500ml容量的坂口燒瓶中的20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后，將碳酸鈣加至50g/L，34℃振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后120小時(shí)取樣，用已知的方法測(cè)定培養(yǎng)液中含有的肌苷及次黃嘌呤量(表6)。核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活性增強(qiáng)株，與非改變株相比，提高肌苷產(chǎn)生能力。

葡萄糖 60g/LKH2PO41g/LNH4Cl 32g/L大豆提取物(T-N)*1.35g/L酵母提取物 1g/LDL-蛋氨酸 0.3g/LL-色氨酸0.02g/L腺嘌呤 0.1g/L鳥苷0.075g/LMgSO40.4g/LFeSO40.01g/LMnSO40.01g/LGD113 0.01ml/L(用KOH調(diào)至pH 7.0)碳酸鈣 50g/L*蛋白水解物表6

產(chǎn)業(yè)上的利用可能性通過使用本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌，提高嘌呤核苷及/或嘌呤核苷酸的產(chǎn)生效率。
序列表<110>味之素株式會(huì)社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生菌及嘌呤類物質(zhì)的制備方法<130>OP-C6032<150>JP2005-067560<151>2005-03-10<150>JP2005-280186<151>2005-09-27<160>62<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1attgcacggc cgttcgtcgg20<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2cgcagatctc cggattttcg atttcgtcc 29<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3caaagatctg tccagcctgg20
<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4cgcctgcagt gcctttatct aaagcttcc 29<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ggtctgagct ttgcgaacc 19<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6cgcctgcagt gcctttatct aaagcttcc 29<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7cgcggatccg gcttaacgtt cgacgatgtg ctgc34<210>8<211>50
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gctttgccca ttctatagat atattgagtc attgtatcgc cagttacacc 50<210>9<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9cctagattta gatgtctaaa aagctgtgat tgttatcgat acagctcacg 50<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10cgcgaattcg taatctgtac gtcatgcgga tggc34<210>11<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ggtgtaactg gcgatacaat gactcaatat atctatagaa tgggcaaagc 50<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12cgtgagctgt atcgataaca atcacagctt tttagacatc taaatctagg 50<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13cataaaatgt acgcataggc cattc 25<210>14<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14ttgtatcgcc agttacacca actaccgcgc caacgatcag gcggcc 46<210>15<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15ggccgcctga tcgttggcgc ggtagttggt gtaactggcg atacaa 46<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16ccttgatcaa ttgcttccaa taacag 26
<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17cgcggatcct tatttagcgg ccggcatcag tacg34<210>18<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18cgtttgttgaactaatgggt gctttatgga taatgtcaac gatattatcg50<210>19<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19acagctccag atccatatcc ttcttcctca tataatcttg ggaatatggc 50<210>20<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20cgcggatcct ctctcatcca gcttacgggc aagg34<210>21<211>50
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21cgataatatc gttgacatta tccataaagc acccattagt tcaacaaacg 50<210>22<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22gccatattcc caagattata tgaggaagaa ggatatggat ctggagctgt 50<210>23<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23ttttgatttc atgtttatta taacaacgga catggata38<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24ttttgatttc atgtttatca taacaacgga catggata38<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>25ttttgatttc atgtttattt taacaacgga catggata38<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26gggtaataag cagcagctca cttcc 25<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>27tatccatgtc cgttgttata ataaacatga aatcaaaa38<210>28<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>28tatccatgtc cgttgttatg ataaacatga aatcaaaa38<210>29<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>29tatccatgtc cgttgttaaa ataaacatga aatcaaaa38
<210>30<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>30gcttttgttt tcagaaaata aaaaatacga tatatccatg tcagttttat cg52<210>31<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31cgataaaact gacatggata tatcgtattt tttattttct gaaaacaaaa gc52<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32cgcaagcttt attttctgaa aacaaaagc 29<210>33<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33cgcggatcct ttctcttctc tcatccagc 29<210>34<211>34
<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>37gattagacat ggataaacct ccgtatttag gattattttt tatgaa 46<210>38<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>38cgcggatccg gtttagctga acagatagct gactgattgc 40<210>39<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>39ttcataaaaa ataatcctaa ataaggaggt ttatccatgt ctaatc 46<210>40<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>40ttcataaaaa ataatcctaa attaggaggt ttatccatgt ctaatc 46<210>41<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>41ttcataaaaa ataatcctaa atacggaggt ttatccatgt ctaatc 46<210>42<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>42aatagatata aagaggtgag tctgc 25
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<223>引物<400>46cgcgaattct gtttcaactc attcattaaa cagc34<210>47<211>1470
<212>DNA<213>枯草芽胞桿菌<220>
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Ala Arg Tyr Tyr Glu Lys Ser Gly Ala Leu Arg Asp Met Val Gln Asn225 230 235 240cat att atg cag atg gtt gcc ctt ctt gca atg gag ccg cct atc aaa768His Ile Met Gln Met Val Ala Leu Leu Ala Met Glu Pro Pro Ile Lys245 250 255ttg aac aca gaa gaa atc cgc agc gag aaa gtg aag gtg ctg aga gca816Leu Asn Thr Glu Glu Ile Arg Ser Glu Lys Val Lys Val Leu Arg Ala260 265 270ctg cgt cct att gca aaa gac gaa gtg gat gaa tac ttt gtg cgc gga864Leu Arg Pro Ile Ala Lys Asp Glu Val Asp Glu Tyr Phe Val Arg Gly275 280 285caa tat cat gct ggt gaa att gac ggt gta ccg gtt cct gct tat aca912Gln Tyr His Ala Gly Glu Ile Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Tyr Thr290 295 300gat gaa gat aat gtc gct cct gac tcc aat aca gaa acc ttt gtt gcc960Asp Glu Asp Asn Val Ala Pro Asp Ser Asn Thr Glu Thr Phe Val Ala305 310 315 320ggc aag ctc ttg atc gac aac ttc aga tgg gct ggt gtt cca ttc tac1008Gly Lys Leu Leu Ile Asp Asn Phe Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr325 330 335atc aga acc gga aaa cga atg aga gaa aag tcc aca aaa att gtc gtt1056Ile Arg Thr Gly Lys Arg Met Arg Glu Lys Ser Thr Lys Ile Val Val340 345 350caa ttt aag gac att ccg atg aac ctg tac tac ggt aat gaa aac aac1104Gln Phe Lys Asp Ile Pro Met Asn Leu Tyr Tyr Gly Asn Glu Asn Asn355 360 365atg aat ccg aac ttg ctt gtc att cat att cag cct gac gaa ggc att1152Met Asn Pro Asn Leu Leu Val Ile His Ile Gln Pro Asp Glu Gly Ile370 375 380acg ctt tac tta aat gct aaa aag ctt ggc gga gca gca cac gca cag1200Thr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Leu Gly Gly Ala Ala His Ala Gln385 390 395 400cca atc aaa ctc gat tat tgc agc aat tgc aat gac gag ttg aac acc1248Pro Ile Lys Leu Asp Tyr Cys Ser Asn Cys Asn Asp Glu Leu Asn Thr405 410 415cct gaa gca tat gaa aaa cta att cac gac tgt ctt ctt ggc gat gca1296Pro Glu Ala Tyr Glu Lys Leu Ile His Asp Cys Leu Leu Gly Asp Ala420 425 430aca aac ttt gca cac tgg gat gaa gtt gcc ctt tct tgg agc ttt gtc1344Thr Asn Phe Ala His Trp Asp Glu Val Ala Leu Ser Trp Ser Phe Val435 440 445gac tct att tct gaa aca tgg gca gca aac aaa acc tta tct cct aac1392Asp Ser Ile Ser Glu Thr Trp Ala Ala Asn Lys Thr Leu Ser Pro Asn450 455 460tac gaa tca ggc tca atg gga ccg aaa gaa tct gat gat ctt ttg gtg1440Tyr Glu Ser Gly Ser Met Gly Pro Lys Glu Ser Asp Asp Leu Leu Val465 470 475 480aaa gac ggc tta cac tgg tgg aac ata taa1470Lys Asp Gly Leu His Trp Trp Asn Ile485
<210>48<211>489<212>PRT<213>枯草芽胞桿菌<400>48Met Lys Thr Asn Gln Gln Pro Lys Ala Val Ile Val Ile Phe Gly Ala1 5 10 15Thr Gly Asp Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Ile His Arg Leu20 25 30Tyr Gln Asn Gly Gln Ile Gly Glu Glu Phe Ala Val Val Gly Val Gly35 40 45Arg Arg Pro Trp Ser Asn Glu Asp Leu Arg Gln Thr Val Lys Thr Ser50 55 60Ile Ser Ser Ser Ala Asp Lys His Ile Asp Asp Phe Thr Ser His Phe65 70 75 80Tyr Tyr His Pro Phe Asp Val Thr Asn Pro Gly Ser Tyr Gln Glu Leu85 90 95Asn Val Leu Leu Asn Gln Leu Glu Asp Thr Tyr Gln Ile Pro Asn Asn100 105 110Arg Met Phe Tyr Leu Ala Met Ala Pro Glu Phe Phe Gly Thr Ile Ala115 120 125Lys Thr Leu Lys Ser Glu Gly Val Thr Ala Thr Thr Gly Trp Ser Arg130 135 140Leu Val Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asp Leu Pro Ser Ala Gln Ala145 150 155 160Leu Asn Lys Glu Ile Arg Glu Ala Phe Thr Glu Asp Gln Ile Tyr Arg165 170 175Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Gln Met Val Gln Asn Ile Glu Val Ile180 185 190Arg Phe Ala Asn Ala Ile Phe Glu Pro Leu Trp Thr Asn Arg Tyr Ile195 200 205Ser Asn Ile Gln Ile Thr Ser Ser Glu Ser Leu Gly Val Glu Asp Arg210 215 220Ala Arg Tyr Tyr Glu Lys Ser Gly Ala Leu Arg Asp Met Val Gln Asn225 230 235 240His Ile Met Gln Met Val Ala Leu Leu Ala Met Glu Pro Pro Ile Lys245 250 255Leu Asn Thr Glu Glu Ile Arg Ser Glu Lys Val Lys Val Leu Arg Ala260 265 270Leu Arg Pro Ile Ala Lys Asp Glu Val Asp Glu Tyr Phe Val Arg Gly275 280 285Gln Tyr His Ala Gly Glu Ile Asp Gly Val Pro Val Pro Ala Tyr Thr290 295 300Asp Glu Asp Asn Val Ala Pro Asp Ser Asn Thr Glu Thr Phe Val Ala305 310 315 320Gly Lys Leu Leu Ile Asp Asn Phe Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr325 330 335Ile Arg Thr Gly Lys Arg Met Arg Glu Lys Ser Thr Lys Ile Val Val340 345 350Gln Phe Lys Asp Ile Pro Met Asn Leu Tyr Tyr Gly Asn Glu Asn Asn355 360 365
Met Asn Pro Asn Leu Leu Val Ile His Ile Gln Pro Asp Glu Gly Ile370 375 380Thr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Leu Gly Gly Ala Ala His Ala Gln385 390 395 400Pro Ile Lys Leu Asp Tyr Cys Ser Asn Cys Asn Asp Glu Leu Asn Thr405 410 415Pro Glu Ala Tyr Glu Lys Leu Ile His Asp Cys Leu Leu Gly Asp Ala420 425 430Thr Asn Phe Ala His Trp Asp Glu Val Ala Leu Ser Trp Ser Phe Val435 440 445Asp Ser Ile Ser Glu Thr Trp Ala Ala Asn Lys Thr Leu Ser Pro Asn450 455 460Tyr Glu Ser Gly Ser Met Gly Pro Lys Glu Ser Asp Asp Leu Leu Val465 470 475 480Lys Asp Gly Leu His Trp Trp Asn Ile485<210>49<211>450<212>DNA<213>枯草芽胞桿菌<220>
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115 120 125ttt acc ggg gga aga cac caa acg cgt att gga aaa atc tcc gat tat432Phe Thr Gly Gly Arg His Gln Thr Arg Ile Gly Lys Ile Ser Asp Tyr130 135 140gaa gag aaa aac ctg tag450Glu Glu Lys Asn Leu145<210>50<211>149<212>PRT<213>枯草芽胞桿菌<400>50Met Lys Val Ala Ile Ala Ser Asp His Gly Gly Val His Ile Arg Asn1 5 10 15Glu Ile Lys Glu Leu Met Asp Glu Leu Gln Ile Glu Tyr Ile Asp Met20 25 30Gly Cys Asp Cys Gly Ser Gly Ser Val Asp Tyr Pro Asp Tyr Ala Phe35 40 45Pro Val Ala Glu Lys Val Val Ser Gly Glu Val Asp Arg Gly Ile Leu50 55 60Ile Cys Gly Thr Gly Ile Gly Met Ser Ile Ser Ala Asn Lys Val Lys65 70 75 80Gly Ile Arg Cys Ala Leu Ala His Asp Thr Phe Ser Ala Lys Ala Thr85 90 95Arg Glu His Asn Asp Thr Asn Ile Leu Ala Met Gly Glu Arg Val Ile100 105 110Gly Pro Gly Leu Ala Arg Glu Ile Ala Lys Ile Trp Leu Thr Thr Glu115 120 125Phe Thr Gly Gly Arg His Gln Thr Arg Ile Gly Lys Ile Ser Asp Tyr130 135 140Glu Glu Lys Asn Leu145<210>51<211>858<212>DNA<213>枯草芽胞桿菌<220>
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Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg20 25 30tat gaa tct gca aaa tca tcg atc agt gaa gat tta aca att att aaa144Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys35 40 45caa acc ttt gaa cag cag ggg att ggt act ttg ctt act gtt ccc gga192Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly50 55 60gct gcc gga ggc gtt aaa tat att ccg aaa atg aag cag gct gaa gct240Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala65 70 75 80gaa gag ttt gtg cag aca ctt gga cag tcg ctg gca aat cct gag cgt288Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg85 90 95atc ctt ccg ggc ggt tat gta tat tta acg gat atc tta gga aag cca336Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro100 105 110tct gta ctc tcc aag gta ggg aag ctg ttt gct tcc gtg ttt gca gag384Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu115 120 125cgc gaa att gat gtt gtc atg acc gtt gcc acg aaa ggc atc cct ctt432Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu130 135 140gcg tac gca gct gca agc tat ttg aat gtg cct gtt gtg atc gtt cgt480Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg145 150 155 160aaa gac aat aag gta aca gag ggc tcc aca gtc agc att aat tac gtt528Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val165 170 175tca ggc tcc tca aac cgc att caa aca atg tca ctt gcg aaa aga agc576Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser180 185 190atg aaa acg ggt tca aac gta ctc att att gat gac ttt atg aaa gca624Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala195 200 205ggc ggc acc att aat ggt atg att aac ctg ttg gat gag ttt aac gca672Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala210 215 220aat gtg gcg gga atc ggc gtc tta gtt gaa gcc gaa gga gta gat gaa720Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu225 230 235 240cgt ctt gtt gac gaa tat atg tca ctt ctt act ctt tca acc atc aac768Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn245 250 255atg aaa gag aag tcc att gaa att cag aat ggc aat ttt ctg cgt ttt816Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe260 265 270ttt aaa gac aat ctt tta aag aat gga gag aca gaa tca tga858Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser275 280 285
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<221>CDS<222>(1)..(816)
<223>
<400>53ttg aag gac aga att gaa cgc gca gcc gct ttt att aaa caa aac ctg48Met Lys Asp Arg Ile Glu Arg Ala Ala Ala Phe Ile Lys Gln Asn Leu1 5 10 15ccg gaa tct cca aag atc ggc ctt att tta ggc tca ggt ctt ggc att96Pro Glu Ser Pro Lys Ile Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ile20 25 30ttg gcg gac gaa atc gaa aat ccg gtc aag ctg aaa tat gaa gat ata144Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asn Pro Val Lys Leu Lys Tyr Glu Asp Ile35 40 45cct gaa ttc ccg gta tct act gtt gaa ggg cat gcc gga cag ctt gtg192Pro Glu Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly His Ala Gly Gln Leu Val50 55 60ctt ggc act ctt gaa gga gtt tcc gtc att gca atg cag ggc cgc ttt240Leu Gly Thr Leu Glu Gly Val Ser Val Ile Ala Met Gln Gly Arg Phe65 70 75 80cat ttt tat gaa ggc tac tca atg gag aaa gtc aca ttc cct gta cgc288His Phe Tyr Glu Gly Tyr Ser Met Glu Lys Val Thr Phe Pro Val Arg85 90 95gtg atg aaa gcg ctc ggt gtg gaa gcg ttg atc gtg aca aat gcc gca336Val Met Lys Ala Leu Gly Val Glu Ala Leu Ile Val Thr Asn Ala Ala100 105 110ggc ggt gtc aac act gaa ttc cgt gcg gga gat tta atg att att acc384Gly Gly Val Asn Thr Glu Phe Arg Ala Gly Asp Leu Met Ile Ile Thr115 120 125gat cat atc aac ttt atg gga aca aac ccg tta atc ggg cca aac gaa432Asp His Ile Asn Phe Met Gly Thr Asn Pro Leu Ile Gly Pro Asn Glu130 135 140gca gat ttc ggc gcc aga ttt cca gat atg tct tca gcc tat gac aaa480Ala Asp Phe Gly Ala Arg Phe Pro Asp Met Ser Ser Ala Tyr Asp Lys145 150 155 160gat ctg tcc agc ctg gct gaa aag att gcg aaa gac ctt aat atc cca528Asp Leu Ser Ser Leu Ala Glu Lys Ile Ala Lys Asp Leu Asn Ile Pro165 170 175att caa aaa ggc gtg tac act gct gtg aca gga cct tct tac gaa aca576Ile Gln Lys Gly Val Tyr Thr Ala Val Thr Gly Pro Ser Tyr Glu Thr180 185 190ccg gca gaa gtc cgt ttc tta aga acg atg ggc tct gat gca gtc ggc624Pro Ala Glu Val Arg Phe Leu Arg Thr Met Gly Ser Asp Ala Val Gly195 200 205atg tct act gtt ccg gaa gtc att gta gcg aat cat gcg gga atg cgg672Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala Asn His Ala Gly Met Arg210 215 220gtt ctt ggc att tcc tgc atc tct aac gcg gca gcc gga att ctg gat720Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn Ala Ala Ala Gly Ile Leu Asp225 230 235 240cag cct tta agt cac gat gaa gtt atg gaa gtg acc gaa aaa gta aaa768Gln Pro Leu Ser His Asp Glu Val Met Glu Val Thr Glu Lys Val Lys245 250 255gct gga ttc tta aag ctt gtt aaa gcg atc gtc gct cag tac gaa taa816
Ala Gly Phe Leu Lys Leu Val Lys Ala Ile Val Ala Gln Tyr Glu260 265 270<210>54<211>271<212>PRT<213>枯草芽胞桿菌<400>54Met Lys Asp Arg Ile Glu Arg Ala Ala Ala Phe Ile Lys Gln Asn Leu1 5 10 15Pro Glu Ser Pro Lys Ile Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ile20 25 30Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asn Pro Val Lys Leu Lys Tyr Glu Asp Ile35 40 45Pro Glu Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly His Ala Gly Gln Leu Val50 55 60Leu Gly Thr Leu Glu Gly Val Ser Val Ile Ala Met Gln Gly Arg Phe65 70 75 80His Phe Tyr Glu Gly Tyr Ser Met Glu Lys Val Thr Phe Pro Val Arg85 90 95Val Met Lys Ala Leu Gly Val Glu Ala Leu Ile Val Thr Asn Ala Ala100 105 110Gly Gly Val Asn Thr Glu Phe Arg Ala Gly Asp Leu Met Ile Ile Thr115 120 125Asp His Ile Asn Phe Met Gly Thr Asn Pro Leu Ile Gly Pro Asn Glu130 135 140Ala Asp Phe Gly Ala Arg Phe Pro Asp Met Ser Ser Ala Tyr Asp Lys145 150 155 160Asp Leu Ser Ser Leu Ala Glu Lys Ile Ala Lys Asp Leu Asn Ile Pro165 170 175Ile Gln Lys Gly Val Tyr Thr Ala Val Thr Gly Pro Ser Tyr Glu Thr180 185 190Pro Ala Glu Val Arg Phe Leu Arg Thr Met Gly Ser Asp Ala Val Gly195 200 205Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala Asn His Ala Gly Met Arg210 215 220Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn Ala Ala Ala Gly Ile Leu Asp225 230 235 240Gln Pro Leu Ser His Asp Glu Val Met Glu Val Thr Glu Lys Val Lys245 250 255Ala Gly Phe Leu Lys Leu Val Lys Ala Ile Val Ala Gln Tyr Glu260 265 270<210>55<211>702<212>DNA<213>枯草芽胞桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(702)<223>
<400>55atg agt gta cat ata ggt gct gaa aaa gga caa att gcg gat act gtg48Met Ser Val His Ile Gly Ala Glu Lys Gly Gln Ile Ala Asp Thr Val1 5 10 15ctt ttg ccg gga gat cct ctc aga gca aaa ttt att gca gaa acg tat96Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Phe Ile Ala Glu Thr Tyr20 25 30ctt gaa aat gta gaa tgc tac aat gaa gtc aga ggc atg tat gga ttt144Leu Glu Asn Val Glu Cys Tyr Asn Glu Val Arg Gly Met Tyr Gly Phe35 40 45acg ggt aca tat aaa ggt aaa aaa atc tca gta caa ggc acg gga atg192Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Ser Val Gln Gly Thr Gly Met50 55 60gga gtt ccg tct att tca att tat gtg aat gaa tta att caa agc tac240Gly Val Pro Ser Ile Ser Ile Tyr Val Asn Glu Leu Ile Gln Ser Tyr65 70 75 80gat gtg caa aat cta ata aga gtc ggt tcc tgc ggc gct att cgt aaa288Asp Val Gln Asn Leu Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Ile Arg Lys85 90 95gat gtc aaa gtg cga gac gtc att ttg gcg atg acc tcc tca act gat336Asp Val Lys Val Arg Asp Val Ile Leu Ala Met Thr Ser Ser Thr Asp100 105 110tca caa atg aac aga gtt gct ttc gga agc gtt gat ttt gcg cct tgc384Ser Gln Met Asn Arg Val Ala Phe Gly Ser Val Asp Phe Ala Pro Cys115 120 125gca gat ttc gag ctt tta aaa aat gcc tat gat gcc gca aag gat aaa432Ala Asp Phe Glu Leu Leu Lys Asn Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Asp Lys130 135 140ggt gtg ccg gtg act gta gga agc gta ttt aca gct gac cag ttc tac480Gly Val Pro Val Thr Val Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Gln Phe Tyr145 150 155 160aat gac gat tcg caa att gaa aaa ctt gca aaa tac ggt gtg ctt ggc528Asn Asp Asp Ser Gln Ile Glu Lys Leu Ala Lys Tyr Gly Val Leu Gly165 170 175gtt gaa atg gaa aca act gca ttg tat aca tta gca gcg aag cac gga576Val Glu Met Glu Thr Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Ala Lys His Gly180 185 190aga aaa gcc ctg tca att ctc acc gtg agt gat cac gta tta aca gga624Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Thr Val Ser Asp His Val Leu Thr Gly195 200 205gaa gaa acg aca gcg gaa gag cgt caa acg aca ttt cat gat atg ata672Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe His Asp Met Ile210 215 220gaa gtg gct tta cat tcc gta tca caa taa702Glu Val Ala Leu His Ser Val Ser Gln225 230
<210>56<211>233<212>PRT<213>枯草芽胞桿菌<400>56Met Ser Val His Ile Gly Ala Glu Lys Gly Gln Ile Ala Asp Thr Val1 5 10 15Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Phe Ile Ala Glu Thr Tyr20 25 30Leu Glu Asn Val Glu Cys Tyr Asn Glu Val Arg Gly Met Tyr Gly Phe35 40 45Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Ser Val Gln Gly Thr Gly Met50 55 60Gly Val Pro Ser Ile Ser Ile Tyr Val Asn Glu Leu Ile Gln Ser Tyr65 70 75 80Asp Val Gln Asn Leu Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Ile Arg Lys85 90 95Asp Val Lys Val Arg Asp Val Ile Leu Ala Met Thr Ser Ser Thr Asp100 105 110Ser Gln Met Asn Arg Val Ala Phe Gly Ser Val Asp Phe Ala Pro Cys115 120 125Ala Asp Phe Glu Leu Leu Lys Asn Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Asp Lys130 135 140Gly Val Pro Val Thr Val Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Gln Phe Tyr145 150 155 160Asn Asp Asp Ser Gln Ile Glu Lys Leu Ala Lys Tyr Gly Val Leu Gly165 170 175Val Glu Met Glu Thr Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Ala Lys His Gly180 185 190Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Thr Val Ser Asp His Val Leu Thr Gly195 200 205Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe His Asp Met Ile210 215 220Glu Val Ala Leu His Ser Val Ser Gln225 230<210>57<211>954<212>DNA<213>枯草芽胞桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(954)<223>
<400>57atg tct aat caa tac gga gat aag aat tta aag att ttt tct ttg aat48Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp Lys Asn Leu Lys Ile Phe Ser Leu Asn1 5 10 15
tcg aat cca gag ctt gca aaa gaa atc gca gat ata gtt gga gtt caa96Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Gln20 25 30tta ggg aaa tgt tct gtc aca aga ttt agt gac ggg gaa gtc caa att144Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile35 40 45aat atc gaa gaa agt att cgc gga tgt gat tgt tac atc atc cag tct192Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser50 55 60aca agt gac ccc gtt aac gag cat att atg gaa ctg ctg att atg gta240Thr Ser Asp Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val65 70 75 80gat gcg tta aaa cgc gct tct gca aaa acg att aac att gtt att cct288Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro85 90 95tat tac ggt tat gcg cgt caa gac aga aaa gca aga tcc cgt gag cca336Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro100 105 110atc aca gct aaa ctt ttc gct aac ctg ctt gaa aca gcc ggt gcg act384Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr115 120 125cgt gtg att gca ctt gac ctg cat gcg ccg caa att caa gga ttc ttt432Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe130 135 140gat ata ccg att gac cac tta atg ggt gtt ccg att tta gga gaa tat480Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr145 150 155 160ttt gaa ggc aaa aat ctt gaa gat atc gtc att gtt tca cca gac cat528Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His165 170 175ggc ggt gtg aca cgt gcc cgc aaa ctg gct gac cga cta aaa gcg cca576Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro180 185 190att gcg att atc gat aaa cgc cgt ccg cgt cca aac gtg gcg gaa gtc624Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val195 200 205atg aat att gta ggt aac atc gaa ggg aag act gct atc ctc atc gat672Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp210 215 220gac att att gat act gca ggt acg att aca ctt gct gct aat gcg ctc720Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu225 230 235 240gtt gaa aac gga gcg aaa gaa gta tat gca tgc tgt aca cac cct gta768Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val245 250 255cta tca ggc cct gcg gtt gaa cgg att aat aat tca aca att aaa gag816Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu260 265 270ctt gtt gtg aca aac agc atc aag ctt cct gaa gaa aag aaa att gaa864Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu275 280 285cgc ttt aag cag ctt tca gtc gga ccg ctt ctg gcc gaa gcg att att912
Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile290 295 300cgc gtt cat gag cag caa tca gtc agc tat ctg ttc agc taa954Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser305 310 315<210>58<211>317<212>PRT<213>枯草芽胞桿菌<400>58Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp Lys Asn Leu Lys Ile Phe Ser Leu Asn1 5 10 15Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Gln20 25 30Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile35 40 45Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser50 55 60Thr Ser Asp Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val65 70 75 80Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro85 90 95Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro100 105 110Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr115 120 125Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe130 135 140Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr145 150 155 160Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His165 170 175Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro180 185 190Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val195 200 205Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp210 215 220Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu225 230 235 240Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val245 250 255Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu260 265 270Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu275 280 285Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile290 295 300Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser
305 310 315<210>59<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>59gaagttgatg atcaaaa 17<210>60<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>60acatattgtt gacgataat 19<210>61<211>1467<212>DNA<213>枯草芽胞桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1464)<223>
<400>61atg tgg gaa agt aaa ttt tca aaa gaa ggc tta acg ttc gac gat gtg48Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val1 5 10 15ctg ctt gta cca gca aag tct gag gta ctt ccg cgt gat gtg gat tta96Leu Leu Val Pro Ala Lys Ser Glu Val Leu Pro Arg Asp Val Asp Leu20 25 30tct gta gaa ctt aca aaa acg tta aag cta aat att cct gtc atc agc144Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser35 40 45gca ggt atg gac act gta aca gaa tca gca atg gca att gca atg gca192Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala50 55 60aga cag ggc ggc ttg ggc atc att cac aaa aat atg tcc att gaa cag240Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln65 70 75 80
cag gct gaa caa gtt gat aaa gta aag cgt tct gag cgc ggc gtt atc288Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile85 90 95aca aat ccc ttc ttt tta act cct gat cac caa gta ttt gat gcg gag336Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu100 105 110cat ttg atg ggg aaa tac aga att tcc ggt gtt ccg att gta aat aac384His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asn Asn115 120 125gaa gaa gac cag aag ctt gtt gga att att aca aac cgt gac ctt cgt432Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg130 135 140ttt att tct gac tac tca atg aaa atc agc gac gtc atg acg aaa gaa480Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu145 150 155 160gag cta gtt act gca tct gta gga act act ctg gat gaa gct gaa aag528Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys165 170 175att ttg cag aaa cat aaa att gaa aag ctt cct ctc gta gat gac cag576Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln180 185 190aat aaa tta aaa ggt ctt atc aca att aaa gac att gaa aaa gtc att624Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile195 200 205gag ttc ccg aac tca tct aaa gac att cac ggc cgc ctg atc gtt ggc672Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Ile His Gly Arg Leu Ile Val Gly210 215 220gcg gca gtt ggt gta act ggc gat aca atg act cgc gtc aaa aag ctt720Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Lys Lys Leu225 230 235 240gtt gaa gcc aat gtt gat gtg att gtt atc gat aca gct cac gga cac768Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Ile Asp Thr Ala His Gly His245 250 255tct caa ggc gtt tta aac aca gtc aca aaa atc cgt gaa acg tat ccc816Ser Gln Gly Val Leu Asn Thr Val Thr Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro260 265 270gaa tta aac att att gct gga aac gtg gca aca gct gaa gcg aca aga864Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Arg275 280 285gcg ctt atc gaa gct gga gca gac gtt gtc aaa gtt gga ata ggg cct912Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Val Val Lys Val Gly Ile Gly Pro290 295 300ggt tca att tgt act aca cgt gtt gta gcc ggc gtg ggt gtt ccg caa960Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln305 310 315 320att aca gca att tat gat tgt gcg act gaa gca aga aaa cac ggc aaa1008Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Lys325 330 335aca atc atc gcc gac ggt ggg att aaa ttc tct ggc gat atc act aaa1056Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys340 345 350gca ttg gca gcc ggc gga cat gct gtt atg ctc gga agc ttg ctt gca1104
Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala355 360 365ggc aca tca gaa agc cct ggt gaa act gaa atc tac caa ggc aga aga1152Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg370 375 380ttt aag gta tac cgc ggc atg gga tca gtt gct gca atg gaa aaa gga1200Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly385 390 395 400agt aaa gac cgt tac ttc caa gaa gaa aac aaa aaa ttt gtt cct gaa1248Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu405 410 415gga att gaa gga cgc aca cct tac aaa ggg cca gtt gaa gaa acc gtt1296Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val420 425 430tat cag cta gtc gga ggc ctt cgt tct ggt atg ggg tat tgc ggg tcc1344Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser435 440 445aaa gat ctg cgt gcg cta aga gaa gaa gct cag ttc att cgc atg act1392Lys Asp Leu Arg Ala Leu Arg Glu Glu Ala Gln Phe Ile Arg Met Thr450 455 460ggc gca gga ctt cgc gaa agc cat ccg cat gac gta cag att aca aaa1440Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Lys465 470 475 480gaa tca cct aac tat aca att tca taa1467Glu Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Ser485<210>62<211>488<212>PRT<213>枯草芽胞桿菌<400>62Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val1 5 10 15Leu Leu Val Pro Ala Lys Ser Glu Val Leu Pro Arg Asp Val Asp Leu20 25 30Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser35 40 45Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala50 55 60Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln65 70 75 80Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile85 90 95Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu100 105 110His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asn Asn115 120 125Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg130 135 140
Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu145 150 155 160Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys165 170 175Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln180 185 190Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile195 200 205Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Ile His Gly Arg Leu Ile Val Gly210 215 220Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Lys Lys Leu225 230 235 240Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Ile Asp Thr Ala His Gly His245 250 255Ser Gln Gly Val Leu Asn Thr Val Thr Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro260 265 270Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Arg275 280 285Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Val Val Lys Val Gly Ile Gly Pro290 295 300Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln305 310 315 320Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Lys325 330 335Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys340 345 350Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala355 360 365Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg370 375 380Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly385 390 395 400Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu405 410 415Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val420 425 430Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser435 440 445Lys Asp Leu Arg Ala Leu Arg Glu Glu Ala Gln Phe Ile Arg Met Thr450 455 460Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Lys465 470 475 480Glu Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Ser48權(quán)利要求
1.芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，具有產(chǎn)生嘌呤類物質(zhì)的能力，改變并提高了氧化磷酸戊糖途徑的酶活性。
2.權(quán)利要求1的芽孢桿菌屬細(xì)菌，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷的嘌呤核苷。
3.權(quán)利要求1的芽孢桿菌屬細(xì)菌，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷酸、黃苷酸、鳥苷酸、腺苷酸的嘌呤核苷酸。
4.權(quán)利要求1～3的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，上述氧化磷酸戊糖途徑的酶是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或核糖-5-磷酸異構(gòu)酶。
5.權(quán)利要求1～4的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，通過增加編碼上述酶的基因的拷貝數(shù)或者改變?cè)摶虻谋磉_(dá)調(diào)節(jié)序列而增強(qiáng)氧化磷酸戊糖途徑的酶活性。
6.權(quán)利要求5的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述酶是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，編碼該葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶的基因?yàn)榫幋a下列(A)或(B)中表示的蛋白質(zhì)的基因。(A)具有序列號(hào)48中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(B)在序列號(hào)48中記載的氨基酸序列中，具有含1個(gè)或者多個(gè)的氨基酸殘基的置換、缺失、插入、添加、或者倒位的氨基酸序列，并且，具有葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶活性的蛋白質(zhì)
7.權(quán)利要求5的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述酶是核糖5-磷酸異構(gòu)酶，編碼該核糖5-磷酸異構(gòu)酶的基因是編碼下列(E)或(F)中所示蛋白質(zhì)的基因。(E)具有序列號(hào)50中記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(F)在序列號(hào)50中記載的氨基酸序列中，具有含1個(gè)或者多個(gè)的氨基酸殘基的置換、缺失、插入、添加、或者倒位的氨基酸序列，并且，具有核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)
8.權(quán)利要求6或7的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述多個(gè)氨基酸為2～20個(gè)氨基酸。
9.權(quán)利要求5的芽孢桿菌屬細(xì)菌，其中上述酶為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，編碼該葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因?yàn)橄铝?a)或(b)中所示的DNA。(a)含有序列號(hào)47中記載的堿基序列的DNA(b)是在含有序列號(hào)47中記載的堿基序列或者從該堿基序列制備得到的探針和嚴(yán)格條件下雜交的DNA，并且編碼具有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA
10.權(quán)利要求5的芽孢桿菌屬細(xì)菌，上述酶是核糖5-磷酸異構(gòu)酶，編碼該核糖5-磷酸異構(gòu)酶的基因是下列(e)或(f)中所示的DNA。(e)含有序列號(hào)49中記載的堿基序列的DNA(f)是含有序列號(hào)49中記載的堿基序列或者從該堿基序列制備得到的探針和嚴(yán)格條件下雜交的DNA，并且編碼具有核糖5-磷酸異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的DNA
11.權(quán)利要求1～10的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，更進(jìn)一步地改變以提高磷酸核糖焦磷酸合成酶活性。
12.權(quán)利要求1～11的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，更進(jìn)一步地改變以提高嘌呤操縱子的表達(dá)量。
13.權(quán)利要求12的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，通過破壞編碼嘌呤操縱子的阻遏物的基因即purR基因，或者除去嘌呤操縱子的弱化子區(qū)域的一部分，來提高嘌呤操縱子的表達(dá)量。
14.權(quán)利要求1～13的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，特征在于，更進(jìn)一步地改變以降低嘌呤核苷磷酸化酶活性。
15.嘌呤類物質(zhì)的制備方法，特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1～14的任一項(xiàng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌，使嘌呤類物質(zhì)蓄積，回收嘌呤類物質(zhì)。
16.權(quán)利要求15的制備方法，嘌呤類物質(zhì)是嘌呤核苷或者嘌呤核苷酸。
17.權(quán)利要求16的制備方法，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷、黃苷、鳥苷、腺苷的嘌呤核苷。
18.權(quán)利要求16的制備方法，上述嘌呤類物質(zhì)是選自肌苷酸、黃苷酸、鳥苷酸、腺苷酸的嘌呤核苷酸。
19.嘌呤核苷酸的制備方法，特征在于，通過權(quán)利要求17的方法制備嘌呤核苷，該嘌呤核苷與選自多磷酸、苯磷酸、氨甲酰磷酸的磷酸供體，通過具有產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯能力的微生物或酸性磷酸酶的作用，生成嘌呤核苷酸，得到該嘌呤核苷酸。
全文摘要
通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有嘌呤類物質(zhì)產(chǎn)生能力、增強(qiáng)氧化磷酸戊糖途徑的酶活性的芽孢桿菌屬細(xì)菌，在該培養(yǎng)基中或者菌體內(nèi)使嘌呤類物質(zhì)生成蓄積，從該培養(yǎng)基中或菌體內(nèi)回收嘌呤類物質(zhì)，制備嘌呤類物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1831115SQ20061005951
公開日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月10日
發(fā)明者松野潔, 森由起子, 淺原貴之 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社