專利名稱：應(yīng)用層孔菌j21制備新型功能性酒精飲料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種層孔菌(Phellinus sp.)的菌絲體突變株及使用該突變株制備酒精飲料的方法。更具體地，本發(fā)明是關(guān)于從層孔菌中制備突變菌絲體層孔菌J21(Phellinus sp.J21)(該層孔菌J21于2005年9月13日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏編號為KCTC 10847BP)的方法、在人工液體營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)該突變菌絲體層孔菌J21的方法、從培養(yǎng)的層孔菌J21中分離并純化醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)的方法和克隆所述醇脫氫酶基因的方法，本發(fā)明還關(guān)于使用所述突變株菌絲體制備的功能性酒精飲料和制備所述酒精飲料的方法。
背景技術(shù)：
蕈類富含纖維物質(zhì)(fibrous material)、維生素、礦物等，并因此作為“健康(well-being)”食品得到更多關(guān)注。特別是層孔菌因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有抗癌功效，因而被廣泛用于醫(yī)藥食品。近來由于使用幾種蕈類種的菌絲體發(fā)酵醇類成為可能，因而關(guān)于所述蕈類的醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase，ADH)的研究也有報道。
幾千年來，酒精飲料給人類帶來愉悅。然而，過度的酒精飲料引起副作用，例如脂肪肝和肝損傷。自從人類歷史起源，人類就已經(jīng)開始釀造酒精飲料。所述酒精飲料的應(yīng)用范圍逐漸擴大，例如，已經(jīng)應(yīng)用于君王登基典禮、結(jié)婚典禮和祖先的宗教儀式。在西方國家，很久以前酒就已經(jīng)用于禮拜儀式，柏拉圖曾講，“在上帝賜予人類的眾多禮物中，沒有比酒更有價值的了。”韓國傳統(tǒng)的酒精飲料廣義上可分為通過發(fā)酵制備的未過濾米酒和澄清過濾米酒，以及蒸餾米酒(soju韓國燒酒)。韓國傳統(tǒng)酒精飲料的迷人之處可以從發(fā)酵酒精飲料中發(fā)現(xiàn)，其典型成員未過濾米酒和澄清過濾米酒為韓國歷史上著名的使用酵母釀造的酒精飲料(日本米酒(Jeongjong)為日本酒“清酒(Sake)”改用的名稱，該名稱可以與韓國傳統(tǒng)的澄清過濾米酒相區(qū)別)。所述未過濾米酒為低醇飲料，通過用酵母發(fā)酵大米，用濾網(wǎng)粗略過濾所得發(fā)酵的醇原液，然后將過濾后得到的原液用水稀釋釀制而成，并且已有各種不同的名稱，包括Makkoli、Daepo、Wangdaepo、Jeoknaegisul、Moju、Takbegi和Takjubegi。同樣，由于它經(jīng)常在家庭中釀造，其口味和香味因技巧或家庭的制備方法各異。雖然很難定義好的酒精飲料，韓國傳統(tǒng)糧食酒要求必須盡可能接近竹葉的顏色，清香爽口。由于1907年制定的酒稅法(the Liquor Tax Law)嚴(yán)格限定了韓國傳統(tǒng)酒的制造，因此傳統(tǒng)酒的歷史被中斷了，之后，隨1988年漢城奧運會前后國際化的趨勢，它們又流行起來。然而可以得出這樣的事實韓國是世界上最大的酒進口國，這種趨勢現(xiàn)在仍然繼續(xù)。
乙醇發(fā)酵是指生物體在厭氧條件下將糖類轉(zhuǎn)化成酒精(乙醇)的方法。即微生物對碳水化合物的一種非酶分解，最終從糖類或多糖產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，如下列反應(yīng)方程式1所示。

發(fā)酵酒精飲料是指應(yīng)用發(fā)酵的醇液體本身或過濾后的所述醇液體，并且具有低醇濃度但是高萃取量(extract content)。制備發(fā)酵酒精飲料的方法包括單一發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵。單一發(fā)酵的酒精飲料指，通過用酵母能利用的糖類原料完成的乙醇發(fā)酵而獲得的酒精飲料。所述單一發(fā)酵的酒精飲料包括如葡萄酒和蘋果酒的果酒和馬奶酒。復(fù)合發(fā)酵的酒精飲料指通過淀粉酶的淀粉糖化過程，并使糖化后的淀粉進行乙醇發(fā)酵而獲得的酒精飲料。因此，用糧食制成的發(fā)酵酒精飲料為復(fù)合發(fā)酵酒精飲料。分別進行糖化作用和發(fā)酵的方法被定義為分步糖化發(fā)酵法(separate saccharification andfermentation process)，啤酒屬于此類。啤酒通過發(fā)酵由麥芽淀粉酶對原料淀粉的糖化作用得到的糖液制得。同時進行糖化作用和發(fā)酵的方法被定義為同步糖化發(fā)酵法(simultaneous saccharification and fermentationprocess)。通過同步糖化發(fā)酵法制備的酒精飲料包括澄清過濾米酒、未過濾米酒和So-Hong Ju。澄清過濾米酒通過在發(fā)酵淀粉時，用清酒曲淀粉酶糖化淀粉制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從層孔菌制備了突變菌絲體層孔菌J21，所述層孔菌廣泛用于醫(yī)療目的，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了所述突變菌絲體產(chǎn)生醇脫氫酶，以及發(fā)現(xiàn)應(yīng)用所述突變菌絲體使制得的酒精飲料具有改善肝功能的功效。
因此，本發(fā)明的發(fā)明目的是提供產(chǎn)生醇脫氫酶的層孔菌J21，以及用該菌株制備的功能性酒精飲料和制備所述酒精飲料的方法。
為了達(dá)到上述目的，在本發(fā)明的一個具體實施方式
中提供了從層孔菌制備來的產(chǎn)生醇脫氫酶的突變菌絲體層孔菌J21。
在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供了多種功能性酒精飲料如啤酒、果酒和澄清過濾酒，所述酒精飲料通過在人工培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基上接種得自富含纖維物質(zhì)(fibrous material)、蛋白質(zhì)和維生素的層孔菌的包含醇脫氫酶的菌絲體制備，該酒精飲料具有預(yù)防癌癥的功效，以及提供應(yīng)用所述發(fā)酵酒精飲料制備的蒸餾酒精飲料。


圖1顯示根據(jù)本發(fā)明處理的層孔菌在人工培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的結(jié)果，以及培養(yǎng)基的顯微照片；圖2顯示根據(jù)本發(fā)明，從層孔菌J21中分離純化的醇脫氫酶的電泳結(jié)果；圖3顯示根據(jù)本發(fā)明，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增從層孔菌J21中分離的總RNA得出醇脫氫酶的cDNA克隆以及堿基序列分析結(jié)果；圖4為顯示了根據(jù)本發(fā)明，在使用層孔菌J21的乙醇發(fā)酵過程中乙醇濃度隨發(fā)酵時間變化的圖表；圖5為顯示根據(jù)本發(fā)明制得的乙醇已經(jīng)被層孔菌J21發(fā)酵的圖解圖表；圖6顯示使用引物5’-RACE、ph-adh-R3和ph-adh-R4的結(jié)合進行的PCR擴增的結(jié)果；M標(biāo)記(marker)；泳道1用5’-RACE和ph-adh-R3的結(jié)合產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物；以及泳道2-5用泳道1的PCR產(chǎn)物作為模板以及5’-RACE和ph-adh-R3的結(jié)合產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物；圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明得自層孔菌J21的醇脫氫酶cDNA與得自其它已知物種的醇脫氫酶的對比的結(jié)果；P-adh得自層孔菌J21的醇脫氫酶；以及A-adh III得自傘菌的醇脫氫酶；圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明得自層孔菌J21的醇脫氫酶與得自傘菌的醇脫氫酶的對比結(jié)果；P-adh得自菌絲體層孔菌的醇脫氫酶；以及A-adh III得自傘菌的醇脫氫酶；圖9為示意圖，顯示了根據(jù)本發(fā)明，用層孔菌J21制備澄清過濾米酒(Yakju)的方法；圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明利用層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料的溶解血栓活性和抑制血栓形成的功效；圖11為顯示了給予根據(jù)本發(fā)明用層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料的小鼠和給予其它酒精飲料的小鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)分析結(jié)果的圖表；
圖12為顯示了給予根據(jù)本發(fā)明用層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料的小鼠和給予其它酒精飲料(乙醇濃度14％)的小鼠的血清總膽固醇和甘油三酯水平的分析結(jié)果的圖表；圖13顯示了給予根據(jù)本發(fā)明用層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料的小鼠和給予其它酒精飲料的小鼠的肝組織染色結(jié)果。
生物保藏本發(fā)明的層孔菌J21于2005年9月13日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏編號為KCTC 10847BP。
具體實施例方式
現(xiàn)在結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方式
做詳細(xì)的說明。
通過用致死率大于95％的紫外線(UV)照射層孔菌而分離層孔菌的突變菌絲體層孔菌J21，然后每天傳代培養(yǎng)經(jīng)過照射的菌株共30天。與現(xiàn)有的層孔菌相比，突變菌株層孔菌J21顯示出液體培養(yǎng)菌絲體形成周期縮短、乙醇發(fā)酵周期縮短和乙醇發(fā)酵能力增強的特點。所述突變菌株層孔菌J21于2005年9月13日保藏在布達(dá)佩斯條約下的國際保藏機構(gòu)-韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏編號為KCTC-10847BP。
在本發(fā)明中，分離并培養(yǎng)產(chǎn)生醇脫氫酶的突變菌絲體層孔菌J21，然后將所得培養(yǎng)的菌絲體用于工業(yè)乙醇發(fā)酵。此外，從突變菌絲體層孔菌J21中分離醇脫氫酶(ADH)并克隆醇脫氫酶的cDNA。
層孔菌J21于25℃液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天，通過離心從培養(yǎng)基中收集菌絲體，并用超聲波進行破碎，然后通過分級色譜法(stepwisechromatography)從中分離和純化ADH。純化出的酶通過十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳測得分子量為約46千道爾頓(kDa)。
此外，收集在上述相同條件下培養(yǎng)的所述菌絲體(Phellinus sp.J21)，用液氮凍干，然后用研缽?fù)耆鬯?，從所得粉碎的菌絲體中提取總RNA。所提取的總RNA進行反向PCR(RT-PCR)克隆出ADH的cDNA，以測定ADH的堿基序列。層孔菌J21的克隆cDNA具有編碼379個氨基酸的1137個堿基對。將所述ADH的cDNA轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，并且與先前已知的傘菌(Agaricus)ADH進行比較，結(jié)果與傘菌ADH的氨基酸序列顯示出68％的同源性。并且，局部相似性基本查詢工具(Basic Local Alignment SearchTool，BLAST)分析表明所述克隆出的ADH與ADH III非常相似。
在本發(fā)明中，產(chǎn)生醇脫氫酶的所述突變菌絲體層孔菌J21分離自富含有益健康的物質(zhì)的層孔菌，分離的突變菌絲體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用于制造酒精飲料。具體地，上述方法包括如下步驟1)從層孔菌中制備所述層孔菌J21；2)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)層孔菌J21；以及3)以重量比2∶3∶5混合酒曲(Koji)(詳見下文)、蒸米飯和水，并用所得混合物培養(yǎng)所述培養(yǎng)的菌絲體以產(chǎn)生乙醇。
上述酒曲通過用米曲霉(Aspergillus oryzae)接種蒸米飯以使蒸米飯?zhí)腔频谩Ｍㄟ^用米曲霉接種所述蒸米飯而對蒸米飯?zhí)腔?，將層孔菌J21代替酵母作為乙醇發(fā)酵源加入其中，并將所得混合物在25℃下發(fā)酵11天以產(chǎn)生乙醇濃度達(dá)到最大值16.7％的酒精飲料。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，對用層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料的功能性進行檢測，結(jié)果，該飲料表現(xiàn)出溶解血栓活性和延遲血栓形成的功效。同時，在用本發(fā)明所發(fā)明的發(fā)酵酒精飲料動物實驗中，所述酒精飲料與具有同樣乙醇濃度(14％)的普通酒精飲料相比，表現(xiàn)出低GOT和GPT水平，并且表現(xiàn)出低血清膽固醇和中性脂(neutral lipid)水平。此外，動物肝組織分析結(jié)果中，給予普通酒精飲料(14％)大鼠的肝表現(xiàn)出部分的炎性部位，而給予用層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料大鼠的肝與給予生理鹽水的對照組的肝表現(xiàn)結(jié)果相似。
在本發(fā)明中，用具有抗癌功效的突變菌絲體層孔菌J21醇發(fā)酵成功地達(dá)到了工業(yè)生產(chǎn)的水平。此外，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵酒精飲料具有溶解血栓的功能以及抑制肝功能損害的效果，因而有益健康。
下面將結(jié)合實施例進一步詳細(xì)描述本發(fā)明。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，所述實施例只具說明性的目的，本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求限定，而不限于所述實施例。
實施例1 層孔菌的突變菌絲體層孔菌J21的分離、培養(yǎng)和富集從層孔菌分離并培養(yǎng)的菌絲體的形態(tài)見圖1。概括講，取具有特定大小的層孔菌孢果柄(carpophore)，在YMD平板(7.5％葡萄糖、4.5％麥芽提取物、5％酵母提取物、0.01％生物素、0.05％ MgCl2、0.01％FeSO4、2％瓊脂，pH 7.0)上于25℃下靜止培養(yǎng)6天。將層孔菌的菌絲體邊緣部分從培養(yǎng)的YMD平板上切下大約0.5厘米×0.5厘米大小的4到5個瓊脂小塊，并將所切小塊接種到Y(jié)BM(7.5％葡萄糖、4.5％麥芽提取物、5％酵母提取物、0.01％生物素、0.05％MgCl2、0.01％FeSO4，pH 7.0)中，在250毫升三角瓶中于25℃下以100轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)6天。所培養(yǎng)的菌絲體用于分離總RNA以分離醇脫氫酶和醇脫氫酶的cDNA克隆。從層孔菌分離并培養(yǎng)的菌絲體的形態(tài)見圖1。
將所述分離的菌絲體以致死率高于95％的(250納米，30分鐘)紫外線照射，然后每天傳代培養(yǎng)30天以分離層孔菌J21。所得突變菌株在YMD培養(yǎng)基中于25℃下以100轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)6天，并用于分離總RNA以分離醇脫氫酶和醇脫氫酶的cDNA克隆。
用層孔菌J21產(chǎn)生醇的人工培養(yǎng)基最佳培養(yǎng)條件見下表1。
表1

醇脫氫酶的分離和純化分離的菌絲體層孔菌J21用紗布過濾，以體積比2∶1的比例與20mM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)(pH 8.0)混合，并用超聲波儀(Branson Sonifier 250，美國)破碎。所得破碎液體在4℃下以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，并且所得上清液通過透析膜用20mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)透析，并用作輔酶溶液(coenzyme solution)。所述輔酶溶液通過二乙胺基乙基纖維交聯(lián)葡聚糖A-50離子交換柱(DEAE Sephadex A-50ion-exchange column)、交聯(lián)葡聚糖G-200柱(Sephadex G-200 column)和交聯(lián)葡聚糖G-75柱(Sephadex G-75 column)分級分離純化。最終得到48.6單位/毫克(U/mg)分離純化的酶，產(chǎn)率3.5％(見表2)。
表2

酶分子量的測定所述純化的酶在90伏特進行2小時的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE electrophoresis)并通過銀染色確認(rèn)蛋白帶。酶的分子量以比移值(Rf value)通過對數(shù)圖表計算。測定的純化ADH酶的分子量為約46000道爾頓。所述電泳和得自層孔菌J21的醇脫氫酶的分子量見圖2。
分離總RNA所述菌絲體層孔菌J21在液體介質(zhì)中培養(yǎng)6天，富集所培養(yǎng)的菌絲體，并用液氮凍干，用研缽徹底破碎。根據(jù)RNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN)的測試步驟處理100毫克破碎菌絲體以分離總RNA。所得分離的RNA用紫外分光光度計定量，通過RT-PCR用以醇脫氫酶的cDNA克隆。
實施例2 醇脫氫酶的cDNA克隆和堿基序列分析用反轉(zhuǎn)錄酶III(Invitogen)和CapFishingTM全長cDNA預(yù)混合試劑盒(Cap Fishing TM Full-length cDNA Premix kit(Seegene))提供的寡聚脫氧胸腺嘧啶連接體(oligo dT-adaptor)從3微克菌絲體層孔菌J21的總RNA合成第一鏈cDNA。所述合成的第一鏈cDNA的5’末端區(qū)域與Cap Fishing TMFull-length cDNA Premix kit(Seegene)提供的5’-RACE相連，然后進行PCR。所述PCR擴增用本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計的引物(正向ph-adh-1和反向ph-adh-2)和由Seegene提供的3’-RACE引物完成，因此合成了第二鏈cDNA。使用BLAST數(shù)據(jù)庫的相關(guān)高度保守堿基序列區(qū)域設(shè)計所述引物。所得PCR產(chǎn)物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳(圖3)。正如所期望的，用正向ph-adh-1和反向ph-adh-2引物組的PCR產(chǎn)物的長度為約960個堿基對，用ph-adh-1和3’-RACE引物組的PCR產(chǎn)物的長度為1160個堿基對。對所期望的每一PCR產(chǎn)物都進行擴增和電泳，然后將所需的DNA帶從凝膠中切離。將分離的PCR產(chǎn)物(960個堿基對)克隆到T-載體(T-vector)并分析其DNA堿基序列。為了在960堿基對片段DNA堿基序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建測序引物(sequencing primer)，以及獲得3’區(qū)域堿基序列信息，對所述1160堿基對的片段進行了直接的局部堿基序列分析，沒有將PCR產(chǎn)物克隆到載體中。為了獲得層孔菌ADH 的cDNA的5’區(qū)域序列信息，所述被分析的堿基序列(960堿基對)用于設(shè)計ph-adh-R3和ph-adh-R4引物，并用分別用ph-adh-R3和5’-RACE的引物組以及ph-adh-R4和5’-RACE的引物組進行PCR擴增。在此情況下，所述PCR擴增反應(yīng)完成35個循環(huán)在94℃變性30秒，在55℃退火30秒以及72℃延伸1分鐘。用所述ph-adh-R4和5’-RACE引物組使1微升用所述ph-adh-R3和5’-RACE引物組得到的PCR產(chǎn)物完成嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nest-PCR)，以最終獲得約460堿基對的片段(圖6)，然后測定層孔菌J21 ADH的5’區(qū)域堿基序列?？寺〉膶涌拙鶭21ADH全長cDNA SEQ IDNO9為編碼SEQ ID NO10的379個氨基酸的1137個堿基對。本實施例應(yīng)用的引物見于下表3。
表3

層孔菌J21 ADH的cDNA的堿基序列分析將層孔菌J21 ADH的cDNA與BLAST數(shù)據(jù)庫中的其他種類的ADH基因比較，結(jié)果它與ADH III具有高度相似性。同時所述cDNA與芽殖酵母(budding yeast)、裂殖酵母(fission yeast)、線蟲(C.elegans)、斑馬魚(zebra fish)以及人類的DNA比較，結(jié)果顯示出與所述基因分別達(dá)57.6％、55.0％、51.8％、57.2％和49.7％的同源性。
這些基因的進化系統(tǒng)樹(phylogenetic tree)見圖7。同時，將所述層孔菌J21ADH的cDNA與現(xiàn)有技術(shù)報道的傘菌ADH III比較，結(jié)果所述cDNA與傘菌ADH III表現(xiàn)出68％的同源性。
實施例3 利用菌絲體層孔菌J21的乙醇發(fā)酵和酒精飲料產(chǎn)品用實施例1制備的菌絲體層孔菌J21制造新型酒精飲料的具體方法見圖9。如圖9所示，原料米蒸煮后，用酒曲米曲霉接種，在25-30℃下培養(yǎng)3天以產(chǎn)生酵母(yeast)。在此期間，淀粉糖化作用發(fā)生。在本發(fā)明中，淀粉發(fā)酵通過用菌絲體層孔菌J21代替澄清過濾米酒常用的清酒酵母(Saccharomyces sake)，接種所述糖化了的淀粉，然后在25℃下發(fā)酵淀粉14天完成(見圖9)。通過向酒曲中加入包含得自層孔菌J21的醇脫氫酶的菌絲體制備的酒精飲料的乙醇濃度在發(fā)酵后第11天為16.7％。
實驗實施例1野生型層孔菌與實施例1制備的突變菌絲體層孔菌J21相關(guān)特征互相對比，結(jié)果見下表4。
表4

從上述表4可以看出，突變菌絲體層孔菌J21的醇脫氫酶活性比野生型層孔菌的醇脫氫酶活性高，并且因此表現(xiàn)高乙醇產(chǎn)量。
實驗實施例2 用層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料的溶解血栓活性和抑制血栓形成的功效為了測量溶解血栓活性，根據(jù)Haverkata-Trass的纖維蛋白平板法(fibrin plate method)，將在0.2M的硼酸緩沖液(pH 7.8)中的20單位的凝血酶逐滴加入到10毫升2％凝膠溶液中的0.2％纖維蛋白原并充分混合，將所得混合物傾倒在有蓋培養(yǎng)皿(petri-dish)上，形成纖維蛋白膜。100微升用菌絲體層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料被紙片吸收，并于37℃在所述培養(yǎng)皿上放置18個小時。隨所述纖維蛋白被酶溶解，測量所述溶解面積以測定相對活性。為了測定抑制血栓形成功效，將200微升用菌絲體層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料與200微升凝血酶(12.5單位/毫升)混合，在37℃放置5分鐘，向其中加入800微升0.33％的血纖維蛋白，并且徹底地混合。觀察混合物的凝結(jié)時間，結(jié)果見圖10。測試結(jié)果中，觀察到所述用菌絲體層孔菌J21制備的發(fā)酵酒精飲料具有溶解血栓活性和抑制血栓形成功效。
實驗實施例3 給予得自層孔菌J21發(fā)酵的酒精飲料以及其他酒精飲料的小鼠的GOT和GPT水平分析自由飲食(free diet)2周使適應(yīng)實驗室環(huán)境后，應(yīng)用8周齡健康雄性Sprague-Dawley白鼠。為了說明功能性，每只鼠口服給予或者3毫升的層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料或3毫升另一種酒精飲料，每天兩次給予10天，然后從每個動物的血液中分離分析GOT和GPT水平用的血清，結(jié)果見圖11。從圖11可以看出，與給予另一種酒精飲料的鼠相比，給予層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料的鼠具有較低的GOT和GPT水平。
實驗實施例4 給予層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料的鼠的血清膽固醇和中性脂(甘油三酯)水平的測量分析給予層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料或另一酒精飲料(14％乙醇)的鼠的血清總膽固醇和中性脂(甘油三酯)水平，結(jié)果見圖12。從圖12可以看出，與給予另一種酒精飲料(14％乙醇)的鼠相比，給予層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料的鼠具有較低的血清總膽固醇和甘油三酯水平。
實驗實施例5 層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料在鼠肝組織方面的功效層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料在鼠肝組織方面的功效見圖13。從口服給予或者所述層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料(14％乙醇)或者另一種酒精飲料(14％乙醇)的每只白鼠分離肝組織，然后染色。結(jié)果所述給予其他酒精飲料(14％乙醇)的鼠的肝組織中觀察到部分的炎癥，但是給予層孔菌J21發(fā)酵酒精飲料的鼠的肝組織中無炎癥位點，并與那些給予生理鹽水的鼠顯示相似的圖案。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，具有溶解血栓活性并減少乙醇引起的肝功能損傷的功能酒精飲料得以制備。因此本發(fā)明能對國民健康(nationalhealth)做出貢獻。
雖然為了解釋說明目的對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在不背離本發(fā)明權(quán)利要求所述的范圍和精華的前提下，可以對本發(fā)明作出各種修飾、添加或減少。
序列表<110>株式會社千年約束<120>應(yīng)用層孔菌J21制備新型功能性酒精飲料的方法<130>16189YOL<150>KR10-2005-0102524<151>2005-10-28<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚脫氧胸腺嘧啶連接體<400>1ctgtgaatgc tgcgactacg attttttttt tttttttttt40<210>2<211>22<212>DNA<213>5′-RACE引物<400>2gtctaccagg cattcgcttc at 22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′-RACE引物<400>3ctgtgaatgc tgcgactacg at 22<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ph-adh-1正向引物<400>4tgtcacactg atgactacac 20
<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ph-adh-4正向引物<400>5tcccttccaa ctggtcactg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ph-adh-2反向引物<400>6tggtgggtga cgaattcatc 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ph-adh-R3反向引物<400>7accttgacga cggagacatc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ph-adh-R4反向引物<400>8gcggccttga gtagctctga 20<210>9<211>1137<212>DNA<213>層孔菌J21<400>9atgtctaccg ctggtcaagt tatcaaatgt cgtgctgctg tcgcttggga agctggcaag 60cctttgagca ttgaggaagt cgaagtcgct gctcccaagg ctcacgaagt ccgtatcaag 120
attatgtata ctggcgtttg tcacactgat gcttacactc tttctggtgt tgatcctgaa180ggtgtcttcc ctgctattct gggacacgaa ggtggcggta ttgtcgaatc tgttggtgag240ggtgtcactg atgtcgctgt cggcgaccac gtcattccct tgtacactgc tgaatgtggt300aaatgtaagt tctgcaagag tggaaagacc aatttgtgtg gctccgtcag agctactcaa360ggccgcggtt tgatgcctga tgagtctgtt cgcttcactt gcaagggcca acccatctac420cattatacgg gcacttccac cttctctgaa tacaccgtcg ttgctgatgt ctccgtcgtc480aaggtggacc ccaagcccag tcttcaaaag ctctgtctct tgggctgcgg tgtcaccact540ggctttggtg ctgccaccaa gactgtcaag gtgcaagagg gtgacagtgt cgctgtcttt600ggtgtcggct gtattggttt gagtgtcatt caaggcgctg cctacaacaa ggccaagcgc660atcattgcca ttgacaccaa ccccaacaag gaaaagcttg cccgtgaatt tggtgctact720gactttatca accctactga catcaagggc cctattcaaa accaccttgt ggagatcact780gatggcggtt tggaatacac ttttgactgt accggtaatg ttgatgtgat gcgcgctgct840ttggaagctt gccacaaggg ctggggtgag tctgtcatca ttggcgttgc tgctgccggt900aaggaaatca gcactcgtcc cttccaactg gtcactggtc gtgtctggcg tggatccgct960ttcggtggcg tcaagggtcg ctctgagatg ggcggcctcg ttcaaaagta cttggatggc 1020caattgaagg ttgatgagtt cattacccac acctttgatt tcgagcaaat caacgatgct 1080ctcgatgcca tgcactctgg atcttgtatc cgtgctgttg tcactgttca aaaggac 1137<210>10<211>1137<212>PRT<213>層孔菌J21<400>10Met Ser Thr Ala Gly Gln Val Ile Lys Cys Arg Ala Ala Val Ala Trp1 5 10 15Glu Ala Gly Lys Pro Leu Ser Ile Glu Glu Val Glu Val Ala Ala Pro20 25 30Lys Ala His Glu Val Arg Ile Lys Ile Met Tyr Thr Gly Val Cys His35 40 45Thr Asp Ala Tyr Thr Leu Ser Gly Val Asp Pro Glu Gly Val Phe Pro50 55 60
Ala Ile Leu Gly His Glu Gly Gly Gly Ile Val Glu Ser Val Gly Glu65 70 75 80Gly Val Thr Asp Val Ala Val Gly Asp His Val Ile Pro Leu Tyr Thr85 90 95Ala Glu Cys Gly Lys Cys Lys Phe Cys Lys Ser Gly Lys Thr Asn Leu100 105 110Cys Gly Ser Val Arg Ala Thr Gln Gly Arg Gly Leu Met Pro Asp Glu115 120 125Ser Val Arg Phe Thr Cys Lys Gly Gln Pro Ile Tyr His Tyr Thr Gly130 135 140Thr Ser Thr Phe Ser Glu Tyr Thr Val Val Ala Asp Val Ser Val Val145 150 155 160Lys Val Asp Pro Lys Pro Ser Leu Gln Lys Leu Cys Leu Leu Gly Cys165 170 175Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Ala Ala Thr Lys Thr Val Lys Val Gln180 185 190Glu Gly Asp Ser Val Ala Val Phe Gly Val Gly Cys Ile Gly Leu Ser195 200 205Val Ile Gln Gly Ala Ala Tyr Asn Lys Ala Lys Arg Ile Ile Ala Ile210 215 220Asp Thr Asn Pro Asn Lys Glu Lys Leu Ala Arg Glu Phe Gly Ala Thr225 230 235 240Asp Phe Ile Asn Pro Thr Asp Ile Lys Gly Pro Ile Gln Asn His Leu245 250 255Val Glu Ile Thr Asp Gly Gly Leu Glu Tyr Thr Phe Asp Cys Thr Gly260 265 270Asn Val Asp Val Met Arg Ala Ala Leu Glu Ala Cys His Lys Gly Trp275 280 285Gly Glu Ser Val Ile Ile Gly Val Ala Ala Ala Gly Lys Glu Ile Ser290 295 300Thr Arg Pro Phe Gln Leu Val Thr Gly Arg Val Trp Arg Gly Ser Ala305 310 315 320Phe Gly Gly Val Lys Gly Arg Ser Glu Met Gly Gly Leu Val Gln Lys325 330 335Tyr Leu Asp Gly Gln Leu Lys Val Asp Glu Phe Ile Thr His Thr Phe340 345 350Asp Phe Glu Gln Ile Asn Asp Ala Leu Asp Ala Met His Ser Gly Ser355 360 365
Cys Ile Arg Ala Val Val Thr Val Gln Lys Asp370 375Val Glu Ile Thr Asp Gly Gly Leu Glu Tyr Thr Phe Asp Cys Thr Gly260 265 270Asn Val Asp Val Met Arg Ala Ala Leu Glu Ala Cys His Lys Gly Trp275 280 285Gly Glu Ser Val Ile Ile Gly Val Ala Ala Ala Gly Lys Glu Ile Ser290 295 300Thr Arg Pro Phe Gln Leu Val Thr Gly Arg Val Trp Arg Gly Ser Ala305 310 315 320Phe Gly Gly Val Lys Gly Arg Ser Glu Met Gly Gly Leu Val Gln Lys325 330 335Tyr Leu Asp Gly Gln Leu Lys Val Asp Glu Phe Ile Thr His Thr Phe340 345 350Asp Phe Glu Gln Ile Asn Asp Ala Leu Asp Ala Met His Ser Gly Ser355 360 365Cys Ile Arg Ala Val Val Thr Val Gln Lys Asp370 37權(quán)利要求
1.一種突變菌絲體層孔菌J21(Phellinus sp.J21)，其中，該層孔菌J21得自層孔菌，該層孔菌J21的保藏編號為KCTC 10847BP。
2.一種制備酒精飲料的方法，該方法包括如下步驟1)用254納米的紫外線照射層孔菌30分鐘，并每日傳代培養(yǎng)所述被照射的菌株30天，以制備層孔菌J21，該層孔菌J21的保藏編號為KCTC10847BP；2)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述層孔菌J21；并且3)以重量比2∶3∶5混合酒曲、蒸米飯和水，并用所得混合物培養(yǎng)上述培養(yǎng)的菌絲體。
3.一種酒精飲料，該酒精飲料根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法用菌絲體層孔菌J21制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酒精飲料，該酒精飲料具有減輕肝功能損傷的功效，與一般酒精飲料相比，該飲料顯示出溶解血栓活性和抑制血栓形成活性，并具有較低的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平、血清膽固醇以及中性脂水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酒精飲料，該飲料選自由啤酒、果酒和澄清過濾米酒所組成的組中。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種突變菌絲體層孔菌以及用所述變菌絲層孔菌突體制備酒精飲料的方法。更具體地，本發(fā)明是關(guān)于從層孔菌中制備突變菌絲體層孔菌J21(Phellinus sp.J21)的方法、在人工液體營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)該突變菌絲體層孔菌J21的方法、從培養(yǎng)的層孔菌J21中分離并純化醇脫氫酶的方法和克隆所述醇脫氫酶基因的方法，本發(fā)明還關(guān)于使用所述突變株菌絲體制備的功能酒精飲料和制備所述酒精飲料的方法。
文檔編號C12P7/06GK1955277SQ200610072148
公開日2007年5月2日 申請日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者鄭永基, 金星烈, 林學(xué)燮, 李康寧, 鄭恩赪 申請人:株式會社千年約束