專(zhuān)利名稱(chēng)：長(zhǎng)效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白及其制備和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療貧血癥的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)融合蛋白rhEPO-Fc，制備和純化該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在醫(yī)藥中的用途。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成素(EPO)是調(diào)控人紅細(xì)胞形成的主要調(diào)節(jié)因子。EPO是一種糖蛋白，在胎兒體內(nèi)由腎臟及肝臟產(chǎn)生，而在成人體內(nèi)主要由腎臟產(chǎn)生。腎功能受到損害，如在慢性腎衰竭的病人中，紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生受到妨礙，可導(dǎo)致貧血的產(chǎn)生。正常人體內(nèi)血液中紅細(xì)胞生成素的含量為10～18毫單位/毫升。當(dāng)體內(nèi)缺氧時(shí)，紅細(xì)胞生成素的含量可提高到1000倍以上。紅細(xì)胞生成素與靶細(xì)胞如骨髓細(xì)胞、脾細(xì)胞、胎兒肝細(xì)胞上的特定位點(diǎn)結(jié)合，從而促進(jìn)紅細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、分化并成熟為紅細(xì)胞，增加骨髓向循環(huán)血中紅細(xì)胞的釋放量。由此可見(jiàn)，紅細(xì)胞生成素是一種重要的造血生長(zhǎng)因子，對(duì)體內(nèi)紅細(xì)胞的生成起著不可缺少的調(diào)控作用。
Epo為單鏈多肽，包括166個(gè)氨基酸，含兩對(duì)二硫鍵(Cys7-161和Cys29-33)以及四個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其中有三個(gè)N-連接位點(diǎn)(Asn24，Asn38，Asn83)和一個(gè)O-連接位點(diǎn)(Ser126)。Epo的分子量為30-34kDa，其中多肽僅為18kDa。40％糖基化的Epo的主要糖鏈結(jié)構(gòu)為N-連接的復(fù)合型多糖，在Epo的生物學(xué)活性中發(fā)揮重要作用。
靶細(xì)胞受EPO刺激后先是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的聚集。FVA細(xì)胞在4℃受高濃度EPO刺激1分鐘后，其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)即有Ca2+聚集。單個(gè)紅系前體細(xì)胞受EPO刺激后細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度升高，這是由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的重新分布，而不是因?yàn)榧?xì)胞外Ca2+進(jìn)入了細(xì)胞。EPO作用于靶細(xì)胞后的另一效應(yīng)是使細(xì)胞內(nèi)DNA合成增加。如無(wú)EPO存在，即使增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度，也不能使紅系前體細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化，說(shuō)明Ca2+很可能在紅系細(xì)胞的增殖和分化中起輔助作用。
此外，缺氧小鼠注射EPO后0.5-2.0小時(shí)，其脾臟中紅系造血前體細(xì)胞RNA聚合酶II活性增強(qiáng)，3-12小時(shí)后RNA聚合酶I活性增強(qiáng)，非組蛋白合成增強(qiáng)。12-14小時(shí)后RNA酶II活性再次增強(qiáng)，同時(shí)DNA聚合酶α活性增強(qiáng)，組蛋白合成增加。48小時(shí)后，DNA合成量達(dá)最大值。
血紅蛋白的合成也受EPO的影響，骨髓被抑制和刺激的大鼠骨髓細(xì)胞在體外培養(yǎng)中加入EPO后2小時(shí)，其球蛋白mRNA水平即出現(xiàn)差別。FAV細(xì)胞在體外經(jīng)EPO刺激后6小時(shí)有β球蛋白mRNA生成，純化的CFU-E經(jīng)EPO作用后不到1小時(shí)有球蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果表明，球蛋白基因的轉(zhuǎn)錄可能是EPO對(duì)造血細(xì)胞的最早效應(yīng)。
紅細(xì)胞過(guò)多的大鼠，骨髓紅細(xì)胞生成受到嚴(yán)重抑制。這種細(xì)胞有足量的合成血紅蛋白的酶，但不能合成血紅蛋白。經(jīng)EPO刺激后有膽色素原脫氨酶出現(xiàn)，用于血紅素合成的酶沒(méi)有變化。這一限速酶的合成在EPO刺激后20～24小時(shí)出現(xiàn)。
此外，F(xiàn)AV細(xì)胞經(jīng)EPO刺激后6小時(shí)，轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始增加，到24小時(shí)后增加1倍。骨髓抑制的大鼠骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)表明，EPO可促進(jìn)骨髓細(xì)胞表達(dá)一些紅細(xì)胞膜成分及一些在紅系細(xì)胞分化過(guò)程中只一過(guò)性地表達(dá)的成分，說(shuō)明EPO對(duì)造血細(xì)胞有多方面的作用。
目前，EPO已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于治療慢性腎衰引起的貧血。此外，EPO對(duì)改善AZT治療AIDS病人后誘導(dǎo)的貧血狀態(tài)有明顯作用。EPO還用于治療腫瘤引起的貧血和腫瘤化療引起的貧血、治療早產(chǎn)兒貧血、治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎引起的貧血。在手術(shù)前給予EPO能增加病人自體血液回輸?shù)牧浚谑中g(shù)前后應(yīng)用EPO能刺激骨髓細(xì)胞使手術(shù)中的失血得到較快的代償。
IgG類(lèi)免疫球蛋白是人體血液中最豐富的蛋白，其半衰期可達(dá)21天。已有報(bào)道顯示將IgG的Fc片段與其他蛋白融合，可顯著增加該蛋白在體內(nèi)的生物活性和半衰期。這種方法已經(jīng)應(yīng)用于一些臨床上很重要的細(xì)胞因子和可溶性受體，并獲得了成功，如sTNF-αR、LFA3、IL-2、INF-α等等。
EPO在體內(nèi)的半衰期僅為4到11.2小時(shí)，對(duì)病人而言這就需要在一周內(nèi)接受2～3次的注射。本發(fā)明的申請(qǐng)人選擇裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段接至Epo的C-末端，構(gòu)建rhEpo-Fc融合蛋白，大大提高了EPO在體內(nèi)的半衰期，同時(shí)在相同分子數(shù)基礎(chǔ)上保持與天然Epo相似的生物學(xué)活性，并實(shí)現(xiàn)了融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO中的高效表達(dá)，且純化工藝簡(jiǎn)單，利于進(jìn)一步的大規(guī)模制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種用于治療貧血癥的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)融合蛋白rhEPO-Fc，該多肽是包含SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、類(lèi)似物或衍生物。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，rhEPO-Fc由SEQ ID NO6所示氨基酸序列構(gòu)成。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種編碼重組人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白rhEPO-Fc的多核苷酸分子，其特征在于它是與SEQ ID NO6編碼相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)、但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸分子包含SEQ ID NO5所示的核苷酸序列；更優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸分子是SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有編碼本發(fā)明多核苷酸的重組表達(dá)載體、由該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及由該宿主細(xì)胞所衍生的新的株系或細(xì)胞系。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明多核苷酸分子的重組真核表達(dá)載體pEPO-Fc，以及含有該重組表達(dá)載體的遺傳工程宿主細(xì)胞pEPO一Fc/CHO。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備rhEPO-Fc融合蛋白的方法，其包括在適于該融合蛋白的條件下培養(yǎng)用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化該重組融合蛋白的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、離心后，上清液分別用親和層析和分子篩層析純化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親和層析是rProtein ASepharose FF親和層柱，分子篩是Superdex 200prep grade柱。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有本發(fā)明rhEPO-Fc融合蛋白作為活性成分和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物，以及該藥物組合物在治療貧血癥的藥物中的用途，包括慢性腎衰引起的貧血、AZT治療AIDS病人后誘導(dǎo)的貧血、腫瘤引起的貧血、腫瘤化療引起的貧血、早產(chǎn)兒貧血以及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等原因引起的貧血。
本文中提到的rhEPO-Fc融合蛋白的“同源性”多肽是指，多肽本來(lái)具有rhEPO-Fc融合蛋白的氨基酸序列，但其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代，并且所得到的多肽可用于實(shí)施本發(fā)明。保守氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的。造成這樣的取代的規(guī)則包含由Dayhof，M.D.(1978，國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金，Washington，D.C.，第5卷，增刊3)等所述的取代規(guī)則。更具體地說(shuō)，保守氨基酸取代發(fā)生在與其酸性、極性或側(cè)鏈大小相關(guān)聯(lián)的氨基酸家族內(nèi)。一般可將遺傳編碼的氨基酸分為四組(1)酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電的極性氨基酸甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分類(lèi)為芳香氨基酸。任何特定組內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)取代，例如用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用絲氨酸取代蘇氨酸，或任何其他氨基酸殘基結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸殘基，例如有相似酸性、極性、側(cè)鏈大小的，或在其某些組合方面有相似性的氨基酸殘基取代，一般對(duì)多肽的功能或免疫原性不會(huì)有太大影響。
在本發(fā)明中，“SEQ ID NO6所示氨基酸序列的類(lèi)似物”被定義為，與SEQ ID NO6相比較，具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代，刪除，轉(zhuǎn)換或增加的分子?！癝EQ ID NO6所示氨基酸序列的衍生物”被定義為如下一種分子，它具有SEQ ID NO6或SEQ ID NO6類(lèi)似物氨基酸序列，但是另外還具有化學(xué)修飾的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基?；瘜W(xué)修飾包括增加部分化學(xué)結(jié)構(gòu)，生成新鍵，和除去部分化學(xué)結(jié)構(gòu)。對(duì)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾包括賴(lài)氨酸ε-氨基的酰基化，精氨酸，組氨酸或賴(lài)氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰氨基。末端氨基的修飾包括脫氨基，N-低級(jí)烷基修飾，N-二低級(jí)烷基修飾和N-?；揎?。對(duì)末端羧基的修飾包括酰胺修飾，低級(jí)烷基酰胺修飾，二烷基酰胺修飾和低級(jí)烷基酯修飾。低級(jí)烷基是C1-C4烷基。并且，還可以用蛋白質(zhì)化學(xué)的普通技術(shù)人員熟知的保護(hù)基，保護(hù)一個(gè)或幾個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)或末端基團(tuán)。還可以使氨基酸的α-碳原子單甲基化或二甲基化。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸分子”是指單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個(gè)或多個(gè)原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列，化學(xué)合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應(yīng)的反義鏈。
生產(chǎn)和操作本文公開(kāi)的多核苷酸分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的重組技術(shù)完成(參見(jiàn)Maniatis等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)，Greene PublishingAssociates & Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995，PCR策略，AcademicPress，Inc.，San Diego；和Erlich(編)，1992，PCR技術(shù)，牛津大學(xué)出版社，New York)。
本發(fā)明提供了包含編碼rhEPO-Fc融合蛋白的一種多核苷酸分子，在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的編碼rhEPO-Fc融合蛋白的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列(1)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO5所示核苷酸序列至少70％相同、優(yōu)選至少80％相同、更優(yōu)選至少90％相同、最優(yōu)選至少95％相同的核苷酸序列；(3)在中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下(即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中于42℃洗滌的條件；參見(jiàn)Ausubel等(編)，1989，分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)，第1卷，Green Publishing Associntes，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)、優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件(即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.1xSSC/0.1％SDS中于68℃洗滌條件；參閱Ausubel等，1989，上述文獻(xiàn))下與具有SEQ ID NO5或其互補(bǔ)序列的多核苷酸分子能雜交的核苷酸序列；或者(4)與SEQ ID NO6編碼相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)、但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
可用于表達(dá)本發(fā)明的rhEPO-Fc融合蛋白序列的各種表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，其中包括含有特定編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA和粘粒DNA表達(dá)載體?？山?jīng)加工而含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型原核表達(dá)載體質(zhì)粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)和pGEM-T EASY(Promega，Madison，WI)等?？山?jīng)加工而含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型真核表達(dá)載體包括蛻皮激素誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的系統(tǒng)(Promega，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen)，和基于桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)(Promega)等。
可用于實(shí)施本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞包括但不只限于微生物，例如用重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，或者用重組載體轉(zhuǎn)化的酵母，或者是動(dòng)物細(xì)胞，如用重組病毒載體如桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞，或用重組病毒載體如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。例如，可使用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株。真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，但也可有效地利用小鼠、倉(cāng)鼠、牛、猴或人細(xì)胞系等哺乳動(dòng)物細(xì)胞?？捎糜诒磉_(dá)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的真核宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NIH/3T3等。
含有本發(fā)明多肽的藥物組合物可用于多種治療目的，本發(fā)明的藥物組合物不僅用于治療慢性腎衰引起的貧血，還可以用于治療AZT治療AIDS病人后誘導(dǎo)的貧血、腫瘤引起的貧血和腫瘤化療引起的貧血、早產(chǎn)兒貧血、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎引起的貧血以及在手術(shù)前給予增加病人自體血液回輸?shù)牧?，在手術(shù)前后應(yīng)用刺激骨髓細(xì)胞使手術(shù)中的失血得到較快的代償。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如口服給藥、經(jīng)皮給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、局部給藥、經(jīng)鼻給藥等。根據(jù)所采用的給藥方式，可將本發(fā)明的多肽藥物組合物制成各種合適的劑型，其中包含至少一種有效劑量的本發(fā)明的多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的藥用載體。
適當(dāng)劑型的實(shí)例為片劑，膠囊，糖衣片劑，粒劑，口服溶液和糖漿，用于皮膚表面的油膏和藥貼，氣霧膠，鼻噴劑，以及可用于注射的無(wú)菌溶液等。
含有本發(fā)明多肽的藥物組合物可以制成溶液或者凍干粉末以用于胃腸外給藥。在使用前可加入適當(dāng)溶劑或其它可藥用的載體將粉末重新配制。液體配方一般是緩沖液、等滲溶液和水溶液。
劑型中還可含有其它常規(guī)組分，如防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、乳化劑、增甜劑、著色劑、調(diào)味劑等等。本發(fā)明藥物組合物中使用的穩(wěn)定劑優(yōu)選檸檬酸鈉、甘氨酸、甘露醇、神經(jīng)節(jié)糖苷等。含有本發(fā)明藥物組合物的注射水針或凍干粉針更優(yōu)選的配方包括，rhEPO-Fc 25-500μg，NaCl 4mg，磷酸鹽3.02mg，甘氨酸5.0-20mg或甘露醇10-30mg，注射用水0.5ml。
若有特殊治療要求，本發(fā)明的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，這種相伴使用有利于治療。
本發(fā)明藥物組合物中多肽的用量可以在一個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)一些已知的因素，諸如根據(jù)疾病的種類(lèi)、病情嚴(yán)重程度、病人體重、劑型、給藥途徑等因素很容易的加以確定。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.在分子數(shù)相同時(shí)與天然EPO相比，具有類(lèi)似的生物活性。
2.在動(dòng)物的藥代試驗(yàn)中顯示出顯著延長(zhǎng)的半衰期。
3.選擇IgG2的Fc片段作為融合片段，避免副作用的產(chǎn)生。
4.表達(dá)量高，穩(wěn)定性好，易于放大生產(chǎn)，成本低廉。
本發(fā)明的工程細(xì)胞連續(xù)傳代103代后，仍能穩(wěn)定分泌表達(dá)rhEPO-Fc融合蛋白。通過(guò)滾瓶培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)30余次的數(shù)據(jù)，表達(dá)量均在40～65mg/L/3d。每次細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模都在30～40L左右。滾瓶培養(yǎng)方式的一個(gè)特點(diǎn)，就是便于在一定規(guī)模下放大生產(chǎn)，通?？煞奖愕胤糯蟮?50～400L。在純化方面，由于融合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清中含量高，而純化工藝中的rProteinA Sepharose FF親和層析步驟具有很高的純化效率，每毫升凝膠可結(jié)合50mg左右的融合蛋白，更易于放大生產(chǎn)。EPO-Fc融合蛋白的臨床使用劑量很小，為微克級(jí)劑量。預(yù)計(jì)每個(gè)劑量小于100μg。因此，其生產(chǎn)成本更為低廉。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.顯示重組質(zhì)粒pEPO-Fc的構(gòu)建過(guò)程。
圖2.顯示Epo的RT-PCR結(jié)果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Roche DNA M.W.Marker VIII)，泳道C為陰性對(duì)照，泳道1和2為RT-PCR產(chǎn)物。
圖3.顯示IgG2Fc的RT-PCR結(jié)果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Roche DNA M.W.Marker VIII)，泳道1和2為RT-PCR產(chǎn)物。
圖4.顯示重組質(zhì)粒pUC18-Epo的酶切鑒定結(jié)果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，3、4、6和9分別代表3、4、6和9號(hào)克隆。
圖5.顯示重組質(zhì)粒pUC18-Epo-Fc的酶切鑒定結(jié)果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、5、6、7、8、9和12分別代表1、5、6、7、8、9和12號(hào)克隆。
圖6.顯示重組質(zhì)粒pEpo-Fc的酶切鑒定結(jié)果(1％Agarose電泳)。
圖7.顯示不同克隆的基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果(1％Agarose電泳)，其中泳道C1為陽(yáng)性對(duì)照(以pEpo-Fc為模板)，泳道1為B4-3克隆，泳道2為A1-6克隆，泳道3為C1-5克隆，泳道4為A6-5克隆，泳道C2為陰性對(duì)照。
圖8.顯示不同克隆的總RNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(1kb DNA ladder)，泳道C1為陰性對(duì)照，泳道C2為陽(yáng)性對(duì)照(以pEpo-Fc為模板)，泳道1為B4-3克隆，泳道2為A1-6克隆，泳道3為C1-5克隆。
圖9.顯示純化后蛋白的電泳圖譜(12％SDS-PAGE)，其中泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Promega)，泳道S為純化后的樣品。
圖10.顯示rhEPO-Fc與天然rhEPO半效量比較(細(xì)胞依賴(lài)株檢測(cè)法)。
實(shí)施例實(shí)施例一Epo目的基因及人IgG2Fc片段基因的獲得我們采用RT-PCR方法從正常人血液提取的總RNA中擴(kuò)增Epo的cDNA片段。根據(jù)Epo基因序列設(shè)計(jì)的引物為5’引物5’CTC CAA GCT TGC TAG CAT GGG GGT GCA CGA ATG TCC TG 3’(SEQID NO7)3’引物5’GCG GAT CCT CTG TCC CCT GTC CTG CAG GCC TC 3’(SEQ ID NO8)為了能將PCR產(chǎn)物直接插入克隆載體，我們?cè)?’引物中引入了Hind III和NheI酶切位點(diǎn)，在3’引物中引入了BamH I酶切位點(diǎn)。
RT-PCR反應(yīng)條件如下RT-PCR反應(yīng)混合物在50℃變性30分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)94℃變性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸45秒，反應(yīng)10個(gè)循環(huán)。
PCR反應(yīng)94℃變性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸45秒，反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。然后68℃再延伸12分鐘。
反應(yīng)完成后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物。如圖2所示，我們得到了預(yù)計(jì)大小的DNA片段(約590bp)。經(jīng)測(cè)序，擴(kuò)增的Epo cDNA片段的核苷酸序列為SEQ IDNO1，其氨基酸序列為SEQ ID NO2。
同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)如下引物擴(kuò)增IgG2Fc片段cDNA5’引物5’CGG GAT CCG AGC GCA AAT GTT GTG TCG AGT GC 3’(SEQ ID NO9)3’引物5’GGA ATT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AGG 3’(SEQ ID NO10)為了能將PCR產(chǎn)物插入克隆載體，我們?cè)?’引物中引入了BamH I位點(diǎn)，在3’引物中引入了EcoR I位點(diǎn)。
以正常人淋巴細(xì)胞總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增IgG2Fc片段，反應(yīng)條件如下RT-PCR反應(yīng)混合物在50℃變性30分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)94℃變性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸1分鐘，反應(yīng)10個(gè)循環(huán)。
PCR反應(yīng)94℃變性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分鐘，反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。然后68℃再延伸12分鐘。
反應(yīng)完成后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物。如圖3所示，我們得到了預(yù)計(jì)大小的DNA片段(約700bp)。經(jīng)測(cè)序，擴(kuò)增的IgG2Fc cDNA片段的核苷酸序列為SEQ ID NO3，其氨基酸序列為SEQ ID NO4。
實(shí)施例二重組質(zhì)粒的構(gòu)建如上所述，我們?cè)谟糜跀U(kuò)增Epo cDNA的5’引物中引入了Hind III酶切位點(diǎn)，在3’引物中引入了BamH I酶切位點(diǎn)，這樣可將Epo的cDNA片段直接插入克隆載體pUC18的多克隆位點(diǎn)Hind III/BamH I中，IgG2Fc片段插入到pUC18的多克隆位點(diǎn)BamH I/EcoRI中，即可得到Epo-Fc融合片段。測(cè)序鑒定后，再用Nhe I和EcoR I回切插入表達(dá)載體pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)Nhe I/EcoR I中，即可得到真核表達(dá)質(zhì)粒pEpo-Fc。其構(gòu)建過(guò)程詳見(jiàn)圖1。
1.重組質(zhì)粒pUC18-Epo的構(gòu)建將在實(shí)施例1中擴(kuò)增的Epo cDNA片段插入pUC18(市售)的Hind III/BamH I位點(diǎn)，將連接產(chǎn)物pUC18-Epo轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機(jī)挑選12個(gè)克隆進(jìn)行篩選。重組質(zhì)粒pUC18-Epo的酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。3、4、6號(hào)克隆均用BamH I/Hind III回切出目的片段，選3號(hào)克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，并用于下一步的構(gòu)建。
2.重組質(zhì)粒pUC18-Epo-Fc的構(gòu)建以pUC18-Epo 3號(hào)克隆為基礎(chǔ)，將在實(shí)施例1中擴(kuò)增的IgG2Fc cDNA片段插入BamH I/EcoR I位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物pUC18-Epo-Fc轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機(jī)挑選12個(gè)克隆進(jìn)行篩選。重組質(zhì)粒pUC18-Epo-Fc的酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖5。1、5號(hào)克隆均用BamHI/EcoR I回切出目的片段，選1號(hào)克隆送去測(cè)序鑒定。
3.插入基因片段——Epo及IgG2Fc的序列測(cè)定選擇重組質(zhì)粒pUC18-Epo-Fc的1號(hào)克隆用PE公司的377全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序，插入的融合蛋白Epo-Fc片段的核苷酸序列為SEQ ID NO5，其氨基酸序列為SEQ ID NO6。測(cè)序結(jié)果表明我們所得到的重組質(zhì)粒中的目的基因與發(fā)表的Epo基因與IgG2Fc基因序列一致。
4.真核表達(dá)載體pEpo-Fc的構(gòu)建將Epo-IgG2Fc片段從pUC18-Epo-Fc的1號(hào)克隆切下來(lái)，插入到pcDNA3.1(市售)的Nhe I/EcoR I位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pEpo-Fc。將pEpo-Fc轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機(jī)挑選12個(gè)克隆進(jìn)行篩選。重組質(zhì)粒pEpo-Fc的酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6。2、3、4、5、9、10、12號(hào)克隆均用Nhe I/EcoR I回切出目的片段，選10號(hào)克隆進(jìn)行下一步的CHO穩(wěn)定表達(dá)株的篩選。
實(shí)施例三CHO穩(wěn)定表達(dá)株(CHO-EF細(xì)胞)篩選及鑒定取10μg大量制備的實(shí)施例2中的pEpo-Fc質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體Lipofectin轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。兩天后按1∶5的比例傳代，加入0.4mg/ml的G418篩選，10天可見(jiàn)克隆形成。隨機(jī)消化144個(gè)邊緣明顯分開(kāi)、細(xì)胞狀態(tài)良好的單克隆接種于6個(gè)24孔板培養(yǎng)(第一輪篩選)。
取三天后的培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，從中選出表達(dá)陽(yáng)性的39個(gè)克隆分別接種于2個(gè)24孔板(第二輪篩選)及1個(gè)6孔板(用于保種)，培養(yǎng)4天后，取上清用ELISA檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，從中選取表達(dá)較高的6個(gè)克隆A1-6、C1-5、B4-3、B5-5、A6-4、A6-5進(jìn)一步用有限稀釋法進(jìn)行篩選。
分別接種96孔板(5細(xì)胞/孔/200μl)(第三輪篩選)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后(大約13天后)，取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，B4-3、A6-4、C1-5均為均一的克隆，分別挑取表達(dá)較高的6個(gè)克隆接種24孔板，各平行接2孔。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，其中一孔用于保種，另一孔接種6孔板。待6孔板內(nèi)的細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，抽提基因組DNA和總RNA，用PCR鑒定整合入基因組的插入片段的存在情況，用RT-PCR鑒定插入片段的轉(zhuǎn)錄(即表達(dá))情況。結(jié)果如圖7和8所示，B4-3、A6-4、C1-5均為正確的克隆。
分別取B4-3(C3)、A6-4(B4)、C1-5(D8)接種96孔板(1細(xì)胞/孔/200μl)(第四輪篩選)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后(大約15天后)，取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，三個(gè)克隆均為均一的克隆，將其中表達(dá)最高的分別擴(kuò)增、保種，進(jìn)行下一步表達(dá)和純化。pEpo-Fc轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞后，將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞命名為CHO-EF細(xì)胞。
實(shí)施例四制備rhEPO-Fc融合蛋白大規(guī)模培養(yǎng)CHO-EF細(xì)胞，經(jīng)離心后上清液用1M的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3，用以10mMPB(pH7.3)平衡的rProtein A-Sepharose F.F.(Parmacia)親和層析柱進(jìn)行吸附，再用同樣的緩沖液洗滌親和柱至280nm的OD值小于0.01。用0.05～0.1M的檸檬酸緩沖液將融合蛋白洗下，收集洗脫峰并立即用200mM Na2HPO4調(diào)節(jié)pH至7.0。樣品濃縮后，上分子篩Superdex 200prep grade柱預(yù)先用20mMPBS(含150mMNaCl，pH7.2)緩沖液平衡，將濃縮后的樣品上樣純化。純化后的蛋白電泳圖譜見(jiàn)圖9，純度可達(dá)到98％以上。
實(shí)施例五制備以rhEPO-Fc為活性組份的注射劑/凍干劑配方rhEPO-Fc100mgNaCl8gNa2HPO4·12H2O 5.16gNaH2PO4·2H2O 0.874g甘氨酸 15g甘露醇 30g注射用水1000mlpH值7.2無(wú)菌過(guò)濾后分裝成0.5ml/支的注射水針劑或凍干，制成凍干粉針。
實(shí)施例六rhEPO-Fc在獼猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)本研究采用ELISA試劑盒測(cè)定獼猴血清中rhEPO-Fc濃度，并得出相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。同時(shí)還進(jìn)行方法學(xué)確證，包括方法回收率、精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度等。
1、分組和劑量該試驗(yàn)共分2組，分別是陽(yáng)性EPO對(duì)照組、rhEPO-Fc劑量組，每組3只獼猴。具體分組安排如下(1)EPO對(duì)照組—皮下給藥(等摩爾劑量)，即2.5ug/kg(2)rhEPO-Fc中劑量單次給藥組-皮下單次給藥10ug/kg2、采血點(diǎn)設(shè)計(jì)rhEPO-Fc組于皮下給藥后4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、168h、216h采血測(cè)定血清中rhEPO-Fc的濃度；陽(yáng)性EPO對(duì)照組于皮下給藥后15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、8h、12h、24h采血測(cè)定血清中rhEPO-Fc的濃度。
同時(shí)，每組還要進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為48h、120h、216h、312h、384h、480h、552h和648h，檢測(cè)的血液學(xué)具體指標(biāo)是網(wǎng)織細(xì)胞計(jì)數(shù)(RTC)、RBC和HB。
3、藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果皮下給予陽(yáng)性EPO后，2h達(dá)到最大濃度，濃度為30.4±1.8ng/ml；AUC0-24221.6±45.7ng.Equ.h·mL-1；MRT為6.9±0.4h；CL為10.2±2.0mL·h-1·kg-1；Vss為70.4±10.1mL·kg-1；消除半衰期為7.4±0.3h。
皮下給予rhEPO-Fc后，達(dá)峰時(shí)間為8h，達(dá)峰濃度為76.6±2.4ng/ml；AUC0-216為2715.1±289.0ng.Equ.h·mL-1；MRT為42.7±1.0h；CL為3.7±0.4mL·h-1·kg-1；Vss為156.9±15.6mL·kg-1；消除半衰期為33.2±4.5h。
實(shí)施例七重組人長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素(rhEPO-Fc)藥效學(xué)一、rhEPO-Fc給藥劑量設(shè)定在本試驗(yàn)中我們將試驗(yàn)藥rhEPO-Fc與陽(yáng)性對(duì)照藥EPO進(jìn)行比較。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合臨床給藥方案，選用一個(gè)有效劑量，陽(yáng)性EPO暫定500U/kg.day，每周給藥三次，連續(xù)用藥四周。rhEPO-Fc的劑量范圍設(shè)定陽(yáng)性藥EPO組的等摩爾量15μg/kg。作為長(zhǎng)效制劑，rhEPO-Fc的給藥周期和頻率定為每周一次，連續(xù)給藥四周。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為每周檢測(cè)一次、給藥前和末次給藥后一周，進(jìn)行生化和血液學(xué)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，以進(jìn)行時(shí)效關(guān)系的判定。
二、大鼠治療前后體重變化和體態(tài)變化試驗(yàn)大鼠自每日給予腺嘌呤灌胃給藥后，前七天由于藥物作用還未體現(xiàn)，所以體重增加很大，后七天受腺嘌呤的作用影響，體重增加很少甚至降低。給藥第七天開(kāi)始，大鼠飲水量、尿量均增加，同時(shí)伴有困盹、萎靡，活力下降；體毛逐漸干枯、僵變，部分還出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象。給藥rhEPO-Fc十天后，大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)能力明顯改善，體毛開(kāi)始光滑潤(rùn)澤，體重明顯增加很快。
三、腎衰模型前后大鼠血液、生化學(xué)指標(biāo)變化在給藥腺嘌呤7天后，所有大鼠血肌酐(Cr)和血清尿素氮(BUN)都逐漸上升，而RBC、Hb、Hct和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RTC)等逐漸下降。20天模型建成后，與試驗(yàn)前相比，Cr、BUN值有顯著增加，RBC、Hb值呈顯著下降，Hct值也降低，RTC值降低到接近0。表明腺嘌呤已經(jīng)使腎功能損壞，造成貧血。
四、rhEPO-Fc對(duì)大鼠腎功能的影響腎衰模型建立后，rhEPO-Fc治療前大鼠的肌酐和血清尿素氮值見(jiàn)表1，治療后的見(jiàn)表2和表3。用rhEPO-Fc治療后，給藥組大鼠的Cr和BUN逐漸回落，但仍然明顯高于正常大鼠對(duì)照組，表明腎臟功能仍然處于衰退狀態(tài)，rhEPO-Fc不能糾正腎衰表現(xiàn)。
五、對(duì)腎衰大鼠貧血的治療作用經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照EPO和rhEPO-Fc治療后，紅細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積與治療前相比，均有不同程度的提高，rhEPO-Fc與對(duì)照藥治療效果一致。
表1用藥前各組的血液學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)(n＝10)

表2用藥15天后血液學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)(n＝10)

表3用藥30天后血液學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)(n＝10)

實(shí)施例八rhEPO-Fc融合蛋白與EPO體外活性比較收集UT-7細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基洗滌1次，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度至1.5×105/ml，將rhEPO-Fc和EPO稀釋至約2μM，在96孔培養(yǎng)板中4倍稀釋10個(gè)濃度梯度，每個(gè)稀釋度保留體積100μl，然后接種100μl細(xì)胞懸液至各個(gè)稀釋度，培養(yǎng)48小時(shí)后，加入5mg/ml MTT(噻唑藍(lán))20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4.5小時(shí)，小心去除150μl上清后補(bǔ)加相同體積的DMSO(二甲基亞砜)，充分裂解混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定OD490/655。其半效量(EC50)基本一致(見(jiàn)圖10)。
應(yīng)當(dāng)理解的是，通過(guò)上述具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明。上述實(shí)施例只是舉例描述，但是不打算將本發(fā)明限制于具體的實(shí)施方式。在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種修改和改良，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
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<400>10cgggatccga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gc 3權(quán)利要求
1.一種重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)-Fc融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是包含SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、類(lèi)似物或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是由SEQ ID NO6所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
3.一種編碼權(quán)利要求1或2融合蛋白的多核苷酸分子，其特征在于它是選自下列核苷酸序列中的一種(1)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO5所示核苷酸序列至少70％相同的核苷酸序列；(3)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與SEQ ID NO5或其互補(bǔ)序列的多核苷酸分子雜交的核苷酸序列；(4)編碼與SEQ ID NO6相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)、但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求4的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子是SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求3或4的多核苷酸分子的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組表達(dá)載體，其中該重組表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組表達(dá)載體，其中該真核表達(dá)載體是pEpo-Fc。
8.含有權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
10.制備權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的方法，其特征在于該方法包括在適于表達(dá)該融合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8或9的宿主細(xì)胞，以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化該融合蛋白的步驟。
11.純化權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的方法，其特征在于權(quán)利要求8或9的宿主細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、離心后，上清液分別用親和層析和分子篩層析純化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于親和層析中使用的是rProtein ASepharose FF親和層柱。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于分子篩層析中使用的是Superdex 200prep grade柱。
14.一種藥物組合物，其特征在于該藥物組合物含有作為活性成分的權(quán)利要求1或2的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其中該藥物組合物是適于通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、肌肉、鞘內(nèi)、鼻腔粘膜、口腔粘膜等途徑給藥的劑型。
16.權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白在制備治療貧血癥的藥物中的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述貧血癥是慢性腎衰引起的貧血癥、AZT治療AIDS病人后誘導(dǎo)的貧血、腫瘤引起的貧血、腫瘤化療引起的貧血、早產(chǎn)兒貧血以及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎引起的貧血等。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用基因工程方法生產(chǎn)的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)－Fc融合蛋白，編碼該融合蛋白的多核苷酸以及制備和純化該融合蛋白的方法，其中該融合蛋白由人促紅細(xì)胞生成素和人IgG2的Fc片段組成。該融合蛋白可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)，且純化工藝簡(jiǎn)單，利于進(jìn)一步的大規(guī)模制備。本發(fā)明所獲得的rhEPO－Fc融合蛋白與天然EPO比較，具有血清半衰期更長(zhǎng)的特點(diǎn)，同時(shí)在相同分子數(shù)基礎(chǔ)上仍保持與天然EPO相似的生物活性?？捎糜谥委煾鞣N原因引起的貧血癥，包括慢性腎衰引起的貧血、AZT治療AIDS病人后誘導(dǎo)的貧血、腫瘤引起的貧血、腫瘤化療引起的貧血、早產(chǎn)兒貧血以及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎引起的貧血等。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1872881SQ200610072229
公開(kāi)日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2006年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月14日
發(fā)明者劉勁瑋, 韓為躍, 何凱, 劉德林, 楊立明, 陽(yáng)勇 申請(qǐng)人:北京博康健基因科技有限公司