專利名稱：一種檢測細胞色素p450酶系突變位點的寡核苷酸探針及基因芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于DNA基因型的核酸檢測技術范疇。具體的說，本發(fā)明涉及一套能夠檢測人體肝細胞色素CYP450酶系統(tǒng)中的亞型酶CYP1A2*1F、CYP1A2*1C、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2D6*10、CYP2D6*2和CYP3A4*18的代表性突變位點基因型的寡核苷酸探針，該套探針的序列及用途。
背景技術：
細胞色素P450廣泛存在于動物、真核有機體、植物、真菌和細菌中，是必不可少的結構酶。細胞色素P450參與藥物在肝內降解的第I相反應。據估計，60％普通處方藥需要通過細胞色素P450系統(tǒng)進行生物轉化。細胞色素P450超家族依次可分為家族、亞家族和亞型。人類已確定357個細胞色素P450基因和33個假基因，分為18個家族，42個亞家族，各基因尚存在著大量等位基因，調控180多個人類細胞色素P450亞型蛋白質。大量等位基因的存在是細胞色素P450引起藥物氧化代謝個體差異和種族差異的生化基礎。細胞色素P450系統(tǒng)廣泛分布于肝、腎、腦、皮膚、肺、胃腸道、胎盤組織，腎上腺、主動脈等處組織，細胞的內質網，線粒體和核膜內均有細胞色素P450表達。細胞色素P450催化反應可發(fā)生在體內不同的組織器官，但最重要的器官是肝臟。細胞色素催化體內多種反應，包括氧化N還原作用，環(huán)氧化作用，UN脫羥基作用，VN脫羥基作用，WN氧化和羥基化作用。細胞色素P450可代謝大約25萬種外源性物質，包括藥物，環(huán)境中的化合物和污染物，自然界中植物產物，殺蟲劑，鹵化烴，多環(huán)芳香烴、芳基胺、燃燒的成分，除草劑等。
目前，困擾臨床醫(yī)療及制藥行業(yè)最常見的問題是不同病人對同一藥物的反應不同，表現(xiàn)為不同的藥物療效和毒副作用。1998年的一項統(tǒng)計表明美國醫(yī)院中每年有10萬病人因為藥物的毒副作用而死亡，是美國人身死亡的第四大原因(Lazarou，1998)。1995年的一份評估顯示，1994年全美國由于不合適的藥物處方使用帶來的健康護理系統(tǒng)上的額外花銷和浪費竟比這些藥物本身的價值還要高出36億美元(Johnson，1995)。另外，在新藥研發(fā)過程中，相當一部分具有良好藥理活性的藥物因在三期臨床實驗中少數個體嚴重的毒副作用而被剔除，造成前期巨大投入的浪費和新藥研制成本居高不下。研究表明，臨床藥物治療產生的藥物不良反應的產生主要分為兩大類，一類是由于P450代謝酶與藥物的相互作用引起的，最常見的是P450的誘導和抑制；另一類是由P450酶基因多態(tài)性引起的，造成酶代謝功能的變化，而且這種變化存在顯著的患者之間的個體差異。因此，藥物代謝酶基因多態(tài)性與藥物反應個體差異之間的相關性研究是藥物基因組學研究中的重要組成部分，也是目前研究比較深入的領域。從理論上講，所有的藥物代謝酶都具有遺傳多態(tài)性。絕大多數藥物代謝酶的多態(tài)性是一種單基因性狀，是由于同一基因位點上具有多個等位基因引起的。等位基因所編碼的代謝酶具有不同的代謝能力正常野生型表現(xiàn)為快代謝型(EM，extensive metabolism)；絕大多數突變型等位基因，因堿基的突變、插入或缺失而造成酶代謝能力降低，表現(xiàn)為慢代謝型(PM，poormetabolism)；極少數突變型因基因多拷貝重復造成酶的過量表達，表現(xiàn)為超快代謝型(UM，ultrarapid metabolism)。這種多態(tài)性造成了不同個體間藥物代謝反應的差異，是產生藥物毒副作用、降低或喪失藥物療效的主要原因之一。
通過對受試者的基因型分子診斷來實現(xiàn)臨床個體化醫(yī)療，需要對個體基因型進行檢測，而基因分型技術作為目前常用的基因分型方法，大致可分為兩類一類是基于凝膠電泳的技術，如PCR反應結合限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)，多重PCR，等位基因特異性擴增(AS-PCR)等?；跇嬒蟮腟NP檢測方法相對簡單快速，但是不能給出序列信息，因而無法確定具體突變位點與突變形式，不能區(qū)分一個片段中的多個突變，而且對操作者技術要求較高，難以推廣；另一類是基于熒光標記雜交反應的基因分型技術，包括寡核苷酸連接分析，焦磷酸法DNA測序，直接雜合子測序以及等位基因特異性引物延伸等。這類方法需要投入大量的資金用與購置專用儀器和探針等配套試劑，只有實現(xiàn)高通量檢測，降低使用成本，才能得到廣泛運用。
DNA芯片(DNA microarrays)是近年來發(fā)展成熟的一種高通量基因檢測技術，是分子生物學發(fā)展史上的又一重大技術突破，其特點是實驗操作和數據處理的集成化、微型化、自動化。DNA芯片能夠進行快速多基因平行檢測，是一種發(fā)展前景廣闊的多基因大規(guī)模檢測新技術。DNA芯片技術檢測的關鍵之處在于設計、篩選一系列高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的匹配探針，固定于玻璃片等固相載體上，利用樣品與探針的雜交反應，經掃描、分析后即可得出正確的結果。就本實驗而言，通過一次簡單操作就可確定多個受試個體DNA樣本中多個位點的基因型，極大地提高了檢測效率，為臨床基因診斷及個體化醫(yī)療提供了簡便、快捷的技術手段。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一套用于檢測常見CYP450代謝酶基因熱點突變位點的寡核苷酸探針，包含以下各組探針的組合1.CYP1A2*1F DNA-163G＞A位點檢測探針2.CYP1A2*1C DNA-3860A＞C位點檢測探針
3.CYP2C9*3DNA1075A＞C位點檢測探針4.CYP2C19*2DNA681G＞A位點檢測探針5.CYP2C19*3DNA991G＞A位點檢測探針6.CYP2D6*10DNA188C＞T位點檢測探針7.CYP2D6*2DNA4268G＞C位點檢測探針8.CYP3A4*18DNA878T＞C位點檢測探針本發(fā)明還提供了各部分探針的核苷酸序列，并對其長度進行了優(yōu)化，以提高探針的檢測特異性和靈敏度，詳見表1-1。
利用上述寡核苷酸探針，可通過核酸雜交反應對人體基因組DNA樣本進行檢測，尤其適用于基于基因芯片技術的檢測。利用探針可同時檢測出純合野生型、純合突變型和雜合突變型三種基因型位點的DNA片段，從而直接判斷得到分型結果。
另一方面，本發(fā)明還提供了用于檢測細胞色素P450酶系突變位點的基因芯片，包括固定在固相載體上的與檢測位點DNA正鏈的堿基序列一致的寡核苷酸片段，其中特征片段相應于SEQ ID NO1～16的序列。
本發(fā)明還提供了一種檢測細胞色素P450酶系突變位點的方法，包括如下步驟(1)選用前述的基因芯片；(2)標記特異性引物，擴增待測DNA樣品；(3)在適于與所選基因芯片進行雜交的條件下，加入待測樣品的PCR產物并反應足夠時間；(4)掃描分析雜交反應結果。
具體的說，本發(fā)明內容是這樣實現(xiàn)的首先在NCBI的核酸數據庫中查找選取的CYP450酶各亞型酶基因組DNA的全序列，下載序列文檔，利用分子生物學軟件Primer5.0在選取位點上下游各15個堿基范圍內尋找特異性的探針，在包含檢測位點的一定范圍內設計特異性擴增引物，將特異性擴增DNA片段長度限制在150-250堿基之間。共設計8對16條寡核苷酸探針。寡核苷酸探針序列與上述基因特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致(探針序列見表1-1)。
利用上述的一套探針，可以通過雜交反應對人體基因組DNA樣本進行檢測，尤其適用于基于DNA芯片原理的檢測，具有較高的靈敏度和特異性。在進行基于DNA芯片原理的檢測時，需要把探針全部或其中一部分用適當的方法固定于固相載體上(如玻璃片、硅基片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)，成為M×N排布的探針陣列，即為DNA芯片。然后利用優(yōu)化的相應的PCR引物擴增待檢人體基因組DNA樣本，選擇引物的要求是能夠擴增出基因組DNA標本的包含探針所在區(qū)域的片段。在擴增的同時引入熒光標記、生物素標記或其他合適的標記物。擴增產物作為探針檢測的靶分子，在一定條件下與芯片共保溫30分鐘至數小時，利用熒光掃描儀或其他相應的檢測設備即可以檢測到雜交信號。根據待測位點探針信號的比值可以判定出該位點的基因型。
本發(fā)明提供的探針能夠快速、準確、高效地檢測出人體基因組DNA樣本中各待測位點的基因型。本發(fā)明提供的基因芯片與檢測方法可以廣泛用于臨床個體DNA基因型診斷，在對預防臨床用藥導致的毒副作用、指導醫(yī)生臨床合理治療、建立高效的個體化醫(yī)療體系、開展CYP450遺傳學調查等方面具有顯著的實用價值。


圖1為CYP450基因八個PCR產物電泳檢測結果。從右至左依次為DL2000Marker；1.CYP1A2*1F；2.CYP1A2*1C；3.CYP2C9*3；4.CYP2C19*2；5.CYP2C19*3；6.CYP2D6*10；7.CYP2D6*2；8.CYP3A4*18。
圖2為八個位點二重PCR擴增產物電泳檢測結果。從右至左依次為DL2000Marker；5/8.CYP2C19*3和CYP3A4*18；3/7.CYP2C9*3和CYP2D6*2；2/4.CYP1A2*1C和CYP2C19*2；1/6.CYP1A2*1F和CYP2D6*10。
圖3為CYP450酶熱點SNP位點檢測基因芯片探針排列數字1-10分別表示一張芯片可同時檢測10個標本；右圖為探針矩陣放大效果圖；箭頭下表中，W表示野生型探針，M表示突變型探針，字母右側的數字1-8依次表示1.CYP1A2*1F；2.CYP1A2*1C；3.CYP2C9*3；4.CYP2C19*2；5.CYP2C19*3；6.CYP2D6*10；7.CYP2D6*2；8.CYP3A4*18。
圖4為基因芯片與野生型和突變型重組質粒的熒光標記PCR產物雜交掃描結果(左側為野生型質粒，右側為突變型質粒)，雜交圖均系二重PCR擴增產物雜交結果。
圖5為基因芯片與四個不同臨床DNA樣本的熒光標記PCR產物雜交掃描結果，雜交圖均系二重PCR擴增產物雜交結果。
具體實施例方式為了進一步說明一套用于同時檢測上述CYP450各亞型酶八個位點寡核苷酸探針的實施方式和用途，參照以下實施例進行說明。實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本領域技術人員在權利要求的范圍內所做出的某些改變和調整也應認為屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1.檢測CYP450八個SNP位點的寡核苷酸探針的篩選和優(yōu)化
1.寡核苷酸基因芯片的制備和寡核苷酸探針的設計和篩選優(yōu)化探針分別設計在人體CYP450酶系統(tǒng)各亞型酶DNA序列上，具有較高的靈敏度和特異性，寡核苷酸探針序列與上述基因特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致。探針合成時在其3’端氨基修飾，用于探針與載玻片表面的活性醛基發(fā)生反應并固定到載體表面。將備選寡核苷酸探針純化、定量后，用基因芯片點樣儀點到醛基活化的載玻片上，制成探針微陣列。
以基因組DNA為模板的PCR產物經試劑盒純化后，用T4DNA連接酶連接至PGEMT4-載體上，轉化感受態(tài)大腸桿菌dH5α。經測序驗證重組質粒為野生型后，再以野生型重組質粒為模板，采用突變引物構建特定位點引入突變堿基的目的片段，經過純化，連接轉化，經測序驗證獲得突變型重組質粒。以重組質粒作模板進行特異性擴增，用熒光標記的PCR產物與基因芯片雜交，得到各探針的雜交圖(優(yōu)化的質粒雜交見附圖4)。針對不同的基因片段，根據芯片雜交結果選擇各自特異性好，靈敏度高的探針。探針長度在15-18堿基之間。(探針序列見表1-1)表1-1檢測CYP450八個SNP位點的寡核苷酸探針備選序列

2.擴增含有靶基因片斷的PCR引物的設計和優(yōu)化根據CYP450各亞型酶DNA全基因序列設計引物，引物序列見表1-2。利用引物擴增的PCR產物序列中包含各靶基因片段上的探針序列。所有反向引物序列5’端用熒光素Cy3標記，以保證PCR產物經雜交反應后，帶有熒光的反向互補鏈與核苷酸探針結合產生可檢測信號。分別對八對引物進行四套二重PCR擴增條件的優(yōu)化(優(yōu)化的PCR反應電泳檢測結果見附圖2)。
表1-2用于擴增含有探針序列靶基因片段的引物序列

實施例2.寡核苷酸探針的特異性和靈敏度評價1.基因芯片制備 將寡核苷酸探針用點樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉移至384孔板。用Cartesian芯片制備儀將探針點到醛基片上(探針排列見附圖3，芯片分別與CYP450酶基因組DNA的熒光標記PCR產物雜交結果見附圖5)。
熱點突變位點CYP450寡核苷酸芯片特異性檢測在優(yōu)化好的兩套二重PCR擴增和雜交反應條件下，檢測了36個臨床DNA樣本，以DNA樣本為模板進行四套二重PCR擴增，產物與芯片雜交。其中出現(xiàn)信號的探針均與其雜交的產物片段對應，任何一個片段單獨雜交時該位點探針以外的探針不出現(xiàn)信號。這說明所選取的用于檢測上述八個CYP450酶基因SNP位點的探針是特異的，也說明本實驗建立在四套二重PCR基礎上，同時檢測CYP450酶八個SNP位點的基因分型芯片是可靠的。
以上實施例的技術要點如下1.寡核苷酸合成 寡核苷酸(引物或探針)采用標準亞磷酰胺化學方法在自動合成儀(ABI8909)上合成。所有熒光引物在合成中用Cy3亞磷?；噭┰?’端進行標記。所有寡核苷酸探針在3′端進行氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(聚乙二醇磷?；噭?相連。合成完畢用濃氨水55℃作用15小時脫保護/切割，OPC柱純化。紫外定量，凍存?zhèn)溆谩?br> 2.多重PCR擴增 20ul常規(guī)PCR反應體系中，正、反向引物濃度均0.5μM，dNTP為100μM，1U Taq DNA聚合酶，1×PCR反應緩沖液，50-100ng模板DNA；擴增條件為預變性(94℃，5min)；35個循環(huán)變性(94℃，30sec)，退火(58℃，30sec)延伸(72℃，40sec)；延伸(72℃，5min)。
多重不對稱PCR反應中，兩對引物之間濃度的改變對目的基因的擴增效率有明顯的影響，每個基因的正向與反向熒光引物的比例和雜交信號的強弱密切相關。經過多次實驗優(yōu)化，使一個反應管中兩個產物均能達到相近而且較好的擴增效率和雜交信號。優(yōu)化的結果為一套二重PCR反應中的正向引物濃度分別為0.1μM、0.1μM，反向熒光標記引物濃度分別為0.5μM、0.5μM。20ul反應體系中，dNTP為200μM，MgCl2為3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反應緩沖液；擴增條件為預變性(94℃，5min)；35個循環(huán)變性(94℃，30sec)，退火(58℃，30sec)延伸(72℃，40sec)；延伸(72℃，5min)。
3.熱點突變位點CYP450寡核苷酸芯片制備寡核苷酸探針用點樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉移至384孔板。用Cartesian芯片制備儀將探針點到醛基片(Telechem)上，點樣儀內保持溫度為23℃，相對濕度大于85％。寡核苷酸芯片制備完畢后，置于載玻片盒內室溫放置備用。點樣后的芯片在使用前至少在室溫放置24h。
4.熱點突變位點CYP450寡核苷酸芯片雜交與檢測4.1寡核苷酸基因芯片預處理 寡核苷酸芯片用0.2％SDS清洗2次，接著以水清洗2次，晾干后用于雜交。
4.2雜交和雜交后處理 熒光標記的PCR產物變性(98℃、5min，冰浴、5min)后與雜交液(8×SSC，3％甲酰胺，0.2％SDS)混勻，取10μl轉移至芯片反應區(qū)，芯片置于雜交盒內，連同雜交盒浸入42℃水浴中反應60分鐘，雜交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中于室溫各洗滌1min。置室溫晾干。
4.3掃描和結果判定 芯片用芯片掃描儀GenePix 4000B進行掃描，用GenePix Pro 4.0軟件分析結果。
核苷酸序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所<120>一種檢測細胞色素P450酶系突變位點的寡核苷酸探針及基因芯片<160>16<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>1GCCTCTCGGA TTCAAG16<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2CGCCTCTCAG ATTCAAG17<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3TGTGGGCACA GGACG15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>4
TGTGGGCCCA GGACG15<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5AGAGATACAT TGACCTTC18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6AGAGATACCT TGACCTTC18<210>7<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>7CACCCCCTGG ATCCAG 16<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>8CACCCCCTGA ATCCAG16<210>9
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>9TTATTTCCCG GGAACCCA18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>10TTATTTCCCA GGAACCCA18<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>11GCACGCTACC CACCAGGC18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>12GCACGCTACT CACCAGGC18<210>13<211>17<212>DNA<213>人工序列
<400>13CCTGGTGAGC CCATCCC17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>14CCTGGTGACC CCATCCC17<210>15<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>15TCCGATCTGG AGCTC15<210>16<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>16TCCGATCCGG AGCTC1權利要求
1.一套檢測細胞色素P450酶系突變位點的寡核苷酸探針，其特征在于包含檢測以下各組基因突變位點的全部或部分探針的組合(1)CYP1A2*1F的DNA-163G＞A位點檢測探針；(2)CYP1A2*1C的DNA-3860A＞C位點檢測探針；(3)CYP2C9*3的DNA1075A＞C位點檢測探針；(4)CYP2C19*2的DNA681G＞A位點檢測探針；(5)CYP2C19*3的DNA991G＞A位點檢測探針；(6)CYP2D6*10的DNA188C＞T位點檢測探針；(7)CYP2D6*2的DNA4268G＞C位點檢測探針；(8)CYP3A4*18的DNA878T＞C位點檢測探針。
2.如權利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于各組探針的核苷酸序列為探針(1)核苷酸序列為SEQ-1和SEQ-2；探針(2)核苷酸序列為SEQ-3和SEQ-4；探針(3)核苷酸序列為SEQ-5和SEQ-6；探針(4)核苷酸序列為SEQ-7和SEQ-8；探針(5)核苷酸序列為SEQ-9和SEQ-10；探針(6)核苷酸序列為SEQ-11和SEQ-12；探針(7)核苷酸序列為SEQ-13和SEQ-14；探針(8)核苷酸序列為SEQ-15和SEQ-16。
3.如權利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特征在于同時包含八組探針。
4.一種檢測細胞色素P450酶系突變位點的基因芯片，包括固定在固相載體上的與檢測位點DNA正鏈的堿基序列一致的寡核苷酸片段，其中特征片段相應于SEQ IDNO1～16的序列。
5.一種檢測細胞色素P450酶系突變位點的方法，其特征在于包括如下步驟(1)選用權利要求4所述的基因芯片；(2)標記特異性引物，擴增待測DNA樣品；(3)在適于與所選基因芯片進行雜交的條件下，加入待測樣品的PCR產物并反應足夠時間；(4)掃描分析雜交反應結果。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)中引物標記采用熒光標記或生物素標記。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)所述反應條件為42℃水浴中反應60分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一套用于檢測CYP450酶基因熱點突變位點的寡核苷酸探針及其用途，屬于臨床分子診斷領域。探針分別設計在CYP450各亞型酶DNA全基因序列上，具有較高的靈敏度和特異性。本發(fā)明還提供了一種檢測細胞色素P450酶系突變位點的基因芯片，能夠對臨床DNA標本進行基因分型檢測，可用于多種方面，如P450基因型診斷、指導臨床用藥、預防藥物不良反應等。
文檔編號C12Q1/68GK101054601SQ20061007259
公開日2007年10月17日 申請日期2006年4月13日 優(yōu)先權日2006年4月13日
發(fā)明者王升啟, 文思遠, 許力 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所