專(zhuān)利名稱(chēng)：培養(yǎng)環(huán)狀病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)狀病毒(circovirus)領(lǐng)域，提供用于培養(yǎng)環(huán)狀病毒，特別是豬環(huán)狀病毒的組合物和方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于在表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1基因功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中培養(yǎng)豬環(huán)狀病毒的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)狀病毒科(Circoviridae)的病毒存在于一系列植物和動(dòng)物中，通常稱(chēng)為環(huán)狀病毒，其特征是圓型的無(wú)被膜病毒粒，其平均直徑為17-23.5nm，其中含有環(huán)狀單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)。環(huán)狀病毒的ssDNA基因組是已知最小的病毒DNA復(fù)制子。如WO99/45956所公開(kāi)，按照國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)的第六次報(bào)告(Lukert，P.D.等，1995，環(huán)狀病毒科，pp.166-168.F.A.Murphy，等(eds.)《Virus Taxonomy，Sixth Report of the InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses》，Arch.Virol.10 Suppl.)，已有至少六種病毒被鑒定為該科的成員。
該科中所包括的動(dòng)物病毒有雞貧血病毒(CAV)、喙羽病病毒(BFDV)、豬環(huán)狀病毒(PCV)、鴿環(huán)狀病毒。PCV原是在豬腎細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出來(lái)的。PCV在細(xì)胞核中復(fù)制，并產(chǎn)生大的核內(nèi)包含體(見(jiàn)Murphy等，1999，環(huán)狀病毒科，pp.357-361，Veterinary Virology，3rd ed.Academic Press，SanDiego)。目前有兩類(lèi)公認(rèn)的PCV，即1型PCV(PCV1)和2型PCV(PCV2)。PCV1是作為連續(xù)豬腎細(xì)胞系PK-15(ATCC CCL31)的永久污染物分離出來(lái)的，它在細(xì)胞培養(yǎng)中不引起可檢測(cè)的致細(xì)胞病變效應(yīng)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)感染后在豬體內(nèi)不誘發(fā)臨床疾病(見(jiàn)Allan G.，1995，Vet.Microbiol.4449-64；Tischer，I.等，1982，Nature 29564-66；Tischer，I.等，1986，Arch.Virol.91271-276)。與PCV1相反，PCV2與斷奶豬的斷奶后全身性消瘦綜合征(post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)密切相關(guān)(見(jiàn)Allan G.等，1998，Europe.J.Vet.Diagn.Investig.103-10；Ellis，J.等，1998，Can.Vet.J.3944-51；Morozov，I.等，1998，J.Clin.Microbiol.362535-2541)。PCV1的核苷酸序列公開(kāi)于Mankertz，A.，等(1997，J.Virol.712562-2566)和Meehan，B.M.等(1997，J.Gen.Virol 78221-227)，PCV2的核苷酸序列公開(kāi)于Hamel，A.L.等(1998，J.Virol.725262-5267)；Mankertz，A.，等(2000，Virus Res.6665-77)和Meehan，B.M.等(1998，J.Gen.Virol.792171-2179)。WO00/01409公開(kāi)了一些PCV2毒株，這些毒株已保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Culture，Centre for Applied Microbiology & Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，United Kingdom)，包括以下保藏號(hào)的毒株V97100219、V9700218、V97100217、V98011608、V98011609。WO00/77216也公開(kāi)了PCV2。
迄今已發(fā)表的有關(guān)PCV2的研究工作要么使用組織勻漿液，要么使用得自野外分離物的培養(yǎng)病毒。Tischer等人(1987，Arch.Virol.9639-57)報(bào)道了用D-葡糖胺處理刺激豬腎細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S期。但是，該處理必須小心進(jìn)行，因?yàn)镈-葡糖胺對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物有毒(見(jiàn)Allan等，2000，J.Vet.Diagn.Investigation.123-14)。仍然需要培養(yǎng)環(huán)狀病毒如PCV1和PCV2及其他環(huán)狀病毒的方法，從而得到純的環(huán)狀病毒。特別是對(duì)作為抗PMWS疫苗的PCV2抗原的制備而言，這樣的方法是很有利的。本發(fā)明滿(mǎn)足了這一需要。
所有專(zhuān)利和出版物在此全文引入本說(shuō)明書(shū)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供培養(yǎng)哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒的方法，該方法包括a)獲得表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞允許哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒復(fù)制；b)在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入所述哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒基因組或其能夠復(fù)制的部分；c)在適合所述哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括從所述培養(yǎng)細(xì)胞中回收所述環(huán)狀病毒。
在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒是豬環(huán)狀病毒，例如豬環(huán)狀病毒1(PCV1)或豬環(huán)狀病毒2(PCV2)。在另一些實(shí)施方案中，豬環(huán)狀病毒包含嵌合核苷酸序列。在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源于豬。在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為豬視網(wǎng)膜細(xì)胞。
在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能為人腺病毒E1功能。在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能為豬腺病毒E1功能。在再一些實(shí)施方案中，E1功能為E1A和/或E1B功能。在另一些實(shí)施方案中，表達(dá)哺乳動(dòng)物E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞被哺乳動(dòng)物E1基因序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物E1基因序列對(duì)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是異源的。
本發(fā)明還提供重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該重組細(xì)胞表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能，并包含哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒基因組或其能夠復(fù)制的部分，其中所述細(xì)胞允許所述哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒是豬環(huán)狀病毒，例如豬環(huán)狀病毒1(PCV1)或豬環(huán)狀病毒2(PCV2)。在另一些實(shí)施方案中，豬環(huán)狀病毒包含嵌合核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，腺病毒E1功能為人腺病毒E1功能。在其他實(shí)施方案中，E1功能為豬腺病毒E1功能。在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源于豬。在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為豬視網(wǎng)膜細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，表達(dá)哺乳動(dòng)物E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞被哺乳動(dòng)物腺病毒E1基因序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在另外的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物E1基因序列對(duì)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是異源的。
本發(fā)明還提供制備一種重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，該重組細(xì)胞表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能并包含哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒基因組，該方法包括以下步驟a)獲得表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入所述哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒基因組或其能夠復(fù)制的部分。在另一些實(shí)施方案中，該方法還包括在適合所述哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒復(fù)制的條件下培養(yǎng)所述重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟。在另一些實(shí)施方案中，該方法還包括從所述培養(yǎng)細(xì)胞中回收所述環(huán)狀病毒。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒是豬環(huán)狀病毒，例如豬環(huán)狀病毒1(PCV1)或豬環(huán)狀病毒2(PCV2)。在另一些實(shí)施方案中，豬環(huán)狀病毒包含嵌合核苷酸序列。在另一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源于豬。在再一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為豬視網(wǎng)膜細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，腺病毒E1功能為人腺病毒E1功能或豬腺病毒E1功能。在另一些實(shí)施方案中，表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞被哺乳動(dòng)物腺病毒E1基因序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在其它實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物E1基因序列對(duì)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是異源的。


圖1A-1B提供通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染并用Hirt的方法從感染的VIDO R1細(xì)胞中提取而制得的PCV2病毒的鑒定和滴定結(jié)果。(A)用PCV2特異性引物及來(lái)自PCV2感染細(xì)胞(泳道1)和偽感染細(xì)胞(泳道2)的DNA進(jìn)行的PCR。用含有PCV2基因組的質(zhì)粒作對(duì)照(泳道3)。GIBCO BRL的1kb DNA階梯加在泳道M中。(B)來(lái)自PCV2感染細(xì)胞(泳道1、3、5)和偽感染細(xì)胞(泳道2、4、6)的病毒DNA用NcoI和StuI(泳道1和2)、EcoRI和StuI(泳道3和4)、EcoRI和EcoRV(泳道5和6)消化。GIBCO BRL的1kb+DNA階梯加在泳道M中。
圖2A-2B繪出通過(guò)免疫過(guò)氧化物酶染色而進(jìn)行PCV2滴定的結(jié)果。在感染后72小時(shí)，將偽感染的(A)或PCV2感染的(B)VIDO R1細(xì)胞與兔抗ORF2多克隆抗體和生物素化的次級(jí)抗體一起保溫。加入抗生物素蛋白和生物素化的辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合體后，用二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色細(xì)胞單層。由一個(gè)病毒粒子感染產(chǎn)生一個(gè)深色細(xì)胞。
圖3A-3C給出如Genbank登記號(hào)AF086834所述的豬環(huán)狀病毒2(PCV2)的核苷酸序列(A)及ORF1(B)和ORF2(C)的氨基酸序列。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒，特別是豬環(huán)狀病毒的組合物和方法。本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)，即表達(dá)人E1功能的豬細(xì)胞能夠被PCV2病毒基因組轉(zhuǎn)染并產(chǎn)生高病毒滴度的PCV2病毒。保藏于ATCC并具有ATCC保藏號(hào)PTA-155的VIDO R1細(xì)胞系是一種用人腺病毒-5(HAV5)E1轉(zhuǎn)化的豬視網(wǎng)膜細(xì)胞系，已證明這能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期的S期并反式激活轉(zhuǎn)錄(見(jiàn)Shenk，T.，1996，“腺病毒科病毒及其復(fù)制”，《Fields Virology》.3rd ed.B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley(ed.)Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，New York，pp.2111-2148)。如本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例3所述，VIDO R1細(xì)胞用PCV2基因組轉(zhuǎn)染，并以2×107IU/ml產(chǎn)生病毒。
除非特別指出，本發(fā)明的實(shí)施采用本領(lǐng)域常規(guī)的微生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)記載(見(jiàn)例如Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)；DNACloningA Practical Approach，vol.I & II(D.Glover，ed.)；OligonucleotideSynthesis(N.Gait，ed.(1984))；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames &Higgins，eds.(1985))；Transcription and Translation(B.Hames & Higgins，eds.(1984))；Animal Cell Culture(R.Freshney，ed.(1986))；Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；Ausubel，等，CurrentProtocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987，1988，1989，1990，1991，1992，1993，1994，1995，1996)；Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual(2nd Edition)；vols.I，II & III(1989))。
環(huán)狀病毒科記載于國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)的第六次報(bào)告(同上)中，該科病毒具有圓型的無(wú)被膜病毒粒，平均直徑為17-23.5nm，其中含有環(huán)狀單鏈DNA(ssDNA)。該科病毒的成員包括豬環(huán)狀病毒PCV1和PCV2。已知有些PCV是致病性的，例如PCV2與PMWS相關(guān)。
PCV1的核苷酸序列公開(kāi)于Mankertz，A.，等，1997，J.Virol.712562-2566和Meehan，B.M.等，1997，J.Gen.Virol.78221-227。PCV2的核苷酸序列公開(kāi)于Hamel，A.L.等，1998，J.Virol.725262-5267；Mankertz，A.等，2000，Virus Res.6665-77和Meehan，B.M.等，1998，J.Gen.Virol.792171-2179。PCV2的代表性毒株已保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Cell Culture，Centre for AppliedMicrobiology & Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，United Kingdom)，包括以下保藏號(hào)的毒株V97100219、V97100218、V97100217、V98011608、V98011609。WO00/77216也公開(kāi)了PCV2。PCV2的核苷酸序列也已公開(kāi)于Hamel等，(1998)，J.Virol.Vol.72，65262-5267(GenBank AF027217)和Morozov等，(1998)，J.Clinical Microb.vol.36，92535-2541，以及GenBank AF086834、AF086835和AF086836。對(duì)PCV1和PCV2已發(fā)表的核苷酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)其同一性＜80％，但基因組的組織相似，尤其是在推定的DNA復(fù)制起點(diǎn)與兩個(gè)最大的開(kāi)放閱讀框(ORF)的排布上相似。
本發(fā)明包括培養(yǎng)哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒，特別是豬環(huán)狀病毒(PCV)的方法。本發(fā)明包括培養(yǎng)下述PCV的方法，所述PCV包含本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的或本領(lǐng)域已知的PCV核苷酸序列或其ORF或其能夠復(fù)制的部分。本發(fā)明還包括培養(yǎng)下述PCV的方法，所述PCV具有由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的或本領(lǐng)域已知的PCV核苷酸序列的PCV核苷酸序列或其ORF或其能夠復(fù)制的部分。本發(fā)明還包括培養(yǎng)下述PCV的方法，所述PCV包含PCV核苷酸序列的變異，這些變異不改變核苷酸序列或其ORF或其能夠復(fù)制的部分的功能或毒株特異性。本發(fā)明還包括培養(yǎng)下述PCV的方法，所述PCV包含在中等至高度嚴(yán)格性條件下能夠與本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的PCV核苷酸序列雜交的PCV核苷酸序列；以及培養(yǎng)下述PCV的方法，所述PCV包含本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的或本領(lǐng)域已知的PCV核苷酸序列的突變(例如缺失或點(diǎn)突變)或其ORF或其能夠復(fù)制的部分。本發(fā)明還包括培養(yǎng)包含異源核苷酸序列的PCV的方法。本發(fā)明包括培養(yǎng)下述PCV的方法，所述PCV包含嵌合環(huán)狀病毒核苷酸序列，例如豬環(huán)狀病毒的核苷酸序列與其他致病性病毒(如包括細(xì)小病毒在內(nèi)的致病性豬病毒)的核苷酸序列的融合物。
就環(huán)狀病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，本說(shuō)明書(shū)所提到的異源核苷酸序列分別是指通常與作為此環(huán)狀病毒基因組一部分的環(huán)狀病毒序列無(wú)關(guān)的核苷酸序列或通常與此哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)關(guān)的核苷酸序列。異源核苷酸序列包括合成序列。雜交反應(yīng)可在不同“嚴(yán)格性”的條件下進(jìn)行。提高雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的條件是本領(lǐng)域公知的和已公開(kāi)的(見(jiàn)例如Sambrook等(1989)，p7.52)。有關(guān)條件的實(shí)例包括(按嚴(yán)格性由低到高的順序)保溫溫度為25℃、37℃、50℃和68℃；緩沖液濃度為10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC(其中SSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸緩沖液)及使用其他緩沖體系時(shí)的等效緩沖液；甲酰胺濃度為0％、25％、50％和75％；保溫時(shí)間為5分鐘到24小時(shí)；洗滌步驟為1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)；洗滌保溫時(shí)間為1、2或15分鐘；洗滌液為6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去離子水。一組示例性的嚴(yán)格雜交條件是68℃和0.1×SSC。
PCV基因組編碼若干多肽序列，這些序列的大小大致在8-35kD范圍。使用標(biāo)準(zhǔn)軟件例如MacVector(Oxford Molecular Group Inc.，MD21030)確定豬環(huán)狀病毒的開(kāi)放閱讀框(ORF)被認(rèn)為是常規(guī)技術(shù)。兩種PCV中最大的ORF，即ORF1，只顯示出少量變異，同一性為85％(用clustal程序測(cè)定)。已證明該ORF是PCV1的Rep蛋白(Mankertz，A.，等1998，J.Gen.Virol.79381-384)。雖然不想受理論的束縛，但PCV1和PCV2的ORF2序列所顯示出的較高變異率(同一性約為65％)提示PCV的類(lèi)型特異性特征可能是由各自的ORF2蛋白決定的。若干PCV類(lèi)型特異性抗原表位已被確定在PCV2 ORF2序列上(見(jiàn)Mahe，D.等，2000，J.Gen.Virol.811815-24)。最近的另一項(xiàng)研究已鑒定出PCV2ORF2是一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，它能夠在被表達(dá)ORF2的重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞中形成病毒衣殼樣粒子(見(jiàn)Nawagitgul，P.等，J.Gen.Virol.812281-2287)。
在本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的一些示例性發(fā)明實(shí)施方案中，通過(guò)質(zhì)粒和PCV基因組之間的體外重組構(gòu)建一個(gè)重組載體，該重組載體包含PCV基因組或其ORF或其部分，例如抗原性區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，PCV基因組是PCV2基因組。在另一些實(shí)施方案中，通過(guò)體內(nèi)重組構(gòu)建重組載體，該重組載體包含PCV基因組或其ORF或其部分，例如抗原性區(qū)域。體內(nèi)重組方法是本領(lǐng)域已知的，包括例如Chartier等人公開(kāi)的方法(1996，J.Virol.704805-4810)。用于構(gòu)建環(huán)狀病毒基因組的載體包括例如允許產(chǎn)生多拷貝的克隆環(huán)狀病毒核苷酸序列的細(xì)菌質(zhì)粒。在一些實(shí)施方案中，將質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中以進(jìn)行重組。適于進(jìn)行重組的宿主細(xì)胞包括能夠支持PCV基因組和含有PCV序列的質(zhì)粒之間的重組或兩個(gè)或更多個(gè)各自含有PCV序列的質(zhì)粒之間的重組的任何細(xì)胞。重組通常在原核細(xì)胞如大腸桿菌中進(jìn)行，而環(huán)狀病毒的產(chǎn)生則優(yōu)選在允許PCV復(fù)制的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行，例如豬細(xì)胞，特別是能夠表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能的豬細(xì)胞。
本發(fā)明包括使用允許環(huán)狀病毒復(fù)制，特別是允許PCV如PCV1和PCV2復(fù)制的任何哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。據(jù)Allan等人(1995，VeterinaryMicrobiology 4449-64)報(bào)道，PCV能夠在豬和牛單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制。據(jù)Tischer等人(1987，Arch.Virol.9639-57)報(bào)道，已知PCV在細(xì)胞培養(yǎng)物中的復(fù)制要求有活躍分裂的細(xì)胞。用于PCV復(fù)制的細(xì)胞或細(xì)胞系的實(shí)例包括含有E1功能并允許PCV復(fù)制的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括表達(dá)腺病毒E1功能的豬細(xì)胞，例如豬單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和豬視網(wǎng)膜細(xì)胞。在本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，證明表達(dá)人腺病毒E1功能的豬視網(wǎng)膜細(xì)胞允許PCV2復(fù)制，并以2×107IU/ml產(chǎn)生病毒。豬細(xì)胞系可以從公共來(lái)源如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)得到。細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)以及真核細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的培養(yǎng)和保持均是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。
本發(fā)明包括在被哺乳動(dòng)物腺病毒E1基因序列轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物環(huán)狀病毒(特別是豬環(huán)狀病毒)的方法。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞用腺病毒E1基因序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，E1基因序列整合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組中。在另一些實(shí)施方案中，E1基因序列存在于復(fù)制質(zhì)粒上。在再一些實(shí)施方案中，E1基因序列對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是異源的。在本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，豬哺乳動(dòng)物細(xì)胞用人腺病毒5E1基因序列轉(zhuǎn)化。本發(fā)明包括使用表達(dá)E1功能的任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，只要該表達(dá)E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系允許環(huán)狀病毒(特別是豬環(huán)狀病毒，如豬環(huán)狀病毒1或豬環(huán)狀病毒2)復(fù)制即可。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是豬細(xì)胞或細(xì)胞系。本發(fā)明包括使用任何哺乳動(dòng)物E1功能，只要求表達(dá)該哺乳動(dòng)物E1功能的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞允許環(huán)狀病毒，特別是豬環(huán)狀病毒如豬環(huán)狀病毒1或豬環(huán)狀病毒2復(fù)制即可。哺乳動(dòng)物腺病毒基因組是本領(lǐng)域已知的，并公開(kāi)于文獻(xiàn)中。例如，Reddy等人(1998，Journal of Virology，721394)公開(kāi)了牛腺病毒3(BAV3)的核苷酸序列、基因組結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄圖譜；Kleiboeker(1995，Virus Res.36259-268)公開(kāi)了PAV-4的E1區(qū)。本發(fā)明包括來(lái)自各種血清型的人腺病毒如Ad2、Ad5、Ad12和Ad40的E1功能。在本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例1所公開(kāi)的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，E1功能是人Ad5E1功能。人E1A基因在病毒感染后(0-2小時(shí))立即表達(dá)，該表達(dá)早于任何其他病毒基因(Flint，1982，Biochem.Biophys.Acta 651175-208；Flint，1986，AdvancesVirus Research 31169-228；Grand，1987，Biochem.J.24125-38)。Ad5E1A的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于498位核苷酸處，E1A蛋白的ATG起始位點(diǎn)位于病毒基因組的560位核苷酸處。E1B蛋白反式發(fā)揮功能，是晚期mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的。Ad5的E1B啟動(dòng)子由單個(gè)高親和性Spl識(shí)別位點(diǎn)和TATA盒組成。具體地說(shuō)，人腺病毒5E1A和E1B基因序列位于Chroboezek，J.等人(1992，Virology 186280-285)公開(kāi)的核苷酸序列的第505-4034位核苷酸位置。在本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例所公開(kāi)的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞是被人腺病毒5E1基因序列轉(zhuǎn)染的豬宿主細(xì)胞。
PCV基因組可以從PCV病毒粒中分離，也可以包含已用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和生物技術(shù)插入到質(zhì)粒中的PCV基因組。Liu等人(2000，J.Clin.Microbiol.vol 383474-3477)敘述了用PCR法將全長(zhǎng)PCV2基因組克隆到Strategene生產(chǎn)的載體pBluescript II KS(+)中。全長(zhǎng)PCV2基因組DNA可以從所得的質(zhì)粒中經(jīng)SacII消化而釋放出來(lái)。
將環(huán)狀病毒核苷酸序列引入到許可性哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中可以用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)進(jìn)行，包括但不限于轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化，包括但不限于微量注射、電穿孔、CaPO4沉淀、DEAE-葡聚糖、脂質(zhì)體、粒子轟擊等。本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例3中描述了一種將PCV2核苷酸序列轉(zhuǎn)染到VIDO R1細(xì)胞中的示例性方法。
培養(yǎng)原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)和真核細(xì)胞(如表達(dá)腺病毒E1功能的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)的方法被視為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
提供下列實(shí)施例以舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的所有參考文獻(xiàn)和專(zhuān)利文獻(xiàn)通過(guò)引用而全文引入本說(shuō)明書(shū)。
實(shí)施例實(shí)施例1制備用人腺病毒E1基因序列轉(zhuǎn)染的豬視網(wǎng)膜細(xì)胞(VIDOR1細(xì)胞)用磷酸鈣技術(shù)，用10μg質(zhì)粒pTG4671(Transgene，Strasbourg，F(xiàn)rance)轉(zhuǎn)染豬胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)物。pTG4671質(zhì)粒含有HAV-5的完整E1A和E1B序列(505-4034位核苷酸)以及作為選擇標(biāo)記的嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。在該質(zhì)粒中，E1區(qū)受來(lái)自小鼠磷酸甘油酸激酶基因的組成型啟動(dòng)子控制，而嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因受組成型SV40早期啟動(dòng)子控制。通過(guò)在含有7μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基中傳代三次選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，根據(jù)其單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶的形態(tài)變化(即喪失接觸抑制)進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行單細(xì)胞克隆。對(duì)已建立的細(xì)胞系先檢測(cè)其支持HAV-5的E1缺失突變體生長(zhǎng)的能力，然后再進(jìn)一步用PCR法研究該細(xì)胞系的基因組中是否存在E1序列，用Western印跡法研究E1A和E1B蛋白的表達(dá)，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下研究倍增時(shí)間。檢測(cè)出E1序列，并用免疫沉淀法證實(shí)E1A和E1B蛋白的產(chǎn)生。倍增時(shí)間短于親本細(xì)胞系。
為評(píng)定E1表達(dá)的穩(wěn)定性，將VIDO R1細(xì)胞傳代培養(yǎng)超過(guò)50代(每周按1∶3分裂培養(yǎng)兩次)，并測(cè)試其支持HAV-5的E1缺失突變體復(fù)制的能力。另外，用Western印跡法以固定間隔監(jiān)測(cè)E1A和E1B蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，VIDO R1細(xì)胞系在超過(guò)50次的傳代培養(yǎng)過(guò)程中保留了支持E1缺失病毒生長(zhǎng)的能力，并表達(dá)相似水平的E1蛋白。所以，可以認(rèn)為VIDO R1是業(yè)已建成的細(xì)胞系。VIDO R1細(xì)胞系已保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，ATCC保藏號(hào)為PTA-155。
實(shí)施例2實(shí)施例2描述全長(zhǎng)PCV2基因組的分子克隆。
先用PCR法由提取自患有PMWS的小豬的總DNA擴(kuò)增PCV2DNA。Liu等人(2000，J.Clin.Microbiol.383474-3477)敘述了用聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)將全長(zhǎng)PCV2基因組DNA克隆到載體pBluescript II KS(+)(Strategene)中。PCV2序列已提交給GenBank(登記號(hào)為AF086834)。全長(zhǎng)PCV2基因組DNA可以從所得的質(zhì)粒中經(jīng)SaclI消化而釋放出來(lái)。
實(shí)施例3實(shí)施例3敘述用實(shí)施例2所構(gòu)建的含有PCV2基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染如實(shí)施例1所述的VIDO R1細(xì)胞。
材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)將如實(shí)施例1所述的胎豬視網(wǎng)膜細(xì)胞系VIDO R1和Vero細(xì)胞(ATCC)于37℃和5％CO2下保持在分別添加有10％或5％熱失活胎牛血清(FBS)的基于Eagles的MEM培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)染和感染使用Lipofectin，按照制造商的建議(GIBCO BRL)，用克隆的PCV2DNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在六孔培養(yǎng)皿中的單層VIDO R1細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前，通過(guò)用SaclI消化使全長(zhǎng)PCV2基因組從質(zhì)粒中釋放出來(lái)(Liu，Q.，等，2000.J.Clin.Microbiol.383474-3477)。為進(jìn)行感染，將轉(zhuǎn)染的VIDO R1細(xì)胞進(jìn)行三次冰凍(-70℃)和融化(37℃)循環(huán)。裂解液離心澄清后用于感染新鮮VIDO R1細(xì)胞。在一些已發(fā)表的研究報(bào)告中，用無(wú)PCV1的豬腎細(xì)胞系來(lái)培養(yǎng)PCV2病毒。為刺激豬腎細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的S期，總是用D-葡糖胺處理這些細(xì)胞(見(jiàn)Tischer等，1987，Arch Virol.9639-57)。但是，該處理必須小心進(jìn)行，因?yàn)镈-葡糖胺對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物有毒(見(jiàn)Allan等，2000，J.Vet.Diagn.Investigation.123-14)。相反，由于本研究中使用的VIDO R1細(xì)胞系已用能夠誘導(dǎo)S期的HAV5-E1轉(zhuǎn)化，所以沒(méi)有必要進(jìn)行D-葡糖胺處理。
實(shí)施例4病毒純化和滴定為純化PCV2病毒，將PCV2感染的VIDO R1細(xì)胞與0.5％TritonX-114在磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)中于37℃下保溫45分鐘，然后進(jìn)行Freon 113(1，1，2-三氯三氟乙烷)提取。細(xì)胞碎片和細(xì)胞膜于2000g離心澄清15分鐘。上清液中的病毒于35000g下通過(guò)20％蔗糖墊沉淀3小時(shí)。將病毒沉淀物懸浮于PBS中，于-70℃下貯存。用定量ORF2蛋白免疫過(guò)氧化物酶染色法以感染單位(IU)形式確定病毒滴度。為此，將12孔培養(yǎng)皿中的細(xì)胞單層用病毒的系列稀釋液感染。病毒吸附1小時(shí)后，洗滌細(xì)胞，并在其上鋪上含有2％FBS和0.7％瓊脂糖的MEM。感染后(p.i.)第3天，去掉瓊脂糖覆蓋層，將細(xì)胞固定，于-20℃下用甲醇/丙酮(體積比為1∶1)透化20分鐘。在室溫下用1％牛血清白蛋白封閉1小時(shí)后，將細(xì)胞與兔抗ORF2血清一起保溫(Liu等，2001，Protein Expression andPurification.21115-120)。保溫2小時(shí)后，平板用PBS洗滌，然后用VECTASTAIN Elite ABC試劑盒(Vector Laboratories)進(jìn)行處理。反應(yīng)用3，3，-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)四鹽酸鹽顯色，并在顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的細(xì)胞，以IU表示病毒滴度，其中IU定義為感染后3天每轉(zhuǎn)化灶一個(gè)陽(yáng)性染色的細(xì)胞。
病毒DNA提取和表征用Hirt的方法(1967，J.Mol.Biol.26365-369)從PCV2感染的VIDOR1細(xì)胞單層中提取病毒DNA。然后用如Liu等人所述的限制分析和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法(Liu，等，2000，J.Clin.Microbiol.383474-3477)，對(duì)病毒DNA進(jìn)行鑒定。
用從感染細(xì)胞中提取的DNA作模板并使用PCV2特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出一個(gè)特定大小的產(chǎn)物，而從對(duì)照物即未感染的細(xì)胞中未擴(kuò)增出任何DNA。與所預(yù)期的限制圖譜相一致，用NcoI和StuI消化病毒DNA產(chǎn)生兩個(gè)大小分別為1291bp和477bp的片段，用EcoRI和StuI消化產(chǎn)生兩個(gè)大小分別為1492bp和276bp的片段，用EcoRI和EcoRV消化產(chǎn)生兩個(gè)大小分別為1094bp和674bp的片段。數(shù)據(jù)表明已獲得了PCV2病毒。使用免疫染色測(cè)定法，并通過(guò)計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞，測(cè)得該制備物的病毒滴度為2×107IU/ml。
序列表<110>薩斯喀徹溫大學(xué)(University of Saskatchewan)<120>培養(yǎng)環(huán)狀病毒的方法<130>PAT 684W-90<140>PCT/CA02/00413<141>2002-03-27<160>3<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>314<212>PRT<213>豬環(huán)狀病毒2<400>1Met Pro Ser Lys Lys Asn Gly Arg Ser Gly Pro Gln Pro His Lys Arg1 5 10 15Trp Val Phe Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Asp Glu Arg Lys Lys Ile20 25 30Arg Glu Leu Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Ile Val Gly Glu Glu35 40 45Gly Asn Glu Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gln Gly Phe Ala Asn Phe50 55 60Val Lys Lys Gln Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Leu Gly Ala Arg65 70 75 80Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln Gln Asn Lys Glu Tyr85 90 95Cys Ser Lys Glu Gly Asn Leu Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Ser100 105 110Gln Gly Gln Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu115 120 125Ser Gly Ile Leu Val Thr Val Ala Lys Gln His Pro Val Thr Phe Val130 135 140Lys Asn Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met145 150 155 160Gln Lys Arg Asp Trp Lys Thr Asn Val His Phe Ile Val Gly Pro Pro
165 170 175Gly Cys Gly Lys Ser Lys Trp Ala Ala Asn Phe Ala Asn Pro Glu Thr180 185 190Thr Tyr Trp Lys Pro Pro Lys Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly195 200 205Glu Lys Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp210 215 220Asp Leu Leu Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Lys Thr Lys225 230 235 240Gly Gly Thr Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn245 250 255Gln Thr Pro Leu Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu260 265 270Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Leu Val Phe Trp Lys Asn Val Thr275 280 285Glu Gln Ser Thr Glu Glu Gly Gly Gln Phe Val Thr Leu Ser Pro Pro290 295 300Cys Pro Glu Phe Pro Tyr Glu Ile Asn Tyr305 310<210>2<211>233<212>PRT<213>豬環(huán)狀病毒2<400>2Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg1 5 10 15Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro20 25 30Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg35 40 45Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr50 55 60Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val65 70 75 80Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr100 105 110Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn115 120 125Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr130 135 140Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr145 150 155 160Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro165 170 175Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn180 185 190Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp195 200 205Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe210 215 220Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro225 230<210>3<211>1768<212>DNA<213>豬環(huán)狀病毒2<400>3accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcaacacct cagcagcaac atgcccagca 60agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc120cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta180ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt240ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg300agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg tagtaaagaa ggcaacttac360ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga420gtaccttgtt ggagagcggg attctggtga ccgttgcaaa gcagcaccct gtaacgtttg480tcaaaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg caaaagcgtg540attggaaaac caatgtacac ttcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg600
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權(quán)利要求
1.一種重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該重組細(xì)胞表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能，并包含豬環(huán)狀病毒基因組或其能夠復(fù)制的部分，其中所述細(xì)胞允許所述豬環(huán)狀病毒復(fù)制。
2.權(quán)利要求1的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述腺病毒E1功能為人腺病毒E1功能。
3.權(quán)利要求1的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述腺病毒E1功能為豬腺病毒E1功能。
4.權(quán)利要求1的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來(lái)源于豬。
5.權(quán)利要求4的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為豬視網(wǎng)膜細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞被哺乳動(dòng)物腺病毒E1基因序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
7.權(quán)利要求6的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述E1基因序列是人腺病毒E1基因序列。
8.權(quán)利要求6的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物腺病毒E1基因序列對(duì)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是異源的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)環(huán)狀病毒，特別是豬環(huán)狀病毒的方法。本發(fā)明提供用于在表達(dá)哺乳動(dòng)物腺病毒E1功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中培養(yǎng)豬環(huán)狀病毒的組合物和方法。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1840656SQ20061007314
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2002年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月27日
發(fā)明者劉強(qiáng), S·K·蒂科, P·威爾森, L·A·巴比烏克 申請(qǐng)人:薩斯喀徹溫大學(xué)