專利名稱：生物芯片專用親疏水模式片基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物芯片片基，尤其是涉及一種修飾疏水性表面中構(gòu)建具有親水性的、面積大小一致的點(diǎn)(點(diǎn)的形狀、面積、密度、排布形式可根據(jù)實(shí)際需要決定)的生物芯片專用親、疏水模式片基。
背景技術(shù)：
制作生物芯片，除了專用的儀器外，還需要選擇合適的固相支持物--片基，也就是載體材料。作為芯片片基必須符合以下要求1、表面有活性基團(tuán)，可與生物分子偶聯(lián)；2、惰性(不影響生物分子的功能)和穩(wěn)定性(包括機(jī)械、化學(xué)、物理等方面)；3、良好的生物兼容性。一般來(lái)說(shuō)各種芯片片基都選擇經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等作為支持物。
常見(jiàn)的主要載體材料有玻片、膜。膜的優(yōu)點(diǎn)是與核酸親和力強(qiáng)，雜交技術(shù)成熟，通常無(wú)需另外包被。由于尼龍膜與核酸的結(jié)合能力、韌性、強(qiáng)度都比較理想，以膜為基質(zhì)的芯片絕大多數(shù)采用尼龍膜。Schleicher & Schuell公司是專業(yè)生產(chǎn)雜交/過(guò)濾膜的公司，著名的硝酸纖維素膜即是該公司首家推出的。S&S的Nytran SuPer Charge正電荷尼龍膜帶電量是常規(guī)正電荷尼龍膜的3倍，與核酸的結(jié)合力更強(qiáng)，而且又大大降低了背景和非特異結(jié)合，克服背景高的缺點(diǎn)，加上韌性強(qiáng)，反復(fù)雜交10次依然保持表面平整的優(yōu)點(diǎn)，成為制作尼龍膜芯片的最佳選擇。用于制作芯片的玻片必須特別清潔和平滑。玻片表面必須包被合適的功能基團(tuán)能將靶DNA片段固定住并防止其在雜交洗滌過(guò)程中被沖洗掉。經(jīng)表面化學(xué)處理的玻片是一種持久的載體，它可耐受高溫和高離子強(qiáng)度；玻片具有不浸潤(rùn)性，使雜交體積降低到最小，因此提高了退火時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，疏水表面可以使點(diǎn)密度大于親水表面(因?yàn)橛H水表面上樣品點(diǎn)將擴(kuò)散)；玻片的熒光信號(hào)本底低，不會(huì)造成很強(qiáng)的背景干擾；玻璃芯片可使用雙熒光甚至多熒光雜交系統(tǒng)，可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)對(duì)兩個(gè)以上的樣本進(jìn)行平行處理。S&S公司的CASTSlides(Cat.No.10484181，20/box)將SuPerCharge正電荷尼龍膜附著在玻片上，這種特殊的玻片綜合了尼龍膜的高親和力和玻片剛性的優(yōu)點(diǎn)，是世界上第一個(gè)膜結(jié)合玻片。而FAST Slides(Cat.No.10484182，20/box)則是在玻片表面包被一種專利的聚合物，這種聚合物能迅速與DNA以非共價(jià)但是不可逆的方式結(jié)合。由于表面包被層的多孔性和厚度使單位面積的DNA結(jié)合能力比常規(guī)化學(xué)表面處理玻片要高得多，使得檢測(cè)更加靈敏，其雜交方式和傳統(tǒng)的雜交一樣。適用的檢測(cè)方法包括同位素檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光法和熒光檢測(cè)，由于包被的多聚物有效降低對(duì)入射光的散射，F(xiàn)AST Slide同樣適合用激光共聚焦成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測(cè)。TeleChem ArrayItSuper Microarray Substrates(25mm×76mm)采用高清潔度，超平表面的的玻片并進(jìn)行化學(xué)修飾，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)居同類產(chǎn)品前列。SuperClean(Cat.No.SMC-25，etc.)，SuperAmine(Cat.No.SMM-25，etc.)和SuperAldehyd(Cat.No.SMA-25，etc.)三種規(guī)格可偶聯(lián)核酸、蛋白、甚至細(xì)胞，且偶聯(lián)過(guò)程可以在室溫及中性條件下進(jìn)行。
上述載體材料(片基)無(wú)論是何種處理方法，表面都是均勻一致的。
生物芯片制作方式主要分為原位合成和合成后直接在載體上點(diǎn)樣兩種。點(diǎn)樣法制作芯片又分為接觸(或半接觸——僅液滴接觸)和非接觸兩種模式。在非接觸模式中(如噴射方式)，通常用疏水性片基，疏水表面可以使點(diǎn)密度大于親水表面(因?yàn)橛H水表面上樣品點(diǎn)將擴(kuò)散)。而對(duì)于接觸模式，通常選用親水性片基，這樣有利于在接觸過(guò)程中將樣品轉(zhuǎn)移到片基上，但是親水性片基在使用中有以下不可避免的缺點(diǎn)1、導(dǎo)致樣點(diǎn)擴(kuò)散而使得斑點(diǎn)面積較大，不能得到密度高的陣列點(diǎn)，而且容易導(dǎo)致樣品點(diǎn)之間的交叉污染；2、樣點(diǎn)質(zhì)量(樣點(diǎn)體積、面積的重現(xiàn)性)很大程度依賴于樣品分配器。
本申請(qǐng)人在專利號(hào)為ZL 02 1 26729.1的發(fā)明專利中提供一種“表面張力驅(qū)動(dòng)液流的芯片化的高密度微陣列液體轉(zhuǎn)移裝置”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有的親水性片基在使用中存在的上述缺點(diǎn)，提供一種在載玻片、硅片或其他載體上修飾疏水性表面(疏水層厚約為2～5μm)中構(gòu)建具有親水性的、面積大小一致的點(diǎn)(點(diǎn)的形狀、面積、密度、陣列排布形式可根據(jù)需要決定，點(diǎn)的形狀一般為圓點(diǎn))的生物芯片專用親疏水模式片基。
本發(fā)明設(shè)有基底，基底的上表面設(shè)有疏水層，在疏水層上布設(shè)有陣列式親水點(diǎn)，親水點(diǎn)可為親水圓點(diǎn)。所述的基底選自玻片或硅片等，可以為方形、圓形等形狀，其大小、尺寸根據(jù)需要決定，目前大多數(shù)生物芯片采用載玻片，因而本發(fā)明的片基可采用載玻片大小(2.5cm×7.5cm)，疏水層可選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)，厚度2-5μm，親水點(diǎn)的材料可采用鐵、鋁等親水金屬。對(duì)親水圓點(diǎn)的直徑為10～500μm，厚度為1～5μm，對(duì)中、低密度要求的片基，最好為100μm，親水圓點(diǎn)之間的中心距離為50～1000μm，對(duì)中、低密度要求的片基，最好為500μm。親水點(diǎn)也可為親水方形點(diǎn)、親水橢圓點(diǎn)等。
親水點(diǎn)是由親水性材料修飾于疏水性表面上的薄膜層，親水點(diǎn)間相互孤立。
與現(xiàn)有的親水性片基相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是1、結(jié)合了親水性片基和疏水性片基兩者的優(yōu)點(diǎn)，既讓液滴很容易轉(zhuǎn)移到片基上的親水點(diǎn)上，又可以利用親水點(diǎn)周圍疏水部分約束液滴。這樣就能夠得到斑點(diǎn)面積小的樣點(diǎn)。并且由于疏水部分的約束作用，樣點(diǎn)間的交叉污染現(xiàn)象也可以很好地避免交叉污染。
2、由于親水點(diǎn)面積一致性高，當(dāng)點(diǎn)樣(分配器)大小不一致的液滴(在一定體積范圍內(nèi))與片基上的親水圓點(diǎn)接觸時(shí)，片基上所留下的液滴體積變化幅度較小，液滴半徑恒定與親水圓點(diǎn)半徑一致。即制作的芯片樣點(diǎn)的體積、面積一致性高，因此也大大降低樣品分配器(如點(diǎn)樣頭，針)的制作難度，可大大降低點(diǎn)樣機(jī)的成本。例如，使用該片基，可降低本申請(qǐng)人的發(fā)明專利“表面張力驅(qū)動(dòng)液流的芯片化的高密度微陣列液體轉(zhuǎn)移裝置(ZL02126729.1)”中點(diǎn)樣芯片的制作難度。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制作流程圖。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例1點(diǎn)樣液滴體積與基底上樣點(diǎn)體積關(guān)系。在圖3中，橫坐標(biāo)為點(diǎn)樣液滴體積V1(μl)，縱坐標(biāo)為點(diǎn)樣體積V2(nl)，●親水表面，★親水圓點(diǎn)， 疏水表面。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例1點(diǎn)樣液滴體積與樣點(diǎn)半徑關(guān)系。在圖4中，橫坐標(biāo)為點(diǎn)樣液滴體積V1(μl)，縱坐標(biāo)為樣點(diǎn)半徑r(μm)，●親水表面，★親水圓點(diǎn)， 疏水表面。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1參見(jiàn)圖1，本發(fā)明實(shí)施例設(shè)有長(zhǎng)方形基底1，基底1的上表面設(shè)有疏水層2，在疏水層2上布設(shè)有陣列式親水圓點(diǎn)3，親水圓點(diǎn)3的直徑為10～500μm，親水圓點(diǎn)3之間的中心距離為50～1000μm，基底1選自玻片或硅片等，疏水層選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)，厚度2～5μm，親水圓點(diǎn)薄膜層材料采用親水金屬(鐵、鋁)，厚度1～3μm。所制作片基中親水表面接觸角為56°，而疏水表面接觸角為110°。
以下給出本發(fā)明所述的生物芯片專用親疏水模式片基的一種制備方法(在疏水基底上構(gòu)建陣列親水點(diǎn)可有多種方法，作為實(shí)施例，可采用光刻工藝加磁控濺射鐵親水層方法)。
(1)聚合PDMS薄膜將PDMS(Sylgard184，聚二甲基硅氧烷Poly(dimethylsiloxane))主劑與引發(fā)劑(Dow Corning美國(guó))按質(zhì)量比10∶1混勻，置于真空箱中抽出其中氣泡。設(shè)定好勻膠機(jī)轉(zhuǎn)速和時(shí)間，利用真空將清洗好的硅片(或載玻片)吸住，混勻的PDMS液體滴在硅片中心，開(kāi)始旋轉(zhuǎn)勻膠。再置于真空烘箱中100℃聚合1h。采用的轉(zhuǎn)速為7000～8000轉(zhuǎn)/min，甩膠時(shí)間為60s，所得的PDMS膜厚約為2～5μm。
(2)活化PDMS表面將聚合好PDMS薄膜的硅片置于氧氣等離子體去膠機(jī)反應(yīng)腔內(nèi)，抽真空至真空度為6×10-1乇以上時(shí)，高頻輸出轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)旋轉(zhuǎn)至相應(yīng)反應(yīng)室。按相應(yīng)的高壓按鈕，緩慢調(diào)節(jié)調(diào)壓器達(dá)到輝光放電。調(diào)壓到1500V，調(diào)節(jié)匹配調(diào)節(jié)旋鈕實(shí)陽(yáng)極電流與柵極電流為5∶1。氧氣微調(diào)閥調(diào)至1.2L/min左右，反應(yīng)10s即可。
(3)制作掩膜板光刻已曝光過(guò)的底片(黑板)，采用二氧化碳激光雕刻機(jī)(北京創(chuàng)科源公司，型號(hào)CKY laser MCO2-50F)按要求的雕刻陣列點(diǎn)(刻去黑色膜，成為透光的點(diǎn))。
(4)光刻在活化后的PDMS薄膜表面旋轉(zhuǎn)涂敷一層光刻膠(BP212)(北京化學(xué)試劑所)，轉(zhuǎn)速3500轉(zhuǎn)/min，時(shí)間30s，膠層厚度1.5μm。置于真空烘箱中90℃前烘15min，待膠層固化后，復(fù)蓋上掩膜板，在JKG-2A曝光機(jī)(曝光波長(zhǎng)400nm)曝光106s。
(5)顯影及堅(jiān)膜去掉掩膜板，在0.5％NaOH顯影液中顯影22s，除去感光部分的膠層。用氮?dú)獯蹈晒杵砻娴乃郑糜谡婵蘸嫦渲?35℃堅(jiān)膜15min。
(6)磁控濺射金屬鐵濺射鐵條件參數(shù)為真空度3.3×10-3Pa；Ar氣流量100sccm；工作壓強(qiáng)1Pa；功率射頻100W；時(shí)間8min。
(7)光刻膠剝離將濺射鐵層后硅片置于丙酮中浸泡24h，由于BP212光刻膠為正性光刻膠，溶于丙酮，同時(shí)除去光刻膠上方的鐵層，只剩下光刻顯影處的鐵層圖案。乙醇清洗，超純水沖洗，氮?dú)獯蹈伞?br> 具體流程見(jiàn)圖2。
兩者親水性差異較大，在親水圓點(diǎn)邊緣部分利用疏水部分約束液滴所得到的效果為在一定體積范圍內(nèi)，大小不一致的液滴與片基上的親水點(diǎn)接觸，片基上所留下的液滴體積變化幅度較小(參見(jiàn)圖3)，液滴半徑恒定與親水點(diǎn)半徑一致(參見(jiàn)圖4)。
圖3和圖4是利用微量進(jìn)樣器調(diào)節(jié)針尖點(diǎn)樣液滴大小，接觸片基來(lái)模擬點(diǎn)樣，所用的親水點(diǎn)半徑為300μm。通過(guò)測(cè)量在親水表面、親水點(diǎn)和疏水表面上不同液滴大小的接觸留下的樣點(diǎn)體積，了解周圍是疏水部分的親水點(diǎn)對(duì)液滴的約束作用。
從圖3和圖4可以看出，當(dāng)與親水點(diǎn)相應(yīng)的各個(gè)液體轉(zhuǎn)移頭所攜帶的液滴體積不一致時(shí)，單純用一種表面(親水性的或是疏水性的)得到的液滴體積都會(huì)有較大的不一致。如果有親、疏水模式片基，則可以減小液滴體積的偏差，特別對(duì)于液滴半徑，能使其恒定與親水點(diǎn)半徑一致，可以使最終樣點(diǎn)半徑相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大大改善。
實(shí)施例2與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于采用圓形基底，基底上表面設(shè)有的疏水層其厚度為3～5μm，在疏水層上布設(shè)有陣列式親水正方形點(diǎn)，親水正方形點(diǎn)的長(zhǎng)寬均為100μm，親水正方形點(diǎn)之間的中心距離為800μm?；撞捎幂d玻片，大小為2.5cm×7.5cm，親水正方形點(diǎn)薄膜層材料采用鋁親水金屬。
權(quán)利要求
1.生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于設(shè)有基底，基底的上表面設(shè)有疏水層，在疏水層上布設(shè)有陣列式親水點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于所述的親水點(diǎn)為親水圓點(diǎn)，親水方形點(diǎn)或親水橢圓形點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于所述的親水圓點(diǎn)的直徑為10～500μm，厚度為1～5μm，親水點(diǎn)之間的中心距離為50～1000μm。
4.如權(quán)利要求3所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于所述的親水圓點(diǎn)的直徑為100μm，親水圓點(diǎn)之間的中心距離為500μm。
5.如權(quán)利要求1所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于所述的基底選自玻片或硅片。
6.如權(quán)利要求1或5所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于所述的基底為方形基底或圓形基底。
7.如權(quán)利要求1所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于所述的疏水層為聚二甲基硅氧烷層。
8.如權(quán)利要求1或7所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于所述的疏水層厚度為2～5μm。
9.如權(quán)利要求1所述的生物芯片專用親疏水模式片基，其特征在于親水點(diǎn)為親水金屬點(diǎn)。
全文摘要
生物芯片專用親疏水模式片基，涉及一種生物芯片片基，提供一種在載玻片、硅片或其他載體上修飾疏水性表面(疏水層厚約為2～5μm)中構(gòu)建具有親水性的、面積大小一致的點(diǎn)(點(diǎn)的形狀、面積、密度、陣列排布形式可根據(jù)需要決定，點(diǎn)的形狀一般為圓點(diǎn))的生物芯片專用親疏水模式片基。設(shè)有基底，基底的上表面設(shè)有疏水層，在疏水層上布設(shè)有陣列式親水點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1858593SQ200610071318
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月23日
發(fā)明者林華水, 田昭武, 周勇亮, 李佳, 張潤(rùn)香, 胡維玲 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)