專利名稱：β－甘露聚糖酶及其表達(dá)方法與專用工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶及其表達(dá)方法及其專用工程菌，特別是涉及一種β-甘露聚糖酶及其表達(dá)方法與專用工程菌。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞壁主要由半纖維素、纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β-1，4-D-甘露糖連接而成的線狀多聚體，在多糖的側(cè)鏈上主要有乙?；桶肴樘腔热〈鶊F(tuán)。甘露聚糖具有高度的親水性，因而在單胃動(dòng)物的消化道內(nèi)大量吸水，使消化道內(nèi)容物的粘度增加，從而對(duì)胃腸的蠕動(dòng)產(chǎn)生抵抗作用，直接影響了動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。近年來，隨著豆類產(chǎn)品(豆粕等)在飼糧中的廣泛應(yīng)用，甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)問題也越來越受到重視，在飼料中添加酶制劑是解決這一問題的主要途徑。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)和脫乙酰酶(EC3.1.1.6)的協(xié)同作用，其中β-甘露聚糖酶在飼料中的應(yīng)用比較廣泛。
β-甘露聚糖酶在自然界中廣泛存在，在低等動(dòng)物、高等植物發(fā)芽的種子，以及細(xì)菌及真菌中等都有發(fā)現(xiàn)。微生物來源的β-甘露聚糖酶由于活性高，提取、純化方便，發(fā)揮酶效的溫度和pH范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，備受研究人員的重視。特別是對(duì)芽孢桿菌、曲霉和木霉等產(chǎn)的β-甘露聚糖酶研究較多，部分微生物產(chǎn)的β-甘露聚糖酶及其特性如表1所示。不同微生物所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶在分子量、最適催化溫度、最適pH值、底物特異性等方面都存在很大差異。真菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶作用偏酸性，而細(xì)菌和放線菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏堿性，但穩(wěn)定性較好。
表1部分微生物產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶及其性質(zhì)


近年來，隨著對(duì)自然界半纖維素資源的開發(fā)和對(duì)飼料中甘露聚糖抗?fàn)I養(yǎng)因子研究的深入，研究人員也逐漸展開了對(duì)甘露聚糖酶的分子生物學(xué)研究。但目前的研究還主要集中于酶蛋白的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)分析以及編碼基因的克隆和表達(dá)上，關(guān)于酶催化的分子機(jī)制和酶學(xué)特性改造方面的研究報(bào)道還很少。吳襟等(吳襟，何秉旺，2000，諾卡氏菌型放線菌β-甘露聚糖酶的化學(xué)修飾及活性中心的研究，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，16(2)227-230.)利用化學(xué)修飾的方法對(duì)諾卡氏菌形放線菌產(chǎn)的甘露糖酶的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了初步研究，證明了酶蛋白的巰基、酪氨酸殘基及色氨酸殘基是維持酶活性必需的基團(tuán)，進(jìn)一步研究證實(shí)蛋白內(nèi)部的二硫鍵是影響該酶熱穩(wěn)定性的重要因素。Cann等(Cann IKO，Kocherginskaya S，King MR et al，1999，Molecularcloning，sequencing，and expression of a novel multidomain mannanase gene fromThermoanaerobacterium polysaccharolyticum，Journal of Bacteriology，181(5)1643-1651.)從Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum中克隆到一種高分子量(119.6kDa)甘露聚糖酶，缺失突變證明該酶含有兩個(gè)纖維素結(jié)合區(qū)和一個(gè)催化功能區(qū)。
目前，β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)主要采用細(xì)菌或芽孢桿菌的液體發(fā)酵法，主要缺點(diǎn)是需要底物誘導(dǎo)，且發(fā)酵工藝復(fù)雜，成本高，產(chǎn)率低，酶活性低等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種活性較高的β-甘露聚糖酶。
本發(fā)明所提供的β-甘露聚糖酶，來源于硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus，保藏號(hào)CGMCC No.0608)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且對(duì)甘露聚糖具有降解作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由383個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第1-21位氨基酸殘基為信號(hào)肽，自氨基端第22-383位氨基酸殘基為成熟蛋白，自氨基端第205-207位氨基酸殘基為典型的甘露聚糖酶保守序列。
編碼上述β-甘露聚糖酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；3)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2和SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃條件下雜交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃條件下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2和SEQ ID №3均由1327個(gè)堿基組成，編碼序列均為自5’端第25-1176位堿基，均編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-24位堿基為5’端非翻譯區(qū)，自5’端第25-87位堿基為信號(hào)肽編碼序列，自5’端第88-1176位堿基為成熟蛋白編碼序列，自5’端第613-621位堿基編碼典型的甘露聚糖酶保守序列，自5’端第1177-1327位堿基為3’端非翻譯區(qū)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增β-甘露聚糖酶基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種表達(dá)β-甘露聚糖酶的專用工程菌。
本發(fā)明所提供的表達(dá)β-甘露聚糖酶的工程菌，是將含有上述β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列的畢赤酵母表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母中得到的；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列在畢赤酵母表達(dá)載體中位于α因子序列的下游；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列為序列表中的SEQ ID №4或SEQ ID №5，優(yōu)選為SEQ ID №5。
序列表中的SEQ ID №4和SEQ ID №5均由1089個(gè)堿基組成，編碼上述β-甘露聚糖酶的成熟蛋白。
用于構(gòu)建含有β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列的畢赤酵母表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種適于外源基因表達(dá)的畢赤酵母表達(dá)載體，如pPICzαA、pPICZA或pPIC9K等。
以pPICzαA為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有上述β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列的畢赤酵母表達(dá)載體為pPIC-Mann。
所述畢赤酵母可為任意適于蛋白表達(dá)的畢赤酵母菌株，如畢赤酵母X-33或GS115菌株等。
以畢赤酵母X-33為出發(fā)菌株，構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有pPIC-Mann的重組畢赤酵母菌株為X-33/pPIC-Mann。
上述重組畢赤酵母表達(dá)載體可按照生物工程領(lǐng)域中的常規(guī)方法構(gòu)建。
將重組畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母的方法優(yōu)選為電擊轉(zhuǎn)化法，但也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如，氯化鋰轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種β-甘露聚糖酶的表達(dá)方法。
本發(fā)明所提供的β-甘露聚糖酶的表達(dá)方法，是發(fā)酵上述β-甘露聚糖酶的專用表達(dá)工程菌，得到β-甘露聚糖酶。
發(fā)酵上述重組畢赤酵母時(shí)需加入甲醇誘導(dǎo)劑，所加入甲醇的濃度為0.8-1.2％，優(yōu)選為1％。
為補(bǔ)償甲醇的揮發(fā)損失，每24小時(shí)還要補(bǔ)加甲醇，使菌液中的甲醇濃度保持在0.8-1.2％，誘導(dǎo)溫度為28-30℃。
上述百分濃度均為體積百分濃度。
本發(fā)明提供了一種來源于硫色曲霉的β-甘露聚糖酶及其編碼基因，并且根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，合成了經(jīng)密碼子優(yōu)化的該酶成熟蛋白的編碼序列，進(jìn)而構(gòu)建出硫色曲霉β-甘露聚糖酶的畢赤酵母工程菌株。將該菌株在10L發(fā)酵罐中發(fā)酵后，發(fā)酵液的酶活力可達(dá)1100IU/mL以上，實(shí)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶的高效表達(dá)，且發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，提取成本低廉，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。此外，該酶具有酸穩(wěn)定性高，催化pH范圍廣，比活性高，對(duì)金屬離子耐受性好的特點(diǎn)。本發(fā)明的β-甘露聚糖酶及其工程菌將在β-甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及動(dòng)物飼料添加劑的制備中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為畢赤酵母重組子的PCR鑒定結(jié)果圖2為重組畢赤酵母X-33/pPIC-Mann中β-甘露聚糖酶基因遺傳穩(wěn)定性的PCR鑒定結(jié)果圖3為重組菌株X-33/pPIC-Mann表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖4為表達(dá)的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果圖5為表達(dá)的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果圖6為表達(dá)的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的的動(dòng)力學(xué)參數(shù)具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述培養(yǎng)基中的溶劑均為水，所述引物、序列合成及測(cè)序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。
實(shí)施例1、本發(fā)明來自硫色曲霉的β-甘露聚糖酶基因的克隆來自硫色曲霉的β-甘露聚糖酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列的獲得包括以下步驟1、硫色曲霉的藥配及其總RNA的提取將硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus，保藏號(hào)CGMCC No.0608)接種到其生長(zhǎng)培養(yǎng)基(用400mL自來水溶解85g麥麩、10g豆餅粉、0.2g KH2PO4、0.3g NaCl和10g蔗糖，121℃蒸煮30min，過濾取上清，分裝后再高壓滅菌)中，30℃搖床培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，5000r/min離心1min收集菌體，置于液N2中研磨。取100mg研磨后的菌體，置于1.5mL離心管中，加入500μL RNA抽提緩沖液(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，1％SDS，200mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA)，再加入500μL酚/仿(1∶1)，4℃、12000r/min離心5min，上清加入等體積4mol/L LiCl，4℃沉淀4h，然后12000r/min離心15min，棄上清，將沉淀用70％的乙醇洗兩次，真空抽干，溶于20μl DEPC處理的ddH2O中，得到目的菌株的總RNA。
2、β-甘露聚糖酶基因cDNA片段的克隆對(duì)GenBank中公布的刺孢曲霉(GenBank登錄號(hào)L35487)和瑞氏木霉(GenBank登錄號(hào)L25310)β-甘露聚糖酶基因的mRNA序列進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明在中間段有一段高度同源的核苷酸序列，根據(jù)這一高度保守的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，引物序列如下P1(上游引物)5’-TTCAACGACGTCAACAC-3’；P2(下游引物)5’-A(T/C)CCAGCC(G/A)TTGCCCCA-3’以步驟1提取的硫色曲霉總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)合成其第一鏈cDNA。再以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μL PCR反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液5μL、引物P1和P2各1μL(20μM)、Taq酶1μL(5μ/μL)、dNTPs 1μL(2.5mM)、模板cDNA 1μL、H2O 40μL；PCR反應(yīng)條件為首先94℃預(yù)變性3min；然后94℃預(yù)變性45s，49℃退火45s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收長(zhǎng)度約600bp的目的片段并對(duì)其進(jìn)行純化，將回收片段克隆到載體pUCm-T(上海生工生物工程有限公司)中，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增片段含有上述高度保守的核苷酸序列，長(zhǎng)度為608bp。
3、β-甘露聚糖酶基因cDNA的3’UTR(非翻譯區(qū))的克隆根據(jù)步驟2獲得的β-甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，設(shè)計(jì)出3’-RACE擴(kuò)增特引物MAN-3-25’-TACCCGTACCAATTCGC-3’。然后以總RNA為模板，用3’-Full RACE試劑盒(TaKaRa公司)擴(kuò)增β-甘露聚糖酶基因cDNA的3’末端片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化長(zhǎng)度約600bp的擴(kuò)增片段，將其克隆到載體pUCm-T，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的β-甘露聚糖酶基因cDNA的3’UTR片段長(zhǎng)度為151bp。
4、β-甘露聚糖酶基因cDNA的5’UTR的克隆根據(jù)步驟2獲得的β-甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，設(shè)計(jì)出5’-RACE擴(kuò)增特引物Race-1、Race-2、Race-3、Race-4和RT-P，引物序列如下Race-15’-GTATTTGCGTGGGAGTTGGC-3’；Race-25’-TACCCGTACCAATTCGCCGA-3’
Race-35’-TGCAATCTGCGTATCAGACG-3’；Race-45’-ACGAGACGGATTTCTATACC-3’；RT-P5’-CCAACTCCCACGCAA-3’。
然后以硫色曲霉總RNA為模板，用5’-Full RACE試劑盒(TaKaRa公司)擴(kuò)增β-甘露聚糖酶基因cDNA的5’末端片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化長(zhǎng)度約500bp的擴(kuò)增片段，將其克隆到載體pUCm-T上，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的β-甘露聚糖酶基因cDNA的5’UTR片段長(zhǎng)度為24bp。
5、β-甘露聚糖酶基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得根據(jù)步驟3和4獲得的β-甘露聚糖酶基因的5’和3’末端序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列如下F1(上游引物)5-cggaattcatgaagctctccagctc-3；F2(下游引物)5-cccaagcttttaggcgctatcaatagc-3以硫色曲霉總RNA為模板，在引物F1和F2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增β-甘露聚糖酶基因的全長(zhǎng)cDNA，10×PCR buffer 5μL、引物(F1/F2)各1μL(20μM)、Taq酶1μL(5μ/μL)、dNTPs 1μL(2.5mM)、模板cDNA 1μL、H2O 40μL，總反應(yīng)體系50μL，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后按以下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性45s，49℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化長(zhǎng)度約1152bp的擴(kuò)增片段，將其克隆到載體pUCm-T上，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，用M13+/-引物對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因全長(zhǎng)cDNA具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №2由1327個(gè)堿基組成，編碼序列為自5’端第25-1176位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-24位堿基為5’端非翻譯區(qū)，自5’端第25-87位堿基為信號(hào)肽編碼序列，自5’端第88-1176位堿基為成熟蛋白編碼序列，自5’端第613-621位堿基編碼典型的甘露聚糖酶保守序列，自5’端第1177-1327位堿基為3’端非翻譯區(qū)。序列表中的SEQ ID №1由383個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第1-21位氨基酸殘基為信號(hào)肽，自氨基端第22-383位氨基酸殘基為成熟蛋白，自氨基端第205-207位氨基酸殘基為典型的甘露聚糖酶保守序列。硫色曲霉β-甘露聚糖酶成熟蛋白的分子量為41kDa。將克隆的硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明該酶與刺孢曲霉β-甘露聚糖酶的親緣關(guān)系最近，核苷酸序列相似性達(dá)71％，氨基酸序列相似性達(dá)72％。
實(shí)施例2、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的表達(dá)工程菌的構(gòu)建一、硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建1、硫色曲霉β-甘露聚糖酶成熟蛋白基因的合成在不改變氨基酸序列的前提下，僅將實(shí)施例1克隆的硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因中編碼成熟蛋白的密碼子替換為畢赤酵母的偏愛密碼子，從而得到另外一條硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID №3，序列表中的SEQ ID№3由1327個(gè)堿基組成，編碼序列為自5’端第25-1176位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-24位堿基為5’端非翻譯區(qū)，自5’端第25-87位堿基為信號(hào)肽編碼序列，自5’端第88-1176位堿基為成熟蛋白編碼序列，自5’端第613-621位堿基編碼典型的甘露聚糖酶保守序列，自5’端第1177-1327位堿基為3’端非翻譯區(qū)。然后人工合成SEQ ID №3中編碼硫色曲霉β-甘露聚糖酶成熟蛋白的基因片段(SEQ ID №3中自5’端第88-1176位堿基)，并在5’和3’末端分別添加限制性內(nèi)切EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)。
2、硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因畢赤酵母表達(dá)載體的獲得用限制性內(nèi)切EcoR I和Xba I對(duì)步驟1合成的基因進(jìn)行雙酶切后，將其連入經(jīng)相同酶雙酶切的載體pPICzαA(Invitrogen)中α因子序列的下游，得到硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的畢赤酵母表達(dá)載體，命名為pPIC-Mann，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，用含有100μg/mL抗生素Zeocin的LB抗性平板篩選出陽性克隆，提質(zhì)粒。
二、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的表達(dá)工程菌的獲得1、線性化硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒的獲得取10μg步驟一獲得的硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC-Mann，將其用限制性內(nèi)切酶BspHI在37℃下酶切12-24小時(shí)，然后將酶切產(chǎn)物用無水乙醇沉淀，溶于10μL滅菌水中。
2、畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞的制備將畢赤酵母X-33接種于YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，其余為水)中，在28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)至OD600為1.3-1.5后，5000rpm離心5min收集菌體細(xì)胞，用滅菌水洗滌2次，將菌體懸浮于0.5mL 1mol/L的山黎醇溶液中。
3、轉(zhuǎn)化取80μL步驟2制備的畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞，加入10μg步驟1獲得的線性化的質(zhì)粒pPIC-Mann，混勻，置于0.2cm電擊杯中，冰浴5min，在2000伏電壓(25μF)條件下電擊，迅速加入1mL 1mol/L山黎醇，置于28℃靜止培養(yǎng)2h。然后將培養(yǎng)物涂布于含抗生素Zeocin(100μg/mL)的YPDS(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂，其余為水)平板上，在28℃下培養(yǎng)3-4天，直至長(zhǎng)出清晰的菌落。
4、重組菌的鑒定、篩選挑取長(zhǎng)出的單菌落，將其接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)2-3天，提取重組酵母菌的總DNA并以此為模板，在引物QJ-F-1(5-ccggaattcttgccaaaggctttc-3)和QJ-R-1(5-gctctagattaagcagaatcaatagcag-3)的引導(dǎo)下，，PCR鑒定陽性重組子，鑒定結(jié)果如圖1所示(泳道1轉(zhuǎn)化pPICzαA空載體的畢赤酵母X-33(對(duì)照)；泳道2DNA MarkerλDNA/EcoRI+HindIII雙酶切；泳道3和泳道4重組酵母)，擴(kuò)增出約1000bp DNA片段的為陽性重組子。挑取陽性重組子，將其接種于含30mL BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％biotin，1％甘油，100mM pH6.0磷酸鹽緩沖液，其余為水)培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于28℃、250-300rpm培養(yǎng)至OD600為2-6，然后室溫下離心收集菌體，用BMMY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.1mol/L磷酸緩沖液pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素)重懸菌體，使OD600為1.0，再用終濃度為0.5％(V/V)的甲醇為唯一碳源進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過SDS-PAGE及活性測(cè)定篩選高效表達(dá)重組菌株，結(jié)果篩到1株酶活較高的重組菌，命名為X-33/pPIC-Mann。對(duì)該株菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，共傳20代，分別于傳至第1、5、10、15、20代采集樣品，提取總DNA，在引物QJ-F-1(5-ccggaattcttgccaaaggctttc-3)和QJ-R-1(5-gctctagattaagcagaatcaatagcag-3)的引導(dǎo)下，PCR鑒定硫色曲霉β-甘露聚糖酶基因的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示(泳道1轉(zhuǎn)化pPICzαA空載體的畢赤酵母X-33(對(duì)照)；泳道2-6傳至第1、5、10、15、20代的X-33/pPIC-Mann；泳道7DNAMarkerλDNA/EcoRI+HindIII雙酶切)，表明沒有發(fā)生外源基因丟失現(xiàn)象，該菌株具有較高的遺傳穩(wěn)定性。
實(shí)施例3、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)挑取實(shí)施例2獲得的重組畢赤酵母酵母菌株X-33/pPIC-Mann，將其接種于裝有200mL BMGY培養(yǎng)基的3L搖瓶中，在28-30℃、280rpm下振搖24小時(shí)以上，得到OD600約為3.0的種子液。然后配制4L BMGY培養(yǎng)基，裝入10L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，在121℃下滅菌后，冷卻至28.5℃，加入上述種子液，用氨水和磷酸調(diào)節(jié)pH至5.5，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和空氣流量控制溶氧大于30％。經(jīng)測(cè)定，接入種子液23h后，甘油消耗完全(溶氧標(biāo)記為100％)，進(jìn)入流加50％(W/V)甘油階段，流速為60mL/h。流加4h后，甘油消耗完全(溶氧標(biāo)記為100％)，進(jìn)入甲醇流加階段，流速為12mL/h，同時(shí)控制溶氧為20％以上(如不能使溶氧保持在20％以上，停止添加甲醇，直至溶氧回升)。3h后，將甲醇流速調(diào)到24mL/h，再過2h，將流速調(diào)到30mL/h，并保持到最后，同時(shí)，分別于誘導(dǎo)表達(dá)1、2、3、4天后采集發(fā)酵液，留待檢測(cè)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵液中表達(dá)的蛋白含量，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道1Marker；泳道2轉(zhuǎn)化pPICzαA空載體的畢赤酵母X-33(對(duì)照)；泳道3誘導(dǎo)4天后采集的樣品；泳道4誘導(dǎo)3天后采集的樣品；泳道5誘導(dǎo)2天后采集的樣品；泳道6誘導(dǎo)1天后采集的樣品)，結(jié)果經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得了約45KD的重組蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，且誘導(dǎo)表達(dá)4天后的蛋白表達(dá)量最高。
實(shí)施例4、硫色曲霉β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析現(xiàn)對(duì)實(shí)施例3表達(dá)的硫色曲霉β-甘露聚糖酶進(jìn)行以下酶學(xué)性質(zhì)分析1、最適pH值和pH穩(wěn)定性分析最適pH值的測(cè)定分別用pH值為2.4、3.0、4.0、5.0、6.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制甘露聚糖底物，濃度為0.8g/mL，于40℃下測(cè)定相對(duì)酶活力，以最高酶活力為100％，確定該酶的最適pH值。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最適pH值為2.4。
pH值穩(wěn)定性的檢測(cè)將表達(dá)的β-甘露聚糖酶分別用pH值為2.4、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液處理30min后，于40℃反應(yīng)溫度下測(cè)定殘留的相對(duì)酶活力，以最高酶活力為100％，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶具有較高的pH值穩(wěn)定性。
2、最適溫度和溫度穩(wěn)定性分析最適溫度的測(cè)定用100mM醋酸鈉緩沖液配制甘露聚糖底物，濃度為0.8g/mL，分別在30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃、90℃下測(cè)定相對(duì)酶活力，以最高酶活力為100％，確定該酶的最適反應(yīng)溫度。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明硫色曲霉β-甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。
溫度穩(wěn)定性的檢測(cè)將表達(dá)的β-甘露聚糖酶在不同溫度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，90℃)下保溫30min，然后放入冰水中冷卻，于最適溫度(50℃)和最適pH值(2.4)條件下測(cè)定相對(duì)酶活力，以最高酶活力為100％，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶具有較高的溫度穩(wěn)定性。
3、酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km米氏常數(shù)、Vmax最大反應(yīng)速率)的測(cè)定用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(最適pH值2.4)配制成不同濃度(1-20mg/mL)的甘露聚糖溶液并以此為底物，在最適溫度(50℃)下反應(yīng)10min測(cè)定表達(dá)的β-甘露聚糖酶的酶活力，利用米氏方程雙倒數(shù)作圖法確定Km、Vmax值。根據(jù)米氏方程V＝-KmxV/[S]+Vmax繪制的直線圖如圖6所示，由圖可知Km值為0.91mg/mL、Vmax值為909.09U/mg，表明本發(fā)明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶具有較高的酶活力。
4、金屬離子和螯合劑(EDTA)對(duì)酶活力的影響在磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液(最適pH值2.4)中加入1mM的不同化合物(MgCl2、FeCl2、MnSO4、CuSO4、ZnCl2、CaCl2、NaCl、EDTA)，將表達(dá)的甘露聚糖酶在上述溶液中處理30min后，在最適溫度下測(cè)定表達(dá)的β-甘露聚糖酶的相對(duì)酶活力，以不添加金屬離子和螯合劑等為空白對(duì)照(100％)，結(jié)果如表2所示，表明金屬離子和螯合劑(EDTA)對(duì)本發(fā)明的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的酶活影響不大，該酶具有較高的金屬離子穩(wěn)定性。
表2表達(dá)的硫色曲霉β-甘露聚糖酶的金屬離子穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

序列表<160>5<210>1<211>383<212>PRT<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)<400>1Met Lys Leu Ser Ser Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala1 5 10 15Asn Leu Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser20 25 30Ser Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe35 40 45Thr Ile Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp50 55 60Ile Gly Phe Leu Thr Asp Asp Ser Asp Val Asp Leu Val Met Ser His65 70 75 80Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp85 90 95Val Thr Thr Gln Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln100 105 110Asp Gly Lys Ser Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu115 120 125Asp Tyr Val Val Ser Ser Ala Glu Gln His Gly Ile Lys Leu Ile Ile130 135 140Asn Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val145 150 155 160Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Asp Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr165 170 75
Met Gln Ser Ala Tyr Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr180 185 90Ser Asn Ser Ser Ala Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg195 200 205Cys Pro Ser Cys Asp Thr Thr Val Leu Tyr Asp Trp Ile Glu Lys Thr210 215 220Ser Lys Phe Ile Lys Gly Leu Asp Ala Asp His Met Val Cys Ile Gly225 230 235 240Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn Thr Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr245 250 255Gln Phe Ala Glu Gly Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr260 265 270Ile Asp Phe Ala Thr Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser275 280 285Asp Asp Trp Gly Asn Gly Trp Ile Ser Ala His Gly Ala Ala Cys Lys290 295 300Ala Ala Gly Lys Pro Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn305 310 315 320His Cys Ser Val Glu Ser Pro Trp Gln Gln Thr Ala Leu Asn Thr Thr325 330 335Gly Val Ser Ala Asp Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr340 345 350Gly Glu Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp355 360 365Tyr Glu Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Ala Ile Asp Ser Ala370 375 380<210>2<211>1327<212>DNA<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)
<400>2aatacagcca agcaaaccac cacaatgaag ctctccagct ccctcctcac cctggccagc 60ctggcgctgg ccaacctctc cacggccctg cccaaagcct ctcctgcacc aagcaccagc 120agcagcagcg cctccacctc cttcgccagc acctcgggcc tccaattcac catcgacggc 180gaaaccggct acttcgccgg aacgaacagt tactggatcg gtttcctgac cgacgactcc 240gatgtcgacc tggtgatgag ccacctgaag tcatccggcc tcaaaatcct ccgcgtatgg 300ggcttcaacg acgtcaccac gcagccctct tccggcacag tctggtacca actgcaccag 360gacggcaaat caaccatcaa cactggcgcc gacggtctcc agcgcctcga ctacgtcgtc 420tcctccgccg aacagcacgg catcaaactc atcatcaact tcgtcaacta ctggaccgac 480tacggcggta tgtccgcgta cgtgagcgca tatggcggat ccgacgagac ggatttctat 540accagtgata cgatgcaatc tgcgtatcag acgtatatta agacggtcgt ggagcggtat 600agtaactcct ctgcggtatt tgcgtgggag ttggcgaatg agccgagatg tcctagttgt 660gatactaccg tgttgtatga ttggattgag aagacgagta aatttattaa ggggttggat 720gccgatcata tggtttgtat tggtgatgag ggcttcggcc tcaacaccga ctcggacggc 780agctacccgt accaattcgc cgagggtctc aacttcacca tgaacctcgg tatcgatact 840attgactttg ctaccctcca cttgtatcct gatagctggg gcacctccga cgactggggc 900aacggatgga tcagcgcaca cggcgcggca tgcaaagcgg ccggcaagcc ctgtctactg 960gaggaatacg gagtcacctc gaaccactgt agtgtggaga gcccgtggca gcagacggcc 1020ctcaacacga ctggcgtcag cgcagatctc ttctggcagt atggtgatga tttgagcacg 1080ggcgagtcgc cggatgatgg aaataccatt tactacggga cgagcgatta tgagtgtttg 1140gtcacggatc atgtggctgc tattgatagc gcctaaggga tagggagatg tggatatatc 1200tagttgatac attatgaggg gtgctgtaca taagaatgcg ccggagggag ggtgtgaagg 1260atgataactg atctttgagt ttggatagga tacaattcga gaggcaaatc atcccttcga 1320ttaccat 1327<210>3<211>1327<212>DNA<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)<400>3aatacagcca agcaaaccac cacaatgaag ctctccagct ccctcctcac cctggccagc 60
ctggcgctgg ccaacctctc cacggccttg ccaaaggctt ctccagctcc atctacttct120tcttcttctg cttctacttc ttttgcttct acttctggtt tgcaatttac tattgatggt180gaaactggtt actttgctgg tactaactct tactggattg gttttttgac tgatgattct240gatgttgatt tggttatgtc tcatttgaag tcttctggtt tgaagatttt gagagtttgg300ggttttaacg atgttactac tcaaccatct tctggtactg tttggtacca attgcatcaa360gatggtaagt ctactattaa cactggtgct gatggtttgc aaagattgga ttacgttgtt420tcttctgctg aacaacatgg tattaagttg attattaact ttgttaacta ctggactgat480tacggtggta tgtctgctta cgtttctgct tacggtggtt ctgatgaaac tgatttttac540acttctgata ctatgcaatc tgcttaccaa acttacatta agactgttgt tgaaagatac600tctaactctt ctgctgtttt tgcttgggaa ttggctaacg aaccaagatg tccatcttgt660gatactactg ttttgtacga ttggattgaa aagacttcta agtttattaa gggtttggat720gctgatcata tggtttgtat tggtgatgaa ggttttggtt tgaacactga ttctgatggt780tcttacccat accaatttgc tgaaggtttg aactttacta tgaacttggg tattgatact840attgattttg ctactttgca tttgtaccca gattcttggg gtacttctga tgattggggt900aacggttgga tttctgctca tggtgctgct tgtaaggctg ctggtaagcc atgtttgttg960gaagaatacg gtgttacttc taaccattgt tctgttgaat ctccatggca acaaactgct1020ttgaacacta ctggtgtttc tgctgatttg ttttggcaat acggtgatga tttgtctact1080ggtgaatctc cagatgatgg taacactatt tactacggta cttctgatta cgaatgtttg1140gttactgatc atgttgctgc tattgattct gcttaaggga tagggagatg tggatatatc1200tagttgatac attatgaggg gtgctgtaca taagaatgcg ccggagggag ggtgtgaagg1260atgataactg atctttgagt ttggatagga tacaattcga gaggcaaatc atcccttcga1320ttaccat 1327<210>4<211>1089<212>DNA<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)<400>4ctgcccaaag cctctcctgc accaagcacc agcagcagca gcgcctccac ctccttcgcc60agcacctcgg gcctccaatt caccatcgac ggcgaaaccg gctacttcgc cggaacgaac120agttactgga tcggtttcct gaccgacgac tccgatgtcg acctggtgat gagccacctg180
aagtcatccg gcctcaaaat cctccgcgta tggggcttca acgacgtcac cacgcagccc240tcttccggca cagtctggta ccaactgcac caggacggca aatcaaccat caacactggc300gccgacggtc tccagcgcct cgactacgtc gtctcctccg ccgaacagca cggcatcaaa360ctcatcatca acttcgtcaa ctactggacc gactacggcg gtatgtccgc gtacgtgagc420gcatatggcg gatccgacga gacggatttc tataccagtg atacgatgca atctgcgtat480cagacgtata ttaagacggt cgtggagcgg tatagtaact cctctgcggt atttgcgtgg540gagttggcga atgagccgag atgtcctagt tgtgatacta ccgtgttgta tgattggatt600gagaagacga gtaaatttat taaggggttg gatgccgatc atatggtttg tattggtgat660gagggcttcg gcctcaacac cgactcggac ggcagctacc cgtaccaatt cgccgagggt720ctcaacttca ccatgaacct cggtatcgat actattgact ttgctaccct ccacttgtat780cctgatagct ggggcacctc cgacgactgg ggcaacggat ggatcagcgc acacggcgcg840gcatgcaaag cggccggcaa gccctgtcta ctggaggaat acggagtcac ctcgaaccac900tgtagtgtgg agagcccgtg gcagcagacg gccctcaaca cgactggcgt cagcgcagat960ctcttctggc agtatggtga tgatttgagc acgggcgagt cgccggatga tggaaatacc1020atttactacg ggacgagcga ttatgagtgt ttggtcacgg atcatgtggc tgctattgat1080agcgcctaa1089<210>5<211>1089<212>DNA<213>硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)<400>5ttgccaaagg cttctccagc tccatctact tcttcttctt ctgcttctac ttcttttgct60tctacttctg gtttgcaatt tactattgat ggtgaaactg gttactttgc tggtactaac120tcttactgga ttggtttttt gactgatgat tctgatgttg atttggttat gtctcatttg180aagtcttctg gtttgaagat tttgagagtt tggggtttta acgatgttac tactcaacca240tcttctggta ctgtttggta ccaattgcat caagatggta agtctactat taacactggt300gctgatggtt tgcaaagatt ggattacgtt gtttcttctg ctgaacaaca tggtattaag360ttgattatta actttgttaa ctactggact gattacggtg gtatgtctgc ttacgtttct420gcttacggtg gttctgatga aactgatttt tacacttctg atactatgca atctgcttac480caaacttaca ttaagactgt tgttgaaaga tactctaact cttctgctgt ttttgcttgg540
gaattggcta acgaaccaag atgtccatct tgtgatacta ctgttttgta cgattggatt600gaaaagactt ctaagtttat taagggtttg gatgctgatc atatggtttg tattggtgat660gaaggttttg gtttgaacac tgattctgat ggttcttacc cataccaatt tgctgaaggt720ttgaacttta ctatgaactt gggtattgat actattgatt ttgctacttt gcatttgtac780ccagattctt ggggtacttc tgatgattgg ggtaacggtt ggatttctgc tcatggtgct840gcttgtaagg ctgctggtaa gccatgtttg ttggaagaat acggtgttac ttctaaccat900tgttctgttg aatctccatg gcaacaaact gctttgaaca ctactggtgt ttctgctgat960ttgttttggc aatacggtga tgatttgtct actggtgaat ctccagatga tggtaacact1020atttactacg gtacttctga ttacgaatgt ttggttactg atcatgttgc tgctattgat1080tctgcttaa1089
權(quán)利要求
1.β-甘露聚糖酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且對(duì)甘露聚糖具有降解作用的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β-甘露聚糖酶，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述β-甘露聚糖酶的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；3)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2和SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №2或SEQ ID №3的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌。
6.表達(dá)權(quán)利要求1所述β-甘露聚糖酶的工程菌，是將含有所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列的畢赤酵母表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母中得到的；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列在畢赤酵母表達(dá)載體中位于α因子序列的下游；所述β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列為序列表中的SEQ ID №4或SEQ ID №5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于用于構(gòu)建所述含有β-甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列的畢赤酵母表達(dá)載體的出發(fā)載體為pPICzαA、pPICZA或pPIC9K；以pPICzαA為出發(fā)載體構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體為pPIC-Mann。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的工程菌，其特征在于用于構(gòu)建表達(dá)所述β-甘露聚糖酶的工程菌的出發(fā)菌株為畢赤酵母X-33或GS115；以畢赤酵母X-33為出發(fā)菌株構(gòu)建的工程菌為X-33/pPIC-Mann。
9.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述β-甘露聚糖酶的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求6所述的表達(dá)β-甘露聚糖酶的工程菌，得到β-甘露聚糖酶。
10.權(quán)利要求1所述的β-甘露聚糖酶在制備動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β－甘露聚糖酶及其表達(dá)方法與專用工程菌。該酶是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID№1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且對(duì)甘露聚糖具有降解作用的蛋白質(zhì)。專用工程菌是將含有該β－甘露聚糖酶成熟蛋白編碼序列的畢赤酵母表達(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母中得到的。該工程菌實(shí)現(xiàn)了β－甘露聚糖酶的高效表達(dá)，且發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，提取成本低廉，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的β－甘露聚糖酶及其工程菌將在β－甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及動(dòng)物飼料添加劑的制備中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12R1/84GK1834237SQ200610073160
公開日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日
發(fā)明者李德發(fā), 陳小玲, 曹云鶴, 陸文清, 賴長(zhǎng)華, 樸香淑, 賀平麗, 喬家運(yùn) 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)