專利名稱：一種胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶Ⅱ基因啟動子及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子及其應用。
背景技術(shù)：
胡蘿卜可生食，產(chǎn)量高，易種植，耐儲藏，營養(yǎng)豐富而且是重要的早期嬰幼兒食品，因此轉(zhuǎn)基因胡蘿卜可以作為優(yōu)良的生產(chǎn)口服疫苗的植物載體，但是適合在胡蘿卜中，尤其是在胡蘿卜直根中特異表達外源基因的啟動子元件尚未被報道。目前用于構(gòu)建植物表達載體的啟動子主要是組成型啟動子(花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子)，相對于組織特異性啟動子，它易造成植物營養(yǎng)浪費且可能帶來轉(zhuǎn)基因漂流與生物安全性問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可在胡蘿卜直根中特異表達外源基因的胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子。
本發(fā)明所提供的胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1雜交的核苷酸序列；3)與序列表中的SEQ ID №1具有90％以上同源性且可驅(qū)動基因在胡蘿卜直根中表達的DNA序列。
具有序列表中序列1的DNA序列的胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子名稱為De-InvP。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
所述在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1雜交的核苷酸序列可具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列，該胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子名稱為InvP。
本發(fā)明利用一個農(nóng)桿菌介導的胡蘿卜直根瞬間表達體系證明，本發(fā)明的胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子可在胡蘿卜直根中特異表達外源基因，且具有較高的生物活性，可用于在胡蘿卜直根中表達外源蛋白。


圖1為InvP和De-InvP啟動子驅(qū)動表達的GUS活性。
圖2A為De-InvP驅(qū)動GUS在胡蘿卜中的瞬間表達結(jié)果。
圖2B為轉(zhuǎn)pINT121的胡蘿卜中GUS的瞬間表達結(jié)果。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、InvP和De-InvP的獲得及其功能實驗1.2.7kb長啟動子的克隆根據(jù)Sturm發(fā)表的序列(Sturm 1996，J.Exp.Bot.47，1187-1999，Genbank號Y18706)利用正向引物Pro15’-AATTAAGCTTGTCGACTCCCACATAGCAAT-3’和反向引物Pro25’-AATTCCATGGTAATTATATGAAGAATGTG-3’，以野生型胡蘿卜的基因組DNA為模板進行PCR，獲得距轉(zhuǎn)化酶基因翻譯起始位點上游2.7kb的全長啟動子S1片段，并在片段兩端引入酶切位點。序列測定結(jié)果表明，該S1片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，將該S1片段命名為InvP。其中，PCR的溫度條件為94℃預變性5分鐘；再94℃1分鐘，60℃2分鐘，72℃1分30秒，共30個循環(huán)；最后72℃10分鐘。
2.構(gòu)建2.7kb長啟動子與GUS報告基因的融合體將PCR合成的2.7kb長的啟動子S1片段用HindIII和Nco I酶切并克隆到質(zhì)粒pDMC202(CAMBIA，Canberra，Australia)的HindIII和Nco I識別位點間，形成S1::GUS融合，新質(zhì)粒定名為pDMCmin。為更換載體背景，將S1::GUS的部分片段用HindIII和SnaBI從pDMCmin上切下并插入pBI221-GusInt的HindIII和SnaBI識別位點間，定名為pBI221-S1。然后用HindIII和EcoR I從pBI221-S1上切下S1::GUSInt片段，插入到植物表達載體pBI121(質(zhì)粒購自Clontech公司)的HindIII和EcoR I識別位點間，得到含有2.7kb長啟動子InvP與GUS-Int報告基因的融合體的植物表達載體pS1。其中，pBI221-GusInt按照以下方法制備將具有序列表中序列3的內(nèi)含子(馬鈴薯ST-LS1基因的第二個內(nèi)含子)序列插入pBI221(購自Clontech公司)的SnaBI位點上，得到pBI221-GusInt質(zhì)粒。
將具有序列表中序列3的內(nèi)含子插入pBI121質(zhì)粒的SnaBI位點，得到GUS基因中插入內(nèi)含子的重組載體pINT121。以含有CaMV 35S啟動子與GUS-Int融合的pINT121為陽性對照。用限制性內(nèi)切酶HindIII和SmaI酶切pINT121，切除CaMV 35S啟動子，回收大片段補平后自連，得到缺失CaMV 35S啟動子的pINT121，定名為pN，作為陰性對照。
3.構(gòu)建增強型啟動子De-InvP與GUS-Int報告基因的融合體
以pBI221-S1質(zhì)粒上S1片段為模板，利用兩組引物PCR，一組是引物pro8和pro9(pro85’aattggatcctacaattaccaagaggc3’；pro95’aattccatggtaattatatgaagaatgtg3’)，擴增得到一個5’端酶切位點為BamHI，3’端含NcoI位點的A片段；另一組引物是pro4和pro10(pro45’aattaagctttacaattaccaagaggc3’；pro105’aattggatccgttcatgccaacgttctccaa3’)，擴增得到B片段。將A片段插入pBI221-S1質(zhì)粒的BamHI和SmaI位點間，產(chǎn)生pBI221-A質(zhì)粒。將B片段插入pBI221-A的HindIII和BamHI識別位點間，得到含有增強型啟動子(包含B片段與A片段)與GUS融合基因的質(zhì)粒pBI221-A-B。序列測定結(jié)果表明，該包含B片段與A片段的增強型啟動子具有序列表中序列1的核苷酸序列，將該增強型啟動子命名為De-InvP。
用HindIII和NcoI將增強型啟動子De-InvP與GUS融合基因從pBI221-A-B切下，插入pS1的HindIII和NcoI識別位點間，替換2.7kb啟動子，定名pES。
4.真空滲透法檢測2.7kb長轉(zhuǎn)化酶啟動子和增強型轉(zhuǎn)化酶啟動子De-InvP的活性(1)真空滲透法轉(zhuǎn)化胡蘿卜葉、莖組織1)胡蘿卜無菌苗的培養(yǎng)胡蘿卜種子經(jīng)表面消毒后播種于高瓶中的1/2MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基1cm厚，置于25℃，在16h光照、8h黑暗的晝夜節(jié)律下生長兩星期左右，至四葉或五葉期(包括兩片子葉)即可用作真空滲透實驗的材料。
2)將陰性對照pN、陽性對照pINT121、pES和pS1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，加50mg/L卡那霉素，30mg/L鏈霉素，28℃培養(yǎng)24h，離心收獲菌體，重懸于過濾滅菌的5％(質(zhì)量百分含量)蔗糖+0.01％(質(zhì)量百分含量)Silwet L77溶液中，調(diào)整菌體濃度至OD600為0.1。真空滲透時向培養(yǎng)胡蘿卜幼苗的高瓶中加入農(nóng)桿菌懸液至完全沒過植株，然后置于抽真空裝置中，抽真空為90kPa，保持3min后解除，傾去菌懸液，植株繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，檢測目的基因產(chǎn)物活性。
(2)真空滲透法轉(zhuǎn)化胡蘿卜直根組織1)選取12周的胡蘿卜直根材料，自來水清洗后再用無菌水沖洗3遍，將直根切成1mm厚的片即可作為轉(zhuǎn)化的材料。
2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和處理同胡蘿卜葉轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化后的胡蘿卜根片用含100mg/L羧卞青霉素的無菌水仔細清洗后放于完全浸濕的濾紙上，于25℃，16h光照、8h黑暗的晝夜節(jié)律下，培養(yǎng)3-4天后用于GUS檢測。
(3)GUS活性的熒光檢測A、溶液GUS提取緩沖液

GUS測定緩沖液在GUS提取緩沖液中加入MUG使其終濃度為1mM MUG。
B、步驟①取30mg胡蘿卜直根加入100μl GUS提取緩沖液，研磨，4℃，13,000g離心30min，取上清液，即為可溶性蛋白。
②取可溶性蛋白10μl加入100μl GUS測定緩沖液中，于37℃進行GUS反應。
③在GUS反應0分鐘，60分鐘和120分鐘時，分別加入110μl的0.2M Na2CO3終止反應。
④將1mM 4-MU貯藏液用0.2M Na2CO3稀釋成1000nM，500nM，250nM，125nM，62.5nM，31.25nM等6個濃度梯度的標準溶液，用于制作GUS活性熒光檢測的標準曲線。
⑤取220μl的標準溶液和220μl樣品反應終止液分別加入到專門用于熒光檢測的opaque microtiter plate上。使用FLUOstar OPTIMA(BMG TCHNOLOGY)儀器，在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm條件下測定GUS反應溶液所產(chǎn)生的熒光強度。
⑥取可溶性蛋白10μl，用Bio-Rad Protein II染液測定樣品的蛋白濃度(參照產(chǎn)品說明書進行)。
⑦參照Jefferson等(1987)所述的方法計算GUS的比活性，單位為pmol 4-MU/min.mg可溶性總蛋白。
結(jié)果如圖1所示，表明轉(zhuǎn)陰性對照pN的胡蘿卜直根中GUS的活性是2.7pmolMU/mg protein/min，轉(zhuǎn)陽性對照pINT121的胡蘿卜直根中GUS的活性是21.9pmolMU/mg protein/min，轉(zhuǎn)pES的胡蘿卜直根中De-InvP驅(qū)動表達的GUS的活性是49.3pmol MU/mg protein/min，轉(zhuǎn)pS1的胡蘿卜直根中2.7kb長啟動子InvP驅(qū)動表達的GUS的活性是16.7pmol MU/mg protein/min，De-InvP的活性是2.7kb長啟動子InvP的2.95倍。
(4)組織染色法證明轉(zhuǎn)化酶啟動子的組織特異性1mM X-Gluc測定緩沖液

(4℃避光保存)。
步驟1)用100mM磷酸緩沖液(pH7.0)并加入100ug/ml的chloramphenicol或500ug/ml的carbenicillin漂洗真空滲透法轉(zhuǎn)化后的植物組織。
2)浸入X-Gluc測定緩沖液，抽真空3-5分鐘后37℃反應8小時。
3)用70％乙醇37℃脫色。
4)將脫色完畢的材料置于含10％甘油的水滴中，壓上蓋玻片。
5)顯微鏡(Olympus，BX51)或解剖鏡(Olympus，SZX9)觀察并照相。
結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化pES和pS1的胡蘿卜中，轉(zhuǎn)化酶啟動子De-InvP和InvP驅(qū)動GUS在胡蘿卜直根中特異表達(圖2A)；而在轉(zhuǎn)pINT121的胡蘿卜中，CaMV 35S啟動子驅(qū)動GUS在胡蘿卜的葉、莖和直根中組成型表達(圖2B)。
序列表<160>3<210>1<211>404<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tttacaatta ccaagaggct ctctataatt cacttacgga aatacaatgc cgacaacttt 60gacgatgtaa agataaattt ggcactaacg caaacttaat taacattact atattagtat120tattggagaa cgttggcatg aacggatcct acaattacca agaggctctc tataattcac180ttacggaaat acaatgccga caactttgac gatgtaaaga taaatttggc actaacgcaa240acttaattaa cattactata ttagtattat tggagaacgt tggcatgaac aagcatgtaa300taataggata gtatgatctc tacatccaca tgtacctcta tatatataga tgctcttttg360tagtgttaat tcacattatc atacacacat tcttcatata atta 404<210>2<211>2766<212>DNA<213>胡蘿卜(Daucus Linn)<220>
<223>
<400>2gtcgactccc acatagcaat ctataactac ctttgtttgc aacaattttt atttttttta 60atactatata aaccatcttc acttatcgtt gcagaagaac ggcaccactg agttagaaat120caagcaagag aactatcacc agagaggagg ggagttgtgg tattgagaga gaggaggttg180tgtttagatg atccaaaatc ctacaatcta tagggttatt tataggtgca gagagacttg240tgtgctactc tttcccataa ttaaataatc tgaaacaaaa tcagattaaa actttcaaac300tattatattc cataaataat ctgaaataaa atcagattct gaaacttgct tctaatatat360ccgaaactta aaaaggtagt tttaattttt gatatttttc atccaaaaat tccagaaaat420tagaaaaata gaatggagcg atgtgagagg cgccacctac acgcccctcg cttctctttt480atataaataa attaaataat ctgaaacaaa atcagattaa aactttcaaa ctactatatt540tcataaataa tttgaaataa aatcagattc tgaaacttcc ttctaatata tccgaaactt600
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<213>人工序列<220>
<223>
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權(quán)利要求
1.胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1雜交的核苷酸序列；3)與序列表中的SEQ ID №1具有90％以上同源性且可驅(qū)動基因在胡蘿卜直根中表達的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于所述胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于所述胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子在植物基因工程中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述應用為在胡蘿卜直根中表達外源蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子及其應用。本發(fā)明的胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1雜交的核苷酸序列；3)與序列表中的SEQ ID №1具有90％以上同源性且可驅(qū)動基因在胡蘿卜直根中表達的DNA序列。本發(fā)明的胡蘿卜液泡轉(zhuǎn)化酶II基因啟動子可在胡蘿卜直根中特異表達外源基因，且具有較高的生物活性，可用于在胡蘿卜直根中表達外源蛋白。
文檔編號C12N15/82GK1831129SQ20061006516
公開日2006年9月13日 申請日期2006年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月23日
發(fā)明者陳曉英, 于翠梅, 方榮祥 申請人:中國科學院微生物研究所