專利名稱：糖生物芯片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖生物芯片的制備方法。具體涉及一種利用還原糖的還原末端，以糖苷鍵形式共價(jià)偶聯(lián)到羥基衍生化的固相載體上的糖生物芯片的制備方法。
背景技術(shù)：
糖結(jié)合蛋白具有重要的生物學(xué)功能，其表現(xiàn)在細(xì)胞間的通訊和識(shí)別，細(xì)胞與病原微生物的相互作用，細(xì)胞內(nèi)蛋白的運(yùn)輸，蛋白間的相互作用，蛋白與受體的特異性結(jié)合等方面。生物芯片技術(shù)的三個(gè)探索方向即是基因芯片、蛋白質(zhì)生物芯片及糖生物芯片。糖生物芯片的優(yōu)越性在于其一，生物活性穩(wěn)定。糖生物芯片可在室溫條件下長期保存生物活性不變。其二，應(yīng)用范圍廣泛。把糖生物芯片技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床上，可對(duì)多種傳染性與非傳染性疾病同時(shí)進(jìn)行快速診斷。因?yàn)樗械募?xì)胞表面都有含糖物質(zhì)，這些糖化分子在細(xì)胞分子的識(shí)別過程中起著重要的作用。例如，血型的測定，人體免疫細(xì)胞對(duì)微生物病原體和某些腫瘤的識(shí)別等。
目前，對(duì)用于糖結(jié)合蛋白研究的糖芯片的研究，國際上仍處于探索階段。主要障礙是缺乏高通量的技術(shù)和手段，特別是缺乏類似于DNA芯片和蛋白芯片的研究工具，需要解決實(shí)際芯片制造的技術(shù)難題，包括如何將含糖物質(zhì)固定在芯片上、如何監(jiān)測芯片上糖體的生物活性。
現(xiàn)有糖芯片的制備主要是以物理吸附為主，或是對(duì)還原糖進(jìn)一步化學(xué)修飾，然后再把還原糖共價(jià)偶聯(lián)到諸如硝酸纖維素膜或玻片等固相載體上。物理吸附法制備糖芯片，固定在固相載體上的還原糖在實(shí)驗(yàn)過程中易脫落，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)還原糖進(jìn)一步化學(xué)修飾制備糖芯片，是把還原糖共價(jià)偶聯(lián)到硝酸纖維素膜或玻片等固相載體上，其方法復(fù)雜，成本高，不易實(shí)施、推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種糖生物芯片的制備方法，其解決了背景技術(shù)中還原糖易脫落，結(jié)果的準(zhǔn)確性差，制備方法復(fù)雜、成本高的技術(shù)問題。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種糖生物芯片的制備方法，其特殊之處在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟如下1)取偶聯(lián)劑溶于有機(jī)溶劑中，配制成10～50mol/L的溶液；
2)將環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的固相載體浸入其中，室溫下孵育3小時(shí)；3)用溶解偶聯(lián)劑的有機(jī)溶劑和無水乙醇分別將固相載體清洗二次，每次2分鐘；4)將固相載體于室溫離心干燥，保存于干燥容器中備用；5)將還原糖用水溶解，調(diào)至所需的濃度；6)加入相同體積、pH3～6的酸性點(diǎn)樣緩沖液，對(duì)固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣；7)點(diǎn)樣后的固相載體于25～60℃溫育12小時(shí)即可。
上述偶聯(lián)劑是含有一個(gè)氨基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑。
上述偶聯(lián)劑具體可采用4-羥基苯甲酰胺或4-羥基丁酸肼等。
上述有機(jī)溶劑可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺等；還原糖可采用單糖、寡糖或多糖等；固相載體可采用玻片、硝酸纖維素膜或瓷片等。
上述溶解還原糖的水可采用超純水、雙蒸水、去離子水或純水等；點(diǎn)樣是指手工點(diǎn)樣和機(jī)器點(diǎn)樣；點(diǎn)樣后固相載體的溫育溫度以37℃為佳。
一種糖生物芯片的制備方法，其特殊之處在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟如下1)取偶聯(lián)劑溶于有機(jī)溶劑中，配制成10～50mol/L的溶液；2)按溶質(zhì)比例偶聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺∶二環(huán)己基碳二亞胺＝1∶2∶2～4，加入N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)已基碳二亞胺，偶聯(lián)劑被活化的酸基生成活潑酯衍生物；3)將氨基基團(tuán)衍生化的固相載體浸泡其中，室溫下孵育3小時(shí)；4)用溶解偶聯(lián)劑的有機(jī)溶劑和無水乙醇分別將固相載體清洗二次，每次2分鐘；5)將固相載體于室溫離心干燥，保存于干燥容器中備用；6)將還原糖用水溶解，調(diào)至所需的濃度；7)加入相同體積、pH3～6的酸性點(diǎn)樣緩沖液，對(duì)固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣；8)點(diǎn)樣后的固相載體于25～60℃溫育12小時(shí)即可。
上述偶聯(lián)劑可采用含有一個(gè)羧基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑。
上述偶聯(lián)劑具體可采用4-羥基苯基戊酸或16-羥基十六羧酸等。
上述有機(jī)溶劑可采用乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺等；還原糖可采用單糖、寡糖或多糖等；固相載體可采用玻片、硝酸纖維素膜或瓷片等。
上述溶解還原糖的水可采用超純水、雙蒸水、去離子水或純水等；點(diǎn)樣是指手工點(diǎn)樣和機(jī)器點(diǎn)樣；點(diǎn)樣后固相載體的溫育溫度以37℃為佳。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.固定還原糖的連接方式簡單、快速，且成本較低。
2.糖芯片的生物活性穩(wěn)定，可在室溫條件下長期保存而生物活性不變。
3.實(shí)用范圍廣，易于規(guī)?；茝V、使用。


圖1是本發(fā)明實(shí)施方法一的原理示意圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施方法二的原理示意圖。
圖3a、b是本發(fā)明用地衣酚的硫酸溶液作為顯色試劑檢驗(yàn)糖在固相載體上偶聯(lián)效果的示意圖。
圖4a、b是本發(fā)明將CyDye熒光染料直接標(biāo)記的凝集素刀豆素用于糖芯片的效果示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要是以還原糖為模型，使還原糖的還原末端即半縮醛(ROH)以糖苷鍵的形式共價(jià)偶聯(lián)到羥基(-OH)衍生化的固相載體上制備糖芯片。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)方法一的原理環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的固相載體，因其表面含有一層環(huán)氧乙烷基團(tuán)，可與偶聯(lián)劑的氨基共價(jià)偶聯(lián)。偶聯(lián)劑另一端的羥基(-OH)與還原糖的還原末端即1位醛基發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)形成糖苷鍵，使還原糖以共價(jià)的方式偶聯(lián)在固相載體上，制備出糖芯片。
本方法中，還原糖可采用單糖、寡糖或多糖等。固相載體可采用玻片、硝酸纖維素膜或瓷片等。偶聯(lián)劑可采用含有一個(gè)氨基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑，如4-羥基苯甲酰胺或4-羥基丁酸肼等。
本發(fā)明實(shí)施例一的實(shí)現(xiàn)步驟1.取偶聯(lián)劑4-羥基苯甲酰胺或4-羥基丁酸肼溶于有機(jī)溶劑二甲基甲酰胺(DMF)中，配制成50mL、20mol/L的溶液。
2.將環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的玻片浸入其中，室溫下孵育3小時(shí)左右。
3.用二甲基甲酰胺(DMF)和無水乙醇分別清洗玻片二次，每次2分鐘左右。
4.將玻片于室溫離心干燥，保存于4℃干燥容器中備用。
5.將還原糖用超純水溶解，調(diào)至所需的濃度。
6.加入相同體積、pH3～6的酸性點(diǎn)樣緩沖液，對(duì)玻片進(jìn)行手工點(diǎn)樣和機(jī)器點(diǎn)樣。
7.于37℃溫育12小時(shí)左右即可。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)方法二的原理氨基基團(tuán)衍生化的固相載體，因其表面含有一層氨基基團(tuán)，可與偶聯(lián)劑的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)活化的酸基共價(jià)偶聯(lián)。偶聯(lián)劑的另一端的羥基(-OH)可以與還原糖的還原末端即1位醛基發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)形成糖苷鍵，使還原糖以共價(jià)的方式偶聯(lián)在固相載體上，制備出糖芯片。本方法中，還原糖可采用單糖、寡糖、多糖等。固相載體可采用玻片、硝酸纖維素膜、瓷片等。偶聯(lián)劑可采用含有一個(gè)羧基和一個(gè)羥基，如4-羥基苯基戊酸、16-羥基十六羧酸等。
本發(fā)明實(shí)施例二的實(shí)現(xiàn)步驟1.取偶聯(lián)劑4-羥基苯基戊酸或16-羥基十六羧酸溶于有機(jī)溶劑乙酸乙酯中，配制成50mL、20mol/L的溶液。
2.加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)，偶聯(lián)劑被活化的酸基生成活潑酯衍生物。
3.將氨基基團(tuán)衍生化的玻片浸泡其中，室溫下孵育3小時(shí)左右。
4.用二甲基甲酰胺(DMF)和無水乙醇分別清洗玻片二次，每次2分鐘左右。
5.將玻片于室溫離心干燥，保存于4℃干燥容器中備用。
6.將還原糖用超純水溶解，調(diào)至所需的濃度。
7.加入相同體積的、pH3～6的酸性點(diǎn)樣緩沖液，對(duì)玻片進(jìn)行手工點(diǎn)樣和機(jī)器點(diǎn)樣。
8.于37℃溫育12小時(shí)左右即可。
點(diǎn)上還原糖的玻片經(jīng)封閉緩沖液處理，超純水清洗，室溫離心干燥。在點(diǎn)樣區(qū)滴加地衣酚的硫酸溶液，然后對(duì)此區(qū)域加熱?？梢姷匾路拥牧蛩崛芤河蔁o色逐漸變成黃色。圖3a、3b分別是用本發(fā)明方法一、二制備出糖芯片的效果圖。
以D-甘露糖為模型，用本發(fā)明方法一、二制備出糖芯片，將CyDye熒光染料直接標(biāo)記的凝集素刀豆素A(Concanavalin A，Con A)用于此糖芯片，結(jié)果見圖4a、4b。
權(quán)利要求
1.一種糖生物芯片的制備方法，其特征在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟如下1)取偶聯(lián)劑溶于有機(jī)溶劑中，配制成10～50mol/L的溶液；2)將環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的固相載體浸入其中，室溫下孵育3小時(shí)；3)用溶解偶聯(lián)劑的有機(jī)溶劑和無水乙醇分別將固相載體清洗二次，每次2分鐘；4)將固相載體于室溫離心干燥，保存于干燥容器中備用；5)將還原糖用水溶解，調(diào)至所需的濃度；6)加入相同體積、pH3～6的酸性點(diǎn)樣緩沖液，對(duì)固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣；7)點(diǎn)樣后的固相載體于25～60℃溫育12小時(shí)即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)劑是含有一個(gè)氨基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑是4-羥基苯甲酰胺或4-羥基丁酸肼。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺；所述的還原糖為單糖、寡糖或多糖；所述的固相載體為玻片、硝酸纖維素膜或瓷片。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述溶解還原糖的水為超純水、雙蒸水、去離子水或純水；所述的點(diǎn)樣是指手工點(diǎn)樣和機(jī)器點(diǎn)樣；所述的點(diǎn)樣后固相載體的溫育溫度為37℃。
6.一種糖生物芯片的制備方法，其特征在于該方法的實(shí)現(xiàn)步驟如下1)取偶聯(lián)劑溶于有機(jī)溶劑中，配制成10～50mol/L的溶液；2)按溶質(zhì)比例偶聯(lián)劑∶N-羥基琥珀酰亞胺∶二環(huán)己基碳二亞胺＝1∶2∶2～4，加入N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺，偶聯(lián)劑被活化的酸基生成活潑酯衍生物；3)將氨基基團(tuán)衍生化的固相載體浸泡其中，室溫下孵育3小時(shí)；4)用溶解偶聯(lián)劑的有機(jī)溶劑和無水乙醇分別將固相載體清洗二次，每次2分鐘；5)將固相載體于室溫離心干燥，保存于干燥容器中備用；6)將還原糖用水溶解，調(diào)至所需的濃度；7)加入相同體積、pH3～6的酸性點(diǎn)樣緩沖液，對(duì)固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣；8)點(diǎn)樣后的固相載體于25～60℃溫育12小時(shí)即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)劑是含有一個(gè)羧基和一個(gè)羥基的偶聯(lián)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑是4-羥基苯基戊酸或16-羥基十六羧酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺；所述的還原糖為單糖、寡糖或多糖；所述的固相載體為玻片、硝酸纖維素膜或瓷片。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的糖生物芯片的制備方法，其特征在于所述溶解還原糖的水為超純水、雙蒸水、去離子水或純水；所述的點(diǎn)樣是指手工點(diǎn)樣和機(jī)器點(diǎn)樣；所述的點(diǎn)樣后固相載體的溫育溫度為37℃。
全文摘要
一種糖生物芯片的制備方法，采用環(huán)氧乙烷基團(tuán)衍生化的固相載體，通過其表面所含環(huán)氧乙烷基團(tuán)，與偶聯(lián)劑的氨基共價(jià)偶聯(lián)，偶聯(lián)劑另一端的羥基與還原糖的還原末端發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)形成糖苷鍵，使還原糖以共價(jià)方式偶聯(lián)在固相載體上，制備出糖芯片?；虿捎冒被鶊F(tuán)衍生化的固相載體，通過其表面所含氨基基團(tuán)，與偶聯(lián)劑經(jīng)N－羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺活化的酸基共價(jià)偶聯(lián)，偶聯(lián)劑另一端的羥基與還原糖的還原末端發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)形成糖苷鍵，使還原糖以共價(jià)的方式偶聯(lián)在固相載體上，制備出糖芯片。本發(fā)明解決了背景技術(shù)中還原糖易脫落、制備方法復(fù)雜、成本高的技術(shù)問題。本發(fā)明簡單、快速，糖芯片的生物活性穩(wěn)定，易于規(guī)?；茝V應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1952658SQ20061007135
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2006年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者李錚, 陳超, 南剛, 顏樺 申請(qǐng)人:陜西西大北美基因股份有限公司