專利名稱：：抑制Bax基因表達(dá)的siRNA和表達(dá)載體及其作為乙型病毒性肝炎治療藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種siRNA及其應(yīng)用，特別是涉及抑制Bax基因表達(dá)的siRNA和表達(dá)載體及其作為乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎治療藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病，特別是在中國(guó)最為常見(jiàn)，發(fā)病率高，且呈持續(xù)高流行態(tài)勢(shì)，其不僅直接影響人群的健康，甚至還危及人的生命安全，嚴(yán)重影響了人們的生產(chǎn)、生活、工作和學(xué)習(xí)，所造成的直接和間接的經(jīng)濟(jì)損失難以估量。在我國(guó)法定報(bào)告的傳染病中，多年來(lái)乙型病毒性肝炎的發(fā)病數(shù)和發(fā)病率一直高居前列，2005年國(guó)家將乙型病毒性肝炎列為四大重點(diǎn)防治的傳染病。2006年2月13日衛(wèi)生部發(fā)布了“十一五”全國(guó)乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃，該規(guī)劃分析了乙型病毒性肝炎在我國(guó)的流行現(xiàn)狀1992-1995年全國(guó)病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)人群乙肝病毒感染率為57.6％，乙肝病毒攜帶率為9.75％，據(jù)此推算全國(guó)有6.9億人曾感染過(guò)乙肝病毒，其中1.2億人長(zhǎng)期攜帶乙肝病毒。據(jù)專家估計(jì)，目前全國(guó)慢性乙肝病患者約有2,000萬(wàn)人，每年有約35萬(wàn)人死于慢性乙肝相關(guān)疾病。乙型病毒性肝炎給病人、家庭、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)不容忽視的影響，是許多家庭因病致貧、因病返貧的重要原因，同時(shí)也引發(fā)出一系列社會(huì)問(wèn)題，是我國(guó)現(xiàn)階段最為突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。乙型病毒性肝炎的臨床表現(xiàn)多樣化，以重癥型肝炎和慢性肝炎最為突出。重癥型乙型肝炎包括急性重癥性肝炎(暴發(fā)性肝炎)、亞急性重癥性肝炎(亞急性肝壞死)和慢性重癥性肝炎，極易發(fā)展成壞死性肝硬化，預(yù)后極差，病死率高達(dá)60-70％以上。盡管到目前為止，HBV的確切致病機(jī)制尚存在爭(zhēng)議，但已有研究證實(shí)，HBV感染所致肝細(xì)胞凋亡失衡不僅是乙肝患者肝細(xì)胞損傷的重要分子機(jī)制之一，而且在乙肝患者不同的預(yù)后、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著不容忽視的、甚至是決定性的作用。研究表明，機(jī)體通過(guò)凋亡方式清除HBV感染肝細(xì)胞的速度和程度與疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。若機(jī)體凋亡反應(yīng)適度，感染細(xì)胞及時(shí)凋亡并且凋亡小體被有效清除，則呈一過(guò)性感染，患者痊愈；若機(jī)體凋亡反應(yīng)過(guò)弱，不能啟動(dòng)有效的凋亡反應(yīng)，則病毒感染持續(xù)存在，病變演變?yōu)闊o(wú)癥狀攜帶狀態(tài)或者進(jìn)一步發(fā)展成為慢性肝炎；若機(jī)體啟動(dòng)的凋亡反應(yīng)發(fā)生過(guò)于迅速但不能及時(shí)地清除凋亡小體，則可激發(fā)了過(guò)強(qiáng)的淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的炎癥壞死反應(yīng)，引發(fā)急性甚至爆發(fā)性肝炎，嚴(yán)重者危及生命或者進(jìn)一步演化為慢性肝炎。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種凋亡分子(如FasL/Fas，TRAIL/DR4/DR5等)參與了HBV感染所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡機(jī)制，其信號(hào)通路已經(jīng)比較明確死亡受體通過(guò)其胞外區(qū)與凋亡配體結(jié)合并活化后，其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域相互聚集，并進(jìn)一步通過(guò)同嗜作用募集接頭蛋白TRADD/FADD。TRADD/FADD接收到死亡受體傳遞的凋亡信號(hào)后，將引起胞內(nèi)caspase8的前體，即procaspase8在其末端的局部募集和串聯(lián)結(jié)合，從而形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)。DISC形成后，其分子中的procaspase8通過(guò)自身水解而成為有活性的caspase8，隨后經(jīng)線粒體依賴性和線粒體非依賴性兩條途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡。(1)線粒體非依賴性途徑Caspase8活化后能夠引發(fā)蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步鏈?zhǔn)剿饧せ钇湎掠蔚耐疵?，如caspase6、7等，最后激活caspase3，活化的caspase3作用于其效應(yīng)物而引發(fā)細(xì)胞凋亡；(2)線粒體依賴性途徑活化的caspase8切割胞漿中的Bid，形成tBid而轉(zhuǎn)位到線粒體，同時(shí)引起B(yǎng)ax和Bak的同體寡聚化，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，最終引起細(xì)胞色素c、AIF、Smac/DIABLO等促凋亡因子的釋放，并形成凋亡酶體，活化caspase9，最后激活caspase3而誘發(fā)凋亡。Bax蛋白(Bcl-2-associatedprotein)為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族促凋亡成員，具有BH1、BH2、BH3結(jié)構(gòu)域。在正常組織細(xì)胞中，Bax蛋白以無(wú)活性的單體形式存在于胞漿中。受凋亡信號(hào)刺激時(shí)，tBid分子可結(jié)合胞漿中Bax蛋白，使其構(gòu)象發(fā)生變化、形成寡聚體，而被活化。Bax蛋白活化后，轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體并以寡聚體的形式插入線粒體外膜，通過(guò)多種不同的機(jī)制(自身形成通道、打開(kāi)線粒體通透性轉(zhuǎn)位孔等)影響線粒體外膜的通透性，釋放細(xì)胞色素C(CytochromeC)，激活下游通路分子。因此，Bax蛋白在凋亡通路的線粒體依賴途徑和線粒體非依賴途徑之間的對(duì)話中發(fā)揮關(guān)鍵性的“橋梁”作用。研究證實(shí)，HBV全基因組、HBx基因片段的表達(dá)可提高肝癌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平；HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性乙型肝炎模型中亦存在Bax表達(dá)水平的上調(diào)。RNAi技術(shù)就是利用雙鏈RNA(Double-strandedRNA)誘導(dǎo)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，通過(guò)將雙鏈RNA降解成長(zhǎng)度為21～23nt的小干擾RNA片段(siRNA)，最終介導(dǎo)靶基因mRNA的降解。siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一核苷酸的錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致RNAi效應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性的選擇性基因沉寂具有重要的藥理作用。RNAi技術(shù)一經(jīng)建立，即被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究當(dāng)中，如基因功能研究、基因的表達(dá)機(jī)制及基因間的相互關(guān)系。2001年5月和2001年12月，德國(guó)科學(xué)家Elabshir、Harborth和Tuschl等人在《Nature》和《J.CellSci.》上相繼發(fā)表了用RNAi技術(shù)分別使哺乳類細(xì)胞中16個(gè)基因表達(dá)水平降低或沉默，從而證明RNAi對(duì)哺乳類細(xì)胞也起作用，這使得這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于治療某些由于特定基因表達(dá)過(guò)多引起的疾病，如癌基因的過(guò)度表達(dá)引起的癌癥成為可能[參見(jiàn)ElbashirSM，HarborthJ，LendeckelW，etal.Duplexesof21±nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.NATURE，2001，411(6836)494-497.和HarborthJ，ElbashirSM，BechertK，etal.IdentificationofessentialgenesinculturedmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs.JCellSci，2001，114(24)4557-4565.]。目前，獲得siRNA有很多種方法，主要包括化學(xué)合成法，體外轉(zhuǎn)錄和酶消化法以及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法。針對(duì)Bax基因的siRNA也已被應(yīng)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中。2003年8月，Ray等利用化學(xué)合成法制備了特異性針對(duì)人Bax基因的siRNA序列(人BaxmRNA的第209～229位)，反向證實(shí)Bax基因表達(dá)的上調(diào)在拓?fù)洚悩?gòu)酶增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞系C4-2對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡敏感性中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用[參見(jiàn)RaySandAlmasanA.ApoptosisInductioninProstateCancerCellsandXenograftsbyCombinedTreatmentwithApo2Ligand/TumorNecrosisFactor-relatedApoptosis-inducingLigandandCPT-11.CANCERRESEARCH，2003；634713-4723]。2005年1月，Kim等同樣利用化學(xué)合成法制備了特異性針對(duì)小鼠Bax基因的siRNA序列(小鼠BaxmRNA的第217～237位)，抑制小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)，可延長(zhǎng)其存活時(shí)間，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能，激活其抗腫瘤效應(yīng)[參見(jiàn)KimTW，LeeJH，HeL，etal.ModificationofProfessionalAntigen-PresentingCellswithSmallInterferingRNAInvivotoEnhanceCancerVaccinePotency.CancerRes2005；65(1)309-16.]。在上述報(bào)道的諸項(xiàng)對(duì)人、小鼠Bax基因siRNA的研究中，均使用了化學(xué)合成的方法直接合成了Bax基因的siRNA序列，進(jìn)行了凋亡分析相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，雖然取得了很好的抑制Bax基因表達(dá)的效果，但是化學(xué)合成的siRNA序列在較短時(shí)間內(nèi)即可被降解，不適應(yīng)于長(zhǎng)期研究(尤其是體內(nèi)實(shí)驗(yàn))，因此在應(yīng)用上受到了一定的限制，而shRNA表達(dá)載體通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA，延長(zhǎng)了siRNA的作用時(shí)間，目前已被廣泛應(yīng)用。急性重癥性乙型肝炎(暴發(fā)性肝炎)的發(fā)生與肝細(xì)胞的過(guò)度凋亡密切相關(guān)，利用針對(duì)Bax基因的shRNA表達(dá)載體，抑制Bax基因的表達(dá)，阻斷凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，可減輕肝細(xì)胞損傷程度，從而改善病人的預(yù)后。經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢索查新，利用Bax基因的shRNA表達(dá)載體作為乙型病毒性肝炎治療藥物，通過(guò)阻斷或封閉Bax的表達(dá)來(lái)降低肝細(xì)胞凋亡，減輕肝細(xì)胞損傷的研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種抑制人、小鼠Bax基因表達(dá)的siRNA及其針對(duì)Bax基因的shRNA表達(dá)載體，并且進(jìn)一步提供了Bax基因的shRNA表達(dá)載體作為乙型病毒性肝炎保肝治療藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所述的特異性抑制人Bax基因表達(dá)的siRNA，其特征是正義鏈核苷酸序列如SEQID№1所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№2所示；作用部位是作用于人BaxmRNA的第382～400位。本發(fā)明所述的特異性針對(duì)人Bax基因的shRNA表達(dá)載體，其特征是所述shRNA表達(dá)載體命名為pBax382-Si，其出發(fā)載體為pSilencer3.1-H1neo；所述shRNA表達(dá)載體的shRNA序列包含權(quán)利要求1所述的編碼序列及發(fā)夾結(jié)構(gòu)、中間一段loop環(huán)、3’端6個(gè)dT修飾、5’端和3’端的酶切位點(diǎn)；其中正義鏈核苷酸序列如SEQID№3所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№4所示。構(gòu)建上述人Bax基因shRNA表達(dá)載體的詳細(xì)描述根據(jù)人BaxmRNA序列(GenBank號(hào)GI388165)，從ATG后開(kāi)始尋找AA+N19序列(其中N19為任意19個(gè)mRNA核苷酸序列)，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇第382～400位的基因序列作為靶序列，將該序列通過(guò)BLAST證實(shí)EST基因庫(kù)靶向作用的基因是唯一的。設(shè)計(jì)包含上述靶序列及發(fā)夾結(jié)構(gòu)、中間一段loop環(huán)、3’端有6個(gè)dT修飾、5’端和3’端的酶切位點(diǎn)的shRNA序列，序列結(jié)構(gòu)為+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+通過(guò)機(jī)器合成兩條互補(bǔ)的上述shRNA序列(正義鏈為序列表中的SEQID№3，反義鏈為序列表中的SEQID№4)。合成的兩條互補(bǔ)siRNA序列通過(guò)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，再將其與經(jīng)相同酶切(BamHI+HindIII)的shRNA表達(dá)載體pSilencer3.1-H1neo(購(gòu)自Ambion公司)連接。重組子經(jīng)DNA測(cè)序(見(jiàn)附圖1)鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pBax382-Si(見(jiàn)附圖2)。其中，上述的載體pSilencer3.1-H1neo(購(gòu)自Ambion公司)用于在人類組織細(xì)胞中表達(dá)siRNA序列，長(zhǎng)約4.3kb，包含典型的人H1型RNA聚合酶III(polIII)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可在距其一定距離的位置起始轉(zhuǎn)錄，遇到4～5個(gè)連續(xù)的T后終止轉(zhuǎn)錄。供shRNA片段插入的多克隆位點(diǎn)(BamHI和HindIII)位于polIII啟動(dòng)子下游。該載體尚具有由SV40啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的新霉素篩選標(biāo)記(neo)，可供篩選穩(wěn)定表達(dá)小干擾RNA的宿主細(xì)胞。此外，在polIII啟動(dòng)子上游，包含測(cè)序引物M13F(-40)，便于對(duì)目的siRNA片段的測(cè)序。首先化學(xué)合成一段編碼siRNA正義鏈(sense)和反義鏈(antisense)的模板，正義與反義序列之間由一段環(huán)序列隔開(kāi)，插入載體PolIII啟動(dòng)子下游，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，環(huán)序列可使轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈折疊，形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA分子，這些小RNA可被細(xì)胞內(nèi)的Dicer切割成長(zhǎng)為21bp的siRNA，引起特定基因沉默。本發(fā)明所述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制人類組織細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所述shRNA表達(dá)載體作為有效抑制凋亡刺激信號(hào)所誘導(dǎo)的HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞凋亡的藥物的應(yīng)用。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和驗(yàn)證本發(fā)明所述Bax基因shRNA表達(dá)載體的作用效果，下面以藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來(lái)進(jìn)一步闡明。人Bax基因shRNA表達(dá)載體抑制HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)將上述構(gòu)建的Bax基因shRNA表達(dá)載體pBax382-Si以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式瞬時(shí)轉(zhuǎn)染高表達(dá)Bax基因的BEL7402-HBx細(xì)胞，同時(shí)以pSilencer3.1-H1neo空載體轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照，72h后RT-PCR、熒光定量PCR、WesternBlot檢測(cè)Bax表達(dá)的mRNA水平、蛋白質(zhì)水平。RT-PCR電泳結(jié)果見(jiàn)附圖3，光密度軟件分析各片段光密度值，并計(jì)算BaxmRNA水平的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(見(jiàn)附圖4)，結(jié)果顯示，pBax382-Si轉(zhuǎn)染組細(xì)胞BaxmRNA的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P＜0.01)。熒光定量PCR結(jié)果顯示(見(jiàn)表1)，pBax382-Si轉(zhuǎn)染組細(xì)胞BaxmRNA的表達(dá)水平較BEL7402-HBx細(xì)胞下降67％。WesternBlot結(jié)果見(jiàn)附圖5，光密度軟件分析各片段光密度值，并計(jì)算Bax蛋白水平的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(見(jiàn)附圖6)，結(jié)果顯示，pBax382-Si轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P＜0.01)。表1RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞BaxmRNA的表達(dá)水平其中，上述的肝癌細(xì)胞株BEL7402-HBx為將HBV基因片段----HBx的表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BEL7402細(xì)胞[參見(jiàn)LiangXH，SunWS，GaoLF，etal.HepatitisBvirusXproteinmodulatestheapoptosisofhepatomacelllineinducedbyTRAIL.ScienceinChina(Englishversion)，48(3)277-286.]。該細(xì)胞株較母本細(xì)胞BEL7402表達(dá)更高水平的Bax基因(與HBV全基因組轉(zhuǎn)染的作用相類似)，對(duì)TRAIL介導(dǎo)的凋亡刺激信號(hào)有更高的敏感性。人Bax基因shRNA表達(dá)載體有效抑制凋亡刺激信號(hào)所誘導(dǎo)的HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)將上述構(gòu)建的Bax基因shRNA表達(dá)載體pBax382-Si以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式瞬時(shí)轉(zhuǎn)染高表達(dá)Bax基因的BEL7402-HBx細(xì)胞，72h后加入10ng/ml重組TRAIL蛋白(購(gòu)自PeproTech公司)，TUNEL流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化情況。TUNEL流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)附圖7)，Bax基因shRNA表達(dá)載體pBax382-Si通過(guò)抑制Bax基因的表達(dá)，可顯著下調(diào)TRAIL誘導(dǎo)的BEL7402-HBx細(xì)胞的凋亡率。pBax382-Si轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為17.8％±4.5％，顯著低于BEL7402-HBx細(xì)胞(43％±5.4％)(P＜0.05)，接近BEL7402細(xì)胞的凋亡率(12.6％±2.7％)(P＞0.05)，而pSilencer3.1-H1neo轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(43％±2.4％)與BEL7402-HBx細(xì)胞無(wú)顯著差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明，利用人Bax基因shRNA表達(dá)載體抑制Bax基因的表達(dá)，可有效抑制凋亡刺激信號(hào)所誘導(dǎo)的HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明所述人Bax基因shRNA表達(dá)載體的作用效果，本發(fā)明同時(shí)提供了一種特異性抑制小鼠Bax基因表達(dá)的siRNA及其針對(duì)Bax基因的shRNA表達(dá)載體，并且利用藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來(lái)進(jìn)一步闡述了其降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠乙型病毒性肝炎模型中肝細(xì)胞凋亡，減輕肝細(xì)胞損傷，抗炎保肝的作用。本發(fā)明所述的特異性抑制小鼠Bax基因表達(dá)的siRNA，其特征是正義鏈核苷酸序列如SEQID№5所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№6所示；作用部位是作用于小鼠BaxmRNA的第451～469位。本發(fā)明所述的特異性針對(duì)小鼠Bax基因的shRNA表達(dá)載體，其特征是所述shRNA表達(dá)載體命名為pmU6-Bax451，其出發(fā)載體為pmU6pro；所述shRNA表達(dá)載體的shRNA序列包含權(quán)利要求6所述的編碼序列及發(fā)夾結(jié)構(gòu)、中間一段loop環(huán)、3’端5個(gè)dT修飾、5’端和3’端的酶切位點(diǎn)；其中正義鏈核苷酸序列如SEQID№7所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№8所示。構(gòu)建上述小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體的詳細(xì)描述根據(jù)小鼠BaxmRNA序列(GenBank號(hào)GI388191)，從ATG后開(kāi)始尋找AA+N19序列(其中N19為任意19個(gè)mRNA核苷酸序列)，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇第451～469位的基因序列作為靶序列，將該序列通過(guò)BLAST證實(shí)EST基因庫(kù)靶向作用的基因是唯一的。設(shè)計(jì)包含上述靶序列及發(fā)夾結(jié)構(gòu)、中間一段loop環(huán)、3’端有6個(gè)dT修飾及5’端和3’端的酶切位點(diǎn)的shRNA序列，序列結(jié)構(gòu)為+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+通過(guò)機(jī)器合成兩條互補(bǔ)的上述shRNA序列(正義鏈為序列表中的SEQID№7，反義鏈為序列表中的SEQID№8)。合成的兩條互補(bǔ)siRNA序列通過(guò)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，再將其與經(jīng)相同酶切(BbsI+XbaI)的shRNA表達(dá)載體pmU6pro連接。重組子經(jīng)DNA測(cè)序(見(jiàn)附圖8)鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pmU6-Bax451(見(jiàn)附圖9)。其中，上述的載體pmU6pro[參見(jiàn)YuJY，DeRuiterSL，TurnerDL.RNAinterferencebyexpressionofshort-interferingRNAsandhairpinRNAsinmammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA.2002Apr30；99(9)6047-52.]，用于在小鼠組織細(xì)胞中表達(dá)siRNA序列，長(zhǎng)約4.1kb，包含典型的小鼠U6型RNA聚合酶III(polIII)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可在距其一定距離的位置起始轉(zhuǎn)錄，遇到4～5個(gè)連續(xù)的T后終止轉(zhuǎn)錄。供siRNA片段插入的多克隆位點(diǎn)(BbsI和XbaI)位于polIII啟動(dòng)子下游。在shRNA片段下游，存在SV40pA加尾信號(hào)，氨芐青霉素抗性基因amp和原核細(xì)胞啟動(dòng)子f1origin。此外，在polIII啟動(dòng)子上游，包含測(cè)序引物f1F，便于對(duì)目的shRNA片段的測(cè)序。首先化學(xué)合成一段編碼siRNA正義鏈(sense)和反義鏈(antisense)的模板，正義與反義序列之間由一段環(huán)序列隔開(kāi)，插入載體PolIII啟動(dòng)子下游，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，環(huán)序列可使轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈折疊，形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA分子，這些小RNA可被細(xì)胞內(nèi)的Dicer切割成長(zhǎng)為21bp的siRNA，引起特定基因沉默。上述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制小鼠各組織細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。上述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝炎模型中肝細(xì)胞Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。上述shRNA表達(dá)載體作為有效降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝炎模型中肝細(xì)胞的凋亡，減輕肝細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用。藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果證明急性乙型病毒性肝炎小鼠動(dòng)物模型的制備經(jīng)QIAGEN質(zhì)粒大量提取試劑盒純化重組質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1[參見(jiàn)張秋，孫汶生，高立芬等.TRAIL誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞BEL-7402凋亡的作用及機(jī)制研究.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2005；25(5)357-362。]，以生理鹽水調(diào)整濃度為20～50μg/ml。實(shí)驗(yàn)用小鼠為SPF級(jí)BALB/c小鼠，4～6周齡，雄性，體重18～22g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)條件按照SPF級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。尾靜脈高壓注射先將所述小鼠置于高溫環(huán)境，使尾靜脈擴(kuò)張；注射前用乙醚麻醉，觀察小鼠反射情況；5秒內(nèi)將1.4～2.0ml重組質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1液體經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)，小鼠置于25～28℃環(huán)境中觀察。成功經(jīng)尾靜脈高壓注射重組質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1后；經(jīng)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(見(jiàn)附圖10)、乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)測(cè)定(見(jiàn)附圖11)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HBVDNA(見(jiàn)附圖12)以及肝臟病理(見(jiàn)附圖13)等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示尾靜脈高壓注射pcDNA3-HBV1.1后的小鼠血清ALT在8小時(shí)達(dá)到800u，24小時(shí)為350u；HBsAg、HBeAg第1天最高，主要表達(dá)HBsAg，可達(dá)1.5，以后逐漸下降，7天后消失；血清中檢測(cè)到HBVDNA；肝臟組織切片顯示病毒性肝炎病理改變。以上結(jié)果證實(shí)小鼠急性乙型病毒肝炎動(dòng)物模型建立成功。小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體有效抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝炎模型中肝細(xì)胞Bax基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)經(jīng)QIAGEN質(zhì)粒大量提取試劑盒純化重組質(zhì)粒pmU6-Bax451或空載體pmU6，以生理鹽水調(diào)整濃度為20～50μg/ml。尾靜脈高壓注射先將所述SPF級(jí)BALB/c小鼠置于高溫環(huán)境，使尾靜脈擴(kuò)張；注射前用乙醚麻醉，觀察小鼠反射情況；5秒內(nèi)將1.4～2.0ml重組質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1與重組質(zhì)粒pmU6-Bax451或空載體pmU6液體的混合液經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)。48h后，處死小鼠，WesternBlot檢測(cè)肝組織Bax基因的表達(dá)情況，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，肝組織TUNEL染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況。WesternBlot結(jié)果見(jiàn)附圖14，光密度軟件分析各片段光密度值，并計(jì)算BaxmRNA水平的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(見(jiàn)附圖15)，結(jié)果顯示，pmU6-Bax451載體治療組小鼠，肝組織Bax蛋白的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組小鼠(P＜0.01)。血清ALT水平達(dá)92±8U/L(見(jiàn)附圖16)，AST水平達(dá)127±14U/L(見(jiàn)附圖17)，顯著低于模型組小鼠(P＜0.01)。TUNEL染色結(jié)果顯示，pmU6-Bax451載體治療組小鼠肝細(xì)胞凋亡率為17.1±3.6％，顯著低于模型組小鼠29±6.7％(見(jiàn)附圖18)。利用本發(fā)明所述的抑制人、小鼠Bax基因表達(dá)的siRNA及其針對(duì)Bax基因的shRNA表達(dá)載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明本發(fā)明所述的人Bax基因的shRNA表達(dá)載體可有效抑制人類組織細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)，特別是HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞中Bax基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，并且可以明顯降低凋亡刺激信號(hào)所誘導(dǎo)的HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的凋亡水平。本發(fā)明所述的小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體可有效抑制小鼠組織細(xì)胞中Bax基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，明顯減輕了急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝臟炎癥，具體表現(xiàn)在血清ALT、AST水平降低。通過(guò)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體治療組肝細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組。這一結(jié)果表明，Bax基因在HBV感染后引起的肝細(xì)胞凋亡中起重要作用，Bax基因shRNA表達(dá)載體通過(guò)抑制肝細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用。同時(shí)，本發(fā)明利用shRNA表達(dá)載體在體內(nèi)進(jìn)一步表達(dá)siRNA的方法，不僅避免了化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法等技術(shù)所存在的siRNA易降解，操作技術(shù)難度高等缺陷，而且可以成功實(shí)現(xiàn)siRNA在體內(nèi)長(zhǎng)期、持續(xù)表達(dá)的作用效果。此外，本發(fā)明通過(guò)尾靜脈高壓注射的方法，使Bax基因shRNA表達(dá)載體相對(duì)特異地在肝臟中表達(dá)，在最大程度上降低了對(duì)其它組織器官的影響。因此，Bax基因shRNA表達(dá)載體將在制備治療乙型病毒性肝炎特別是急性重癥乙型病毒性肝炎的藥物中有很大的應(yīng)用價(jià)值，具有極其誘人的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。圖1人Bax基因shRNA表達(dá)載體pBax382-Si的測(cè)序圖譜。圖2人Bax基因shRNA表達(dá)載體pBax382-Si的物理圖譜。圖3RT-PCR檢測(cè)人Bax基因shRNA表達(dá)載體抑制肝癌細(xì)胞BaxmRNA的表達(dá)情況。其中1為未轉(zhuǎn)染BEL7402-HBx細(xì)胞；2為pSilencer3.0轉(zhuǎn)染組細(xì)胞；3為pBax382-Si轉(zhuǎn)染組細(xì)胞。圖4經(jīng)光密度軟件分析得出的各組細(xì)胞BaxmRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。圖5WesternBlot檢測(cè)人Bax基因shRNA表達(dá)載體抑制肝癌細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)情況。其中1為未轉(zhuǎn)染BEL7402-HBx細(xì)胞；2為pSilencer3.0轉(zhuǎn)染組細(xì)胞；3為pBax382-Si轉(zhuǎn)染組細(xì)胞。圖6經(jīng)光密度軟件分析得出的各組細(xì)胞Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。圖7TUNEL流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑制Bax基因的表達(dá)對(duì)凋亡刺激信號(hào)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。圖8小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體pmU6-Bax451的測(cè)序圖譜。圖9小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體pmU6-Bax451的物理圖譜。圖10血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定結(jié)果圖11ELISA檢測(cè)HBV抗原(HBsAg、HBeAg)圖12實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HBVDNA含量圖13肝臟組織切片HE染色觀察病理變化可見(jiàn)肝組織彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；肝細(xì)胞呈氣球樣變，部分細(xì)胞有壞死表現(xiàn)圖14WesternBlot檢測(cè)小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體抑制小鼠肝組織Bax蛋白的表達(dá)情況。其中1為急性乙型肝炎模型組；2為pmU6-Bax451聯(lián)合注射組；3為pmU6pro聯(lián)合注射組。圖15經(jīng)光密度軟件分析得出的各組細(xì)胞Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。其中1為急性乙型肝炎模型組；2為pmU6-Bax451聯(lián)合注射組；3為pmU6pro聯(lián)合注射組。圖16小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體對(duì)血清ALT水平的影響其中1為對(duì)照組小鼠；2為急性乙型肝炎模型組；3為pmU6-Bax451聯(lián)合注射組；4為pmU6pro聯(lián)合注射組。圖17小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體對(duì)血清AST水平的影響其中1為對(duì)照組小鼠；2為急性乙型肝炎模型組；3為pmU6-Bax451聯(lián)合注射組；4為pmU6pro聯(lián)合注射組。圖18TUENL流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡結(jié)果其中1為對(duì)照組小鼠；2為急性乙型肝炎模型組；3為pmU6-Bax451聯(lián)合注射組；4為pmU6pro聯(lián)合注射組。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1人Bax基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建1)針對(duì)Bax基因小干擾RNA序列的設(shè)計(jì)根據(jù)小干擾RNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了針對(duì)Bax基因的小干擾RNA序列。序列結(jié)構(gòu)為BamHI+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+HindIII，具體序列參見(jiàn)序列表(正義鏈為序列表中的SEQID№3，反義鏈為序列表中的SEQID№4)。2)小干擾RNA載體的構(gòu)建a.退火取以上配制好的小干擾序列各1μL，將相應(yīng)的正義鏈和反義鏈混合在同一Ep管中，加入退火緩沖液，使終體積達(dá)50μL。退火條件如下95℃4min→70℃10min→緩慢冷卻至4℃b.目的片段的磷酸化取以上退火產(chǎn)物進(jìn)行磷酸化修飾，反應(yīng)體系如下退火產(chǎn)物2μLT4磷酸激酶1μL10×Buffer1μL10mMATP1μL滅菌雙蒸水5μL總體積10μL以上體系在37℃水浴中，反應(yīng)30min。70℃，10min滅活磷酸激酶。c.載體的線性化、去磷酸化和回收pSilencer3.1-H1neo經(jīng)HindIII、BamHI雙酶切(37℃，3h)后，進(jìn)行去磷酸化修飾(37℃，1h)。反應(yīng)體系如下雙酶切體系pSilencer3.1-H1neo60μL10×KBuffer10μLHindIII5μLBamHI5μL去離子雙蒸水20μL總體積100μL去磷酸化修飾酶切產(chǎn)物100μL小牛腸堿性磷酸酶2μL10×Buffer12μL去離子雙蒸水6μL總體積120μL以上去磷酸化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(75V，1h)，并以試劑盒回收線性化載體片段，回收產(chǎn)物終體積為10μL。d.目的片段與載體的連接利用上述經(jīng)磷酸化的目的基因片段和去磷酸化的載體片段，建立如下連接反應(yīng)體系載體片段6μL目的基因片段10μL10×LigationBuffer2μLT4DNA連接酶2μL總體積20μL連接反應(yīng)在12℃下進(jìn)行，16～20h后，70℃水浴10min滅活連接酶，終止連接反應(yīng)。e.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以大腸桿菌DH5α為宿主菌，利用CaCl2法并將上述滅活連接酶的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入處于感受態(tài)的宿主菌內(nèi)，涂菌平皿于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)12～16h。3)陽(yáng)性重組載體的鑒定DNA測(cè)序鑒定重組子相應(yīng)菌種送至上海博亞公司進(jìn)行DNA自動(dòng)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)附圖1)通過(guò)Blast軟件與設(shè)計(jì)序列相比對(duì)。陽(yáng)性重組子測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)序列完全同源，命名為pBax382-Si(見(jiàn)附圖2)。實(shí)施例2人Bax基因shRNA表達(dá)載體可有效抑制HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)。利用QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒分別提取高純度的重組載體pBax382-Si和空載體pSilencer3.1-H1neo。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，BEL7402-HBx單細(xì)胞懸液以1.5×105個(gè)/孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板上，每孔0.5mL培養(yǎng)液，37℃、5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，達(dá)85％～90％匯片。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectmineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(具體步驟見(jiàn)第一節(jié))。每種質(zhì)粒設(shè)2個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)化對(duì)照組。37℃、5％CO2培養(yǎng)6～8h，更換為含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72h(期間每隔24h更換一次培養(yǎng)液)。半定量RT-PCR(引物序列、退火溫度見(jiàn)表2)、熒光定量PCR、WesternBlot檢測(cè)Bax基因的表達(dá)變化。表2Bax基因PCR引物序列及退火溫度<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="706">引物序列產(chǎn)物長(zhǎng)度退火溫度BaxF5’-TGGAGCTGCAGAGGATGATTG-3’R5’-CCCAGTTGAAGTTGCCGTC-3’101bp60℃</table></tables>熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下a.50μLPCR反應(yīng)體系cDNA5μL10×Buffer25μL上游引物(10μM)2μL下游引物(10μM)2μL滅菌雙蒸水16μL總體積50μLb.PCR反應(yīng)條件結(jié)果顯示，該shRNA表達(dá)載體可有效抑制Bax基因mRNA水平(見(jiàn)附圖3和附圖4，表1)和蛋白水平的表達(dá)(見(jiàn)附圖5和附圖6)。實(shí)施例3人Bax基因shRNA表達(dá)載體有效抑制凋亡刺激信號(hào)所誘導(dǎo)的HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞凋亡。脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式將高純度的質(zhì)粒pBax382-Si，pSilencer3.1-H1neo轉(zhuǎn)染BEL7402-HBx細(xì)胞，72h后，棄去原培養(yǎng)液，加入10ng/mLTRAIL蛋白，37℃、5％CO2培養(yǎng)24h。此外，以10ng/mLTRAIL蛋白作用BEL7402細(xì)胞，用于標(biāo)定Bax小干擾RNA逆轉(zhuǎn)凋亡效應(yīng)的程度。收集各組細(xì)胞(包括懸浮細(xì)胞)，采用TUNEL末端標(biāo)記法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示(見(jiàn)附圖7)，pBax382-Si轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為17.8％±4.5％，顯著低于BEL7402-HBx細(xì)胞(43％±5.4％)(P＜0.05)，接近BEL7402細(xì)胞的凋亡率(12.6％4±2.7％)(P＞0.05)，而pSilencer3.1-H1neo轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(43％±2.4％)與BEL7402-HBx細(xì)胞無(wú)顯著差異(P＞0.05)。實(shí)施例4小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建。針對(duì)Bax基因小干擾RNA序列的設(shè)計(jì)根據(jù)小干擾RNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了針對(duì)Bax基因的小干擾RNA序列。序列結(jié)構(gòu)為BbsI+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+XbaI，具體序列參見(jiàn)序列表(正義鏈為序列表中的SEQID№7，反義鏈為序列表中的SEQID№8)2)小干擾RNA載體的構(gòu)建合成上述設(shè)計(jì)的小干擾RNA序列，構(gòu)建小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體，具體步驟同前(人Bax基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建)，重組子相應(yīng)菌種送至上海博亞公司進(jìn)行DNA自動(dòng)測(cè)序(見(jiàn)附圖8)，測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast軟件與設(shè)計(jì)序列相比對(duì)，命名為pmU6-Bax451(見(jiàn)附圖9)。實(shí)施例5利用尾靜脈高壓注射法建立急性小鼠肝炎模型及其鑒定分別設(shè)立生理鹽水對(duì)照組、空載體pcDNA3注射組、重組質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1(即模型組)。每組小鼠為15只，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。(1)尾靜脈高壓注射先將所述小鼠置于高溫環(huán)境，使尾靜脈擴(kuò)張；注射前用乙醚麻醉，觀察小鼠反射情況；5秒內(nèi)將1.4～2.0ml生理鹽水、空載體pcDNA3或重組質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1液體經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)，小鼠置于25～28℃環(huán)境中觀察。(2)經(jīng)內(nèi)眥靜脈竇取血分別于模型建立的第1、4、7、10天將小鼠用乙醚麻醉，使用1ml注射器由內(nèi)眥靜脈竇取血0.2～0.5ml，常規(guī)離心，分離血清，-20℃保存，用于各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。(3)處死小鼠分別于模型建立的第1、4、7、10天將小鼠摘眼球取血、頸椎脫臼處死。分別取上述各組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟及胸腺，-80℃保存，備用。(4)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定利用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(ALT/AST，賴氏法，濰坊3V生物工程有限公司)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行樣品測(cè)定。樣品OD值超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍則將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。ALT檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)附圖10)模型組的ALT于8小時(shí)達(dá)到最高(820±138u)，以后逐漸降低，10天后降至正常范圍。生理鹽水對(duì)照組和空載體對(duì)照組ALT無(wú)顯著升高。(5)ELISA檢測(cè)HBV抗原、抗體表達(dá)水平利用HBsAg、HBeAg及相應(yīng)抗體的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，以酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)OD值。ELISA結(jié)果顯示(見(jiàn)附圖11)模型組小鼠血清HBsAg、HBeAg第1天最高，HBsAg可達(dá)1.5；以后逐漸下降，7天后消失。(6)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HBVDNA含量對(duì)照組組及模型組小鼠血清標(biāo)本，利用乙型肝炎病毒(HBV)熒光定量PCR試劑盒(上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司)檢測(cè)HBVDNA。首先標(biāo)本裂解(直接裂解法)取20μl裂解緩沖液加入0.5ml離心管后，再分別加入20μl血清標(biāo)本、陰性對(duì)照、臨界對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，混勻。沸水浴10分鐘，14000rpm離心10分鐘，取上清2μl做PCR反應(yīng)。設(shè)定如下程序55℃時(shí)收集熒光信號(hào)，以BIO-RADiCycler檢測(cè)熒光(美國(guó)伯樂(lè)公司)。每次試驗(yàn)均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，將曲線相關(guān)系數(shù)控制在0.99以上。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)附圖12)模型組小鼠于第1天HBVDNA的拷貝數(shù)高達(dá)2.67×105，第4天明顯下降至3.85×103，顯著高于HBV轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)制水平(P＜0.05)。(7)肝臟HE染色觀察病理變化各組小鼠肝臟組織進(jìn)行冰凍切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察模型組可見(jiàn)肝組織彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞呈氣球樣變，部分細(xì)胞有壞死表現(xiàn)；對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯病理變化(見(jiàn)附圖13)。實(shí)施例6小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體可有效抑制急性肝炎模型肝組織中Bax基因的表達(dá)。分別設(shè)立BalB/C小鼠對(duì)照組、急性乙型肝炎模型組、小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體治療組、空白shRNA表達(dá)載體對(duì)照組。每組小鼠數(shù)為15只，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，具體實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果詳述如下將SPF級(jí)BALB/c小鼠置于高溫環(huán)境，使尾靜脈擴(kuò)張；注射前用乙醚麻醉，觀察小鼠反射情況；5秒內(nèi)將1.4～2.0ml重組質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1與重組質(zhì)粒pmU6-Bax451或空載體pmU6液體的混合液經(jīng)尾靜脈勻速注射入小鼠體內(nèi)。48h后，處死小鼠，WesternBlot檢測(cè)肝組織Bax基因的表達(dá)情況。WesternBlot結(jié)果見(jiàn)附圖14，光密度軟件分析各片段光密度值，并計(jì)算BaxmRNA水平的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度(見(jiàn)附圖15)，結(jié)果顯示，pmU6-Bax451治療組小鼠，肝組織Bax蛋白的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組小鼠(P＜0.01)。實(shí)施例7小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體可有效降低小鼠急性肝炎模型中肝細(xì)胞的凋亡，減輕肝細(xì)胞損傷，達(dá)到抗炎保肝作用將實(shí)施例6中各組小鼠處死后，檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，肝組織TUNEL原位染色檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況。ALT、AST檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)附圖16和附圖17)小鼠Bax基因shRNA表達(dá)載體注射組乙型肝炎模型小鼠，血清ALT水平達(dá)92±8U/L，AST水平達(dá)127±14U/L，顯著低于模型組小鼠(P＜0.01)。TUNEL熒光染色原位檢測(cè)肝組織細(xì)胞凋亡情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡率利用TUNEL標(biāo)記試劑盒，分別將各組小鼠肝組織石蠟包埋切片和新鮮肝細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色，熒光顯微鏡觀察肝組織細(xì)胞凋亡情況，流式細(xì)胞儀測(cè)定肝細(xì)胞凋亡率。凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示(見(jiàn)附圖18)pmU6-Bax451聯(lián)合HBV特異性脾細(xì)胞注射組小鼠肝細(xì)胞凋亡率為17.1±3.6％，顯著低于模型組小鼠29±6.7％。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，經(jīng)t檢驗(yàn)P＜0.05表示有明顯差異。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果，可以得出如下結(jié)論針對(duì)Bax基因的特異性shRNA表達(dá)載體可有效抑制Bax基因的表達(dá)，為通過(guò)降低乙肝的肝細(xì)胞凋亡、減輕肝細(xì)胞損傷，改善預(yù)后，提供了一條應(yīng)用前景誘人的治療急性重癥乙型病毒性肝炎的途徑，為新型藥物的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。序列表<110>山東大學(xué)<120>抑制Bax基因表達(dá)的siRNA和表達(dá)載體及其作為乙型病毒性肝炎治療藥物的應(yīng)用<141>2006-12-5<160>8<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(19)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>1ggugccggaacugaucaga19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(19)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>2ucugaucaguuccggcacc19<210>3<211>63<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(63)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>3gatccggtgccggaactgatcagattcaagagatctgatcagttccggcaccttttttgg60aaa63<210>4<211>63<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(63)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>4agcttttccaaaaaaggtgccggaactgatcagatctcttgaatctgatcagttccggca60ccg63<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(19)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>5gugcccgagcugaucagaa19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(19)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>6uucugaucagcucgggcac19<210>7<211>49<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(49)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>7tttgtgcccgagctgatcagaaacattctgatcagctcgggcacttttt49<210>8<211>49<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(49)<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>8ctagaaaaagtgcccgagctgatcagaatgtttctgatcagctcgggca49權(quán)利要求1.一種特異性抑制人Bax基因表達(dá)的siRNA，其特征是正義鏈核苷酸序列如SEQID№1所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№2所示；作用部位是作用于人BaxmRNA的第382～400位。2.一種特異性針對(duì)人Bax基因的shRNA表達(dá)載體，其特征是所述shRNA表達(dá)載體命名為pBax382-Si，其出發(fā)載體為pSilencer3.1-H1neo；所述shRNA表達(dá)載體的shRNA序列包含權(quán)利要求1所述的編碼序列及發(fā)夾結(jié)構(gòu)、中間一段loop環(huán)、3’端6個(gè)dT修飾、5’端和3’端的酶切位點(diǎn)；其中正義鏈核苷酸序列如SEQID№3所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№4所示。3.權(quán)利要求2所述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制人類各組織細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。4.權(quán)利要求3所述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。5.權(quán)利要求3所述shRNA表達(dá)載體作為有效抑制凋亡刺激信號(hào)所誘導(dǎo)的HBV基因片段轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞凋亡的藥物的應(yīng)用。6.一種特異性抑制小鼠Bax基因表達(dá)的siRNA，其特征是正義鏈核苷酸序列如SEQID№5所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№6所示；作用部位是作用于小鼠BaxmRNA的第451～469位。7.一種特異性針對(duì)小鼠Bax基因的shRNA表達(dá)載體，其特征是所述shRNA表達(dá)載體命名為pmU6-Bax451，其出發(fā)載體為pmU6pro；所述shRNA表達(dá)載體的shRNA序列包含權(quán)利要求6所述的編碼序列及發(fā)夾結(jié)構(gòu)、中間一段loop環(huán)、3’端5個(gè)dT修飾、5’端和3’端的酶切位點(diǎn)；其中正義鏈核苷酸序列如SEQID№7所示，反義鏈核苷酸序列如SEQID№8所示。8.權(quán)利要求7所述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制小鼠各組織細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。9.權(quán)利要求8所述shRNA表達(dá)載體作為特異性、高效地抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝炎模型中肝細(xì)胞Bax基因表達(dá)的藥物的應(yīng)用。10.權(quán)利要求8所述shRNA表達(dá)載體作為有效降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝炎模型中肝細(xì)胞的凋亡，減輕肝細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制人、小鼠Bax基因表達(dá)的siRNA及其針對(duì)Bax基因的shRNA表達(dá)載體，并且進(jìn)一步提供了Bax基因的shRNA表達(dá)載體作為乙型病毒性肝炎保肝治療藥物的應(yīng)用。本發(fā)明利用shRNA表達(dá)載體在體內(nèi)進(jìn)一步表達(dá)siRNA的方法實(shí)現(xiàn)抑制Bax基因表達(dá)、降低乙肝的肝細(xì)胞凋亡、減輕肝細(xì)胞損傷、改善預(yù)后的目的，不僅避免了化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法等技術(shù)所存在的siRNA易降解，操作技術(shù)難度高等缺陷，而且可以成功實(shí)現(xiàn)siRNA在體內(nèi)長(zhǎng)期、持續(xù)表達(dá)的作用效果，為治療急性重癥乙型病毒性肝炎提供了一條前景誘人的途徑，為新型藥物的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。文檔編號(hào)C12N15/113GK101054577SQ200610070590公開(kāi)日2007年10月17日申請(qǐng)日期2006年12月7日優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日發(fā)明者孫汶生,梁曉紅,劉玉剛,崔敏,曹莉莉,侯楠,馬恬,杜娟,曲忠花,劉華,張之勇申請(qǐng)人:山東大學(xué)