專利名稱：轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別是涉及轉(zhuǎn)基因-克隆技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因動物研究是人類按著自己的意愿有目的、有計劃、有根據(jù)、有預(yù)見地改變動物的遺傳組成，而改變其遺傳組成的目的是多種多樣的。比如遺傳學(xué)家希望通過改變動物的遺傳組成來觀察其表型變化，生理學(xué)家希望通過特定基因的表達(dá)來研究該基因?qū)C體生理狀況的影響。與動物生產(chǎn)有關(guān)的轉(zhuǎn)基因研究則希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來賦予動物新的表型性狀。該項研究在實驗技術(shù)上依賴分子生物學(xué)、動物胚胎和配子操作技術(shù)。
轉(zhuǎn)基因動物的制作方法目前主要有原核期胚胎的顯微注射，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育早期的動物胚胎，精子載體法，ES細(xì)胞技術(shù)，PGCs技術(shù)，體細(xì)胞核移植技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染MII期的卵母細(xì)胞，精子頭與DNA合并注射卵母細(xì)胞法。這些方法上的改進與提高大大地促進了轉(zhuǎn)基因動物研究由實驗室向生產(chǎn)實踐轉(zhuǎn)化的進程。
其中最傳統(tǒng)和最常用的方法是原核期胚胎的顯微注射，該方法由美國人Gordon發(fā)明，是目前應(yīng)用比較廣泛、效果比較穩(wěn)定的制作轉(zhuǎn)基因動物的方法之一。即在顯微操作儀下通過一毛細(xì)玻璃管將外源DNA注射進動物受精卵細(xì)胞的原核內(nèi)，再將該受精卵細(xì)胞移植進受體細(xì)胞子宮內(nèi)，在受精卵分裂時，外源DNA可能整合入宿主染色體組，待該受精卵發(fā)育成熟即可獲得轉(zhuǎn)基因動物。但是顯微注射法獲得的轉(zhuǎn)基因家畜的效率極低，特別是牛，羊和豬等，往往低于1％，這將大大增加制作轉(zhuǎn)基因家畜的成本。
隨著體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展，基因操作技術(shù)與克隆技術(shù)相結(jié)合是將成為轉(zhuǎn)基因動物，特別是大家畜生產(chǎn)的主要方式。目前，取得的主要進展是轉(zhuǎn)基因技術(shù)和靶位操作技術(shù)在克隆動物上的應(yīng)用。首先，利用克隆進行轉(zhuǎn)基因是指在核移植前，先把目的基因和標(biāo)記基因的融合基因?qū)肱囵B(yǎng)的體細(xì)胞，再通過標(biāo)記基因的表現(xiàn)來篩選轉(zhuǎn)基因的陽性細(xì)胞及其克隆，然后再移植。1997年，英國PPL公司的科學(xué)家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯(lián)手通過體細(xì)胞核移植技術(shù)率先在世界上制作了轉(zhuǎn)基因綿羊。利用胎兒成纖維細(xì)胞系，經(jīng)過轉(zhuǎn)染之后，再克隆。利用克隆進行轉(zhuǎn)基因，一旦核移植成功，從理論上講，轉(zhuǎn)基因成功率為100％。原核注射的方法會使大量的非轉(zhuǎn)基因胚胎被懷孕，這是一種資源浪費，而利用克隆進行轉(zhuǎn)基因技術(shù)不會造成代理母親去懷孕非轉(zhuǎn)基因動物。此外，利用克隆進行轉(zhuǎn)基因時，轉(zhuǎn)基因動物的性別會被提前決定。這樣的話，如果想得到能在乳腺中表達(dá)蛋白質(zhì)，就可以使克隆的轉(zhuǎn)基因動物全是雌性動物。
由于動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)能按照人們的意愿改變動物的生產(chǎn)性狀，得到人們所需要的產(chǎn)品，特別是一些蛋白藥品及保健品，科學(xué)家們已經(jīng)開始將動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用到實踐當(dāng)中，目前動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有以下一些應(yīng)用(1)、促進動物生長、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)，(2)、動物抗病育種，(3)建立診斷和治療人類疾病的動物模型，(4)生產(chǎn)藥用蛋白。
動物乳腺生物反應(yīng)器是一種利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在乳腺細(xì)胞中表達(dá)多肽藥物、工業(yè)酶、疫苗和抗體等蛋白的技術(shù)。通過基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我們進一步研究乳腺癌的機制，提高乳汁的營養(yǎng)成分，甚至可以合成藥物。該技術(shù)具有低投入高產(chǎn)出的特點，其效率是利用以大腸桿菌和動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一百倍，是一種非常有潛力的高新技術(shù)。1987年，Simons等人在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中首次成功地表達(dá)羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶樣中的蛋白含量高達(dá)23克/升，大約是動物細(xì)胞表達(dá)蛋白的400倍以上。該技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就得到迅猛的發(fā)展。目前，牛乳白蛋白基因人組織血纖維蛋白溶酶原因子，人生長激素基因，人體抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干擾素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表達(dá)。許許多多的著名科學(xué)家都認(rèn)為這將是畜牧業(yè)前所未有的革命，可能會給社會帶來巨大的經(jīng)濟效益。
溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)，是天然非特異性免疫物質(zhì)，具有強力殺菌作用。人溶菌酶(hLY)屬于c型溶菌酶(Isabelle，1990)，具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)及一定的抗腫瘤作用，有潛在的臨床應(yīng)用價值。人溶菌酶是一種由18種130個氨基酸組成的堿性多肽，分子量為14.7KD，等電點為pH11。
溶菌酶以溶解革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁而具有溶菌作用。原因在于它能水解細(xì)菌細(xì)胞壁粘多糖(polypeptidoglycan)N-乙酰葡萄糖胺(NAG)與N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)之間(NAM4-O-NAG5 glycosidic bond)的β-1.4糖苷鍵。隨著細(xì)胞壁的弱化，細(xì)菌會因為內(nèi)部壓力的作用崩裂而死。Pellegrini等人的結(jié)果顯示溶菌酶抑菌作用不僅僅與它的胞壁質(zhì)酶有關(guān)，而且還與其陽離子和疏水的特性有關(guān)。實驗證明，最適小分子底物與酶結(jié)合時，正好與酶分子中的長形凹穴嵌合，酶活性中心由三級結(jié)構(gòu)相距較近的Asp53和Glu35氨基酸殘基組成。
溶菌酶的作用1)抗菌消炎，溶菌酶是能水解粘多糖的堿性水解酶，而粘多糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一，其能直接水解革蘭陽性菌，在免疫蛋白A、補體的參與下，還能水解革蘭陰性菌。此外，它還會與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合，使其失活，并能夠增強抗生素和其它藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達(dá)到消炎、修復(fù)組織的目的。2)抗病毒作用，溶菌酶能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白作用，與DNA，RNA，脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。近來，一些結(jié)果顯示來源雞蛋清，人乳核和人中性粒細(xì)胞的溶菌酶具有抑制HIV-1生長的活性。3)增強免疫力，溶菌酶作為機體非特異免疫因子之一，參與機體多種免疫反應(yīng)，在機體正常防御功能和非特異免疫中，具有保持生理平衡的重要作用，可以改善和增強巨噬細(xì)胞的吞噬和消化能力，激活白細(xì)胞的的吞噬功能，并能改善細(xì)胞抑制劑所導(dǎo)致的白細(xì)胞減少，受到病原微生物的侵害時，其發(fā)揮抗感染作用，是一種非常重要的非特性免疫物質(zhì)。4)其還具有激活血小板的功能可以改善組織的局部血液循環(huán)障礙，分解膿液、增強局部防衛(wèi)功能，從而體現(xiàn)止血、消腫等作用。還可以作為一種抵抗因子，對組織局部起保護作用。
溶菌酶的應(yīng)用1)溶菌酶作為防腐劑。它本身是一種天然蛋白質(zhì)，無毒性，是一種安全性高的食品添加劑。同時溶菌酶僅能作用于目的微生物的細(xì)胞壁，而不能作用于其它物質(zhì)。2)溶菌酶在醫(yī)學(xué)上和應(yīng)用。A.五官科的應(yīng)用溶菌酶適用于五官科各種炎癥。研究表明它對眼、耳、鼻、喉和口腔等的急、慢性炎癥均有一定療效，特別對急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯。若在牙膏、漱口水、口潔劑、口香糖中設(shè)法添加一定量的溶菌酶，則可以殺死這些病菌，達(dá)到防止蟲牙的目的。同樣，可用溶菌酶來制眼藥水、潤喉液。B.皮膚科的應(yīng)用溶菌酶可以用于治療扁平疣、傳染性軟疣、尋常性疣、尖銳濕疣、帶狀皰疹等多種皮膚病。對于帶狀皰疹，內(nèi)服溶菌酶即可。而對于扁平疣和傳染性軟疣等的治療，最好采取內(nèi)服溶菌酶和5-氟脲嘧啶人溶液外涂，療效明顯提高。C.其他方面的應(yīng)用溶菌酶可用于小兒和乳兒哮喘性支氣管炎、呼吸道內(nèi)膜腫脹等，它可使粘膜腫脹很快消除，使痰液變稀，呼吸道通暢。溶菌酶可以預(yù)防和治療病毒性肝炎，尤其對輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機體內(nèi)，它還有抗流感病毒和腺病毒的生長，并能防止皰疹病毒感染。此外，對肉瘤引起的疼痛、久治不愈的小兒腹瀉及Sjogren’s病，均有一定療效。D.人體溶菌酶的濃度還可以作為多種疾病診斷指標(biāo)。3)食品、飲料中的應(yīng)用。溶菌酶集藥理、保健和防腐三個功能于一體。做為一種天然蛋白質(zhì)無任何副作用。溶菌酶的加入，補充了人體內(nèi)的非特異性免疫因子，殺死腸道內(nèi)的腐敗球菌，維持腸道內(nèi)菌群正?；龠M雙歧桿菌增殖，加強白清滅菌蛋白，Y-球蛋的防御因子，增強抗感染力。加入飲料中，如鈣奶、乳酸飲料中，也可起到防蛀牙、爽口的作用。特別是母乳化奶粉，對嬰幼兒的成長十分重要。牛奶中的溶菌酶含量極少，而母乳中的溶菌酶含量十分豐富。為彌補奶粉的不足，可以向其中添加適量溶菌酶，制成母乳化能奶粉。溶菌酶的加入，可以加強嬰幼兒的抗感染能力。4)制備細(xì)胞浸提物。酵母膏藥發(fā)酵工業(yè)中用量最多的一類培養(yǎng)基成分。它的制備目前大多是采用酵母自溶法或酵解、酵母的辦法制成的。如果改用溶菌酶制備酵母膏，則不僅可以提高浸膏量的收率，還可以大大縮短酵母膏的制備時間。也可以用溶菌酶從酵母細(xì)胞中制備呈味物質(zhì)，如有些溶菌酶中除了含有溶菌酶活性外，還含有能分解酵母細(xì)胞中的核酸為肌苷酸和鳥苷酸的單核酸類的呈味物質(zhì)。5)科學(xué)研究中的應(yīng)用。由于溶菌酶具有能夠?qū)Ｒ恍缘胤纸饧?xì)胞壁的能力，除了在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用外，溶菌酶更廣泛的應(yīng)用于科學(xué)研究中。如用溶菌酶專一性地水解細(xì)胞壁的特點，了解微生物細(xì)胞壁的構(gòu)造；分解細(xì)胞壁后制備原生質(zhì)體，而用于微生物育種以及微生物分類等學(xué)術(shù)研究和專用試劑學(xué)。
不同來源的溶菌酶，其溶菌譜各不相同。雞蛋清溶菌酶只對革蘭氏陽性菌有溶菌作用。在這些溶菌酶中，人體中的溶菌酶活性最高，其次是雞蛋白中的溶菌酶，最低的是牛乳中的溶菌酶。人溶菌酶具有生物相容性好，對組織無刺激、無毒性的優(yōu)點。商業(yè)化的人溶菌酶可以從乳汁、中性粒細(xì)胞和尿液中提取，然而這種資源畢竟非常有限，所以人們開始研究利用重組技術(shù)來生產(chǎn)人溶菌酶。這個過程主要經(jīng)歷了三個階段。第一個階段，最初，利用酵母和米曲霉實驗來表達(dá)溶菌酶。1986年，Jigmi等人利用酵母進行人溶菌酶表達(dá)，但這種重組蛋白不具有抑菌活性。接下來，Castanon和Yoshimura也作了相似的工作，也沒有取得重要突破。1990年，Archer等人用米曲霉表達(dá)雞蛋清溶菌酶，表達(dá)量為12mg/l。Tsuchiya等人在米曲霉里表達(dá)人溶菌酶，表達(dá)量為1.2mg/l，遺憾的是同樣沒有生物學(xué)活性。由此可見，在酵母和米曲霉里表達(dá)的溶菌酶不具有生物活性。第二個階段，利用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人溶菌酶。Maga在這方面作了大量工作，1994年Maga等人進行了轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)人溶菌酶的研究，他們利用alpha sl-casein啟動子來誘導(dǎo)溶菌酶的表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺組織檢測人溶菌酶mRNA的存在。溶菌酶的表達(dá)量估計為0.2g/L到0.7g/L，由于溶菌酶的表達(dá)，乳汁的物理和功能特性也發(fā)生了改變。1998年，Maga等人的研究結(jié)果進一步表明轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人溶菌酶的奶樣具有同標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶相同的活性。這些結(jié)果暗示著溶菌酶的轉(zhuǎn)基因研究在乳品加工業(yè)有著巨大的應(yīng)用前景。2000年，Akinbi等人為了在體內(nèi)檢測溶菌酶在呼吸系統(tǒng)的作用，他們制備了在呼吸道上皮細(xì)胞表達(dá)大鼠溶菌酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種轉(zhuǎn)基因小鼠能提高在肺部對細(xì)菌的殺傷能力5-30倍。由此可見，利用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)具有生物活性的溶菌酶的方法是可行的，并且有著巨大的潛在應(yīng)用前景。第三個階段，近年來，人們開始利用植物實驗體系表達(dá)溶菌酶，在這方面已取得了很大進展。1997年，Nakajima等人的研究結(jié)果表明低水平的溶菌酶也可以在煙草葉表達(dá)，并且可以提高植物抗真菌和細(xì)菌的活性。2000年，Takaichi和Oeda利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)也成功地在胡蘿卜根中表達(dá)了人溶菌酶。Ahreholta等人將T4溶菌酶基因轉(zhuǎn)移到馬鈴薯里。發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的根部上皮細(xì)胞可以表達(dá)T4溶菌酶并釋放根表面的薄膜層。T4溶菌酶具有活性，可以殺死細(xì)菌。而且，這種殺菌能力不依賴于植物的年齡和生長環(huán)境。2002年，一個密碼子優(yōu)化的人工合成的溶菌酶基因通過基因槍轉(zhuǎn)到水稻愈傷組織，重組的溶菌酶可以在水稻懸浮細(xì)胞里表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到大約可溶性蛋白的4％。實驗結(jié)果表明Ramy3D信號肽可以被正常剪切，并且具有和人溶菌酶同樣的生物活性。以上研究結(jié)果顯示利用植物表達(dá)具有生物活性的溶菌酶是可行的。可以想象，含有人溶菌酶的水果和食物一定會人們的生活帶來福音。
從上述對人溶菌酶轉(zhuǎn)基因的研究表明，還沒有見到人溶菌酶在大型牲畜方面的轉(zhuǎn)基因克隆報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術(shù)領(lǐng)域的空白，將轉(zhuǎn)基因、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和克隆技術(shù)相結(jié)合，提供一種轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的生產(chǎn)方法，以實現(xiàn)“牛奶人乳化”。
本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的生產(chǎn)方法，其操作步驟如下(1)構(gòu)建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建人溶菌酶乳腺特異表達(dá)載體與雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，將串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA導(dǎo)入家畜體細(xì)胞核內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)有人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆動物。
所述的一種轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜生產(chǎn)方法，所述乳腺特異表達(dá)載體為pBC2-sigHLY，所述的pBC2為在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp所構(gòu)建的骨架載體。
所述的sigHLY由牛beta-casein信號肽序列，人溶菌酶的1-4外顯子和1-3內(nèi)含子組成。
所述的導(dǎo)入方法為電穿孔轉(zhuǎn)染法。
所述的雙標(biāo)記選擇載體以增強型綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因為標(biāo)記選擇基因。
所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA為pBC2-sigHLY-EGFP-NEO。
所述的單標(biāo)記選擇載體以新霉素抗性基因為標(biāo)記選擇基因。
所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA為pBC2-sigHLY-NEO。
所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
所述大型家畜為牛。
為了制備高效表達(dá)人溶菌酶的奶牛乳腺生物反應(yīng)器以生產(chǎn)重組人溶菌酶，本實驗室首先建立了乳腺高效表達(dá)人溶菌酶的小鼠模型，構(gòu)建了pBC1-HLY和pBC2-sigHLY四種不同的溶菌酶基因表達(dá)載體。利用顯微注射方法注射原核期小鼠胚胎制備轉(zhuǎn)基因小鼠。
pBC1-HLY溶菌酶表達(dá)載體包含溶菌酶基因的編碼序列(含溶菌酶信號肽)、山羊beta-casein啟動子、終止子及其部分不編碼的外顯子和內(nèi)含子。經(jīng)顯微注射共獲得6只為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，經(jīng)Western Blotting檢測，在3只存活轉(zhuǎn)基因陽性母鼠的乳汁中，可以檢測到重組人溶菌酶的表達(dá)。其中6號轉(zhuǎn)基因小鼠的溶菌酶表達(dá)量達(dá)到0.2mg/ml，34號的表達(dá)量為0.12mg/ml，41號沒有檢測到重組溶菌酶的表達(dá)。經(jīng)溶菌實驗檢測及對重組溶菌酶比活力的計算，重組溶菌酶具有同人溶菌酶相似的比活力。
pBC2-sigHLY溶菌酶表達(dá)載體包含溶菌酶基因的編碼序列(含牛beta-casein信號肽)，而pBC2是在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所構(gòu)建的載體。將pBC2-sigHLY載體進行小鼠原核胚的顯微注射獲得轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，三只陽性小鼠乳汁中有兩只能檢測到重組人溶菌酶的高效表達(dá)，分別為2mg/ml和0.5mg/ml；經(jīng)溶菌實驗檢測，表明重組人溶菌酶具有溶菌活性，其中61號小鼠的酶活性為2160U/ml、63號948U/ml，陰性小鼠的酶濃度為25.98U/ml，人的為1224U/ml。與陰性小鼠相比，61號轉(zhuǎn)基因小鼠乳清的溶菌酶活性提高了83倍，63號提高了36倍。與人奶相比，61號小鼠奶的酶活性提高了近一倍，而63號也比較接近人奶的溶菌酶活性。表明我們構(gòu)建的pBC2-sigHLY表達(dá)載體能在動物乳腺中高效表達(dá)有溶菌活性的重組人溶菌酶。而且pBC2-sigHLY表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因小鼠奶中人溶菌酶的表達(dá)量及活性明顯高于我們構(gòu)建的含自身信號肽序列的人溶菌酶表達(dá)載體pBC1-HLY(＜0.2mg/ml和480U/ml)。
本發(fā)明探索和完善了轉(zhuǎn)基因技術(shù)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)攜帶外源功能基因(包括山羊beta-酪蛋白5’和3’調(diào)控元件，目的基因的編碼區(qū))的轉(zhuǎn)基因動物的途徑，并極大提高了轉(zhuǎn)基因動物，特別是轉(zhuǎn)基因大家畜的制作效率，本發(fā)明所使用的技術(shù)路線適用于轉(zhuǎn)基因牛、山羊、綿羊、豬和兔的基礎(chǔ)群生產(chǎn)和擴繁。
溶菌酶集藥理、保健和防腐三個功能于一體，做為一種天然蛋白質(zhì)無任何副作用。而人乳中溶菌酶破壞和溶解細(xì)菌的比活力約為牛乳的300倍，是人乳中的重要抗菌因子，因此人溶菌酶被認(rèn)為是一種具有極高開發(fā)價值的保健蛋白和藥用蛋白。目前商業(yè)化的人溶菌酶主要從人乳汁、中性粒細(xì)胞和尿液等中提取，然而這種資源畢竟非常有限，所以我們利用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因牛，從而通過高產(chǎn)奶牛的乳腺大量生產(chǎn)具有活性的人溶菌酶，既可開發(fā)出具有高附加值的保健牛奶，也可純化出人溶菌酶并開發(fā)成藥品和保健品。本發(fā)明所研究的重組人溶菌酶，具有與天然人溶菌酶相同的生物活性；含有重組人溶菌酶的牛奶可以開發(fā)成保健牛奶及奶制品；純化的重組人溶菌酶可以開發(fā)成防腐劑、食品添加劑、保健品和藥品。


圖1溶菌酶基因表達(dá)載體pBC1-HLY的物理圖譜其中Pcasein為pBC1上的山羊beta-casein啟動子，Casein E1-E2為山羊beta-casein非編碼的第1，2外顯子，Casein E7-E8-E9為山羊beta-casein非編碼的第7，8及9外顯子，Casein3`genome DNA為山羊beta-casein 3’端調(diào)控序列。
圖2pBC1-HLY轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的PCR檢測0非轉(zhuǎn)基因小鼠基因組，+人的基因組；6、30、34、41、48、50分別為PCR檢測的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠圖3pBC1-HLY轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的Southern blot檢測0非轉(zhuǎn)基因小鼠基因組，6、30、34、41、48、50分別為PCR檢測的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，陽性對照包括3條帶(10、5、1)，分別相當(dāng)于基因組的10、5、1拷貝。
圖4pBC1-HLY轉(zhuǎn)基因母鼠乳汁的Western Blot檢測41，34，6為轉(zhuǎn)基因母鼠奶樣，human為人奶對照，CK為陽性對照。
圖5人溶菌酶基因編碼區(qū)的PCR擴增.
M為1kb DNA marker，1為hly的PCR產(chǎn)物圖6利用XhoI和KpnI對p7zf-sigHLY11進行酶切鑒定M為1kb DNA marker，11為p7zf-sigHLY11質(zhì)粒DNA，KpnI為p7zf-sigHLY11被KpnI酶切結(jié)果，XhoI為p7zf-sigHLY11被KpnI酶切結(jié)果。
圖7利用XhoI酶切對pBC2-sigHLY13進行鑒定M為1kb DNA marker，13為pBC-sigHLY13質(zhì)粒DNA，BC1為pBC1質(zhì)粒DNA，XhoI為XhoI酶切pBC-sigHLY13結(jié)果。
圖8pBC2-sighLY13方向鑒定M為1kb DNA marker，13為pBC-sigHLY13質(zhì)粒DNA，CalI為CalI酶切pBC2-sigHLY13結(jié)果，KpnI為KpnI酶切pBC2-sigHLY13結(jié)果。
圖9溶菌酶表達(dá)載體pBC2-sigHLY的物理圖譜其中Pcasein為pBC2上的山羊beta-casein啟動子，Casein E1-E2為山羊beta-casein非編碼的第1，2外顯子，Casein E7-E8-E9為山羊beta-casein非編碼的第7，8及9外顯子，Casein3`genome DNA為山羊beta-casein 3’端調(diào)控序列。
圖10pBC2-sigHLY轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的PCR檢測M為1kb DNA marker，0為陰性對照，h為陽性對照，6，12，43，61和63為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。
圖11pBC2-sigHLY轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的Southern blot檢測M為1kb DNA marker，0為陰性對照，h為陽性對照，6，12，43，61和63為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，1，3，5分別為陽性對照的1，3和5個拷貝。
圖12pBC2-sigHLY轉(zhuǎn)基因陽性母鼠乳汁的Western Blot檢測CK為陰性小鼠奶樣，12，61和63為轉(zhuǎn)基因小鼠奶樣，human為人乳對照。
圖13雙標(biāo)記選擇載體pEGFP-NEO的結(jié)構(gòu)圖EGFP為增強綠色熒光蛋白基因，NEO為新霉素抗性基因，IRES為核糖體結(jié)合位點，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，CMV-IE Enhancer為CMV-IE增強子，pEF321為EF321啟動子圖14單標(biāo)記選擇載體pNEO的結(jié)構(gòu)圖NEO為新霉素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，pPGK為PGK啟動子，Amp為氨芐抗性基因圖15pBC2-sigHLY-EGFP-NEO酶切后的線性圖譜b-casein promoter為pBC1上的山羊beta-casein啟動子，human lysozyme gene為人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP為增強綠色熒光蛋白基因，Neomycin為新霉素抗性基因圖16pBC2-sigHLY-NEO酶切后的線性圖譜b-casein promoter為pBC2上的山羊beta-casein啟動子，human lysozyme gene為人溶菌酶基因(含牛b-casein序列)，GFP為增強綠色熒光蛋白基因，Neomycin為新霉素抗性基因圖17HLY引物的擴增結(jié)果.
M1kb ladder；1盼娃；2金娃；3陽性對照；4陰性對照；5blank圖18hLY引物的擴增結(jié)果.
M1kb ladder；1329號牛；20365號牛；3為020613，4陽性對照；5陰性對照；6blank圖19NEO引物的擴增結(jié)果.
M1kb ladder；1盼娃；2金娃；3陽性對照；4陰性對照；5blank圖20NEO引物的擴增結(jié)果M1kb ladder；1陰性對照；2329號牛；30365號牛；4為020613，5陽性對照圖21EGFP引物的擴增結(jié)果.
M1kb ladder；1329號牛；20365號牛；3為020613，4陽性對照；5陰性對照；6blank圖22pBC2引物擴增結(jié)果
泳道1，4為普通克隆?；蚪MDNA，泳道2，3分別為轉(zhuǎn)pBC2-sigHLY基因克隆?；蚪MDNA，泳道5為pBC2-sigHLY-NEO(在pBC上有缺失)質(zhì)粒DNA，泳道6為pBC2-sigHLY轉(zhuǎn)基因小鼠DNA，泳道7為完整pBC1，泳道8為非克隆牛DNA，泳道9為空白對照。
圖23HLY轉(zhuǎn)基因克隆牛的Southern結(jié)果泳道1為盼娃，泳道2為金娃，泳道3-5為陰性對照，泳道6-8分別為1，2和5個拷貝的陽性對照.
圖24hLY轉(zhuǎn)基因克隆牛乳樣PAGE結(jié)果，泳道1蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品，泳道3為人乳，泳道4-7分別為金娃、盼娃、329及0365。
圖25HLY轉(zhuǎn)基因克隆牛乳樣Southern雜交結(jié)果，泳道1為人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品，泳道2為人乳，泳道3-6分別為金娃、盼娃、329及0365。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進步的詳細(xì)說明。
實施例1實驗材料1.1質(zhì)粒及菌株宿主菌大腸桿菌DH5α和DH10B，pBC1 milk expression vector kit和PCR-XL-TOPO vector購自Invitrogen公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO購自Clontech公司，pGEM-7zf購自Promega公司，BAC RP11-1143G9購于美國基因公司1.2實驗動物Holstein奶牛約3月齡的胎兒取自屠宰場，黃牛卵巢來自北京周邊地區(qū)屠宰場。
1.3主要試劑DMEM/F12粉末、DMEM粉末培養(yǎng)基、臺盼藍(lán)(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；dNTP以及PCR引物購于上海生物工程公司；Taq酶購于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗室；內(nèi)切酶SspI和BamHI為華美生物工程公司產(chǎn)品；IPTG、X-gal、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)均購自華美生物公司；飽和酚為鼎國生物工程公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明質(zhì)酸酶，HEPES，無脂肪酸BSA，細(xì)胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸鈉，肝素鈉，礦物油和其它無機鹽均為Sigma公司產(chǎn)品。
1.4培養(yǎng)基的配制SOB培養(yǎng)基配置每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水加入蛋白胨20g酵母提取物5g NaCl0.5g.搖動容器室溶質(zhì)完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)到pH7.0。滅菌LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶于800ml水中，調(diào)節(jié)PH值至7.5，定容制1000ml，高壓滅菌。
LB固體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCL10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，調(diào)節(jié)pH值至7.5，定容至1000ml，高壓滅菌。
1.5試劑的配制DMEM培養(yǎng)液DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，鏈霉素100mg，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。使用時加10％的血清。
0.1％Trypsin/EDTA酶消化液Trypsin0.1g，KCl 0.04g，NaHCO3，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用滅菌的Mill-Q超純水溶解，定容至100ml，用0.2μm濾膜過濾滅菌，-20℃保存。DPBS液DPBS粉末9.7g，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.2，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。
無鈣鎂PBS溶液KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO412H2O 2.88g，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。Gimsa母液Gimsa粉末0.5g，加少量甘油將Gimsa粉末在研缽中充分研磨。再加入甘油至總量為22ml，56℃保溫2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色試劑瓶中，備用。
細(xì)胞裂解液10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。
蛋白酶K貯存液蛋白酶K100mg，溶于5mL滅菌水中，分裝，-20度保存。
TBS液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高壓滅菌。
G418貯液1g G418溶于1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，過濾滅菌，-20度保存。
兩倍電擊緩沖液(2×HeBS)280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，過濾滅菌，1mL分裝，-20度保存。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1gTris堿溶于800ml水中，用HCl調(diào)PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5Mol/L EDTA(pH8.0)126.1g乙二胺四乙酸二鈉加入到800ml水中，用NaOH調(diào)PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
RNase溶液將RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。
TE緩沖液10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高壓滅菌。5mol/L LiCl30.2g氯化鋰二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高壓滅菌。50×TAE242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。氨芐青霉素(Amp)貯存液將氨芐青霉素鈉溶于滅菌水后用0.22μm的濾器過濾除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g無水乙酸鈉溶于80ml水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，定容至100ml，高壓滅菌。
1mol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2·6H2O，過濾除菌，分裝成10ml每份，貯存于-20℃，制備感受態(tài)時取出一份稀釋至100ml，過濾除菌，預(yù)冷備用。
溴化乙錠貯存液在100ml水中加入1g溴化乙錠，溶解后于4℃棕色瓶內(nèi)保存。
DNA提取抽提緩沖液50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/L NaCl，1％SDS。
2×Cracking buffer0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。
酚∶仿(1∶1)等體積苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。
蛋白酶K溶液用水配成20mg/ml，-20℃保存。
TCM199培養(yǎng)液稱TCM199粉末9.9g，NaHCO32.2g，丙酮酸鈉0.1375g，EDTA 0.372g，用1L超純水定容，PH7.2-7.4，正壓過濾滅菌，4℃保存。培養(yǎng)用工作液中加入10％FCS。
操作液H199在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。
沖卵液DPBS溶液中加入10％FCS。
透明質(zhì)酸酶透明質(zhì)酸酶0.2g，溶于10ml無鈣DPBS溶液中，過濾滅菌，-20℃貯存。
工作液用沖卵液稀釋10倍。
融合液0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2，0.5mMHEPES，0.05％BSA，調(diào)PH至7.2-7.4，過濾滅菌。
成熟培養(yǎng)液M199培養(yǎng)液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，1ug/ml estradiol，100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。
CRlaa培養(yǎng)液

將上述成份加入90ml ddH2O中，待所有試劑徹底溶解后，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。調(diào)整pH為7.4，用ddH2O加到100ml，滲透壓為265-285mOsm之間。過濾滅菌。
1.6主要儀器設(shè)備1)CO2培養(yǎng)箱美國Forma Scientific Inc.
2)倒置顯微鏡和熒光顯微鏡日本Nikon公司3)培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管和細(xì)胞凍存管Nunc公司4)電擊儀美國BTX公司(ECM 2001)5)電泳儀DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠
6)超凈工作臺北京凈化設(shè)備廠7)-80℃超低溫冰箱日本SANYO公司8)制冰機日本SANYO公司9)超純水儀美國MILLIPORE公司10)低溫離心機Eppendorf公司11)高速冷凍離心機BECKMAN公司12)凝膠成像系統(tǒng)ALPHAINNOTECH公司13)PHS-3C酸度計上海虹益儀器廠14)自動滅菌鍋日本SANYO公司15)測序儀ABI 377型DNA sequencer，美國PERKIN ELMER公司16)恒溫水浴儀美國LIFESCIENCE公司17)9700型PCR儀美國PERKIN ELMER公司18)ABI 377DNA測序儀美國PERKIN ELMER公司1.7分析工具軟件及網(wǎng)址同源性分析軟件DNAMANPCR引物設(shè)計軟件Oligo4.0DNA序列分析軟件ChromasDNA及蛋白序列數(shù)據(jù)庫NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein2實驗方法2.1載體構(gòu)建2.1.1pBC1-HLY表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立1)pBC1-HLY表達(dá)載體的構(gòu)建策略首先利用長片段PCR的方法獲得溶菌酶基因的編碼區(qū)，將其克隆到PCR-XL-TOPOvector上，并進行酶切和測序驗證。然后再把它連接到乳腺特異表達(dá)載體pBC1上，經(jīng)插入方向和測序鑒定，最后得到溶菌酶的表達(dá)載體。
2)人溶菌酶基因編碼區(qū)的PCR擴增溶菌酶基因全長6807bp，含有4個外顯子。mRNA(519-682，2246-2410，4349-4427，5281-6374)和CDS(601-682，2246-2410，4349-4427，5281-5347)，起始密碼子位于547位點，TATA box位于491-496位置。為了得到溶菌酶編碼區(qū)片段，我們以溶菌酶基因組DNA序列為模版設(shè)計引物進行DNA擴增。設(shè)計的引物為上游5`CCC TCG AGA CTC TGACCT AGC AGT CAA C 3`，下游5`CCG CTC GAG TCT GTT TCT ATC ATT TGG 3`，5`端分別含有XhoI酶切位點。擴增產(chǎn)物全長5652bp，包含溶菌酶基因信號肽部分的DNA片段。PCR條件94℃3min，94℃1min，60℃1min，68℃5min，68℃10min，4℃1h；30cycles.PCR擴增出1條約5.5kb的特異片段，于是我們把這個PCR產(chǎn)物回收回來，克隆到pPCR-XL-TOPO載體上。
3)人溶菌酶基因編碼區(qū)DNA片段的克隆為了對PCR產(chǎn)物進行測序和驗證，我們首先把它克隆到PCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-HLY重組載體。經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，進行培養(yǎng)，最后提取質(zhì)粒。對獲得的陽性重組質(zhì)粒進行酶切及測序鑒定。
4)pBC1-HLY expression vector的構(gòu)建本發(fā)明采用pBC1作為構(gòu)建乳腺表達(dá)載體的骨架載體，pBC1為Invotrogen公司的商業(yè)化乳腺表達(dá)載體，全長為21628bp，包含山羊beta-casein啟動子，外顯子1、2和7、8、9的非編碼區(qū)，beta-casein 3`中止子區(qū)和2拷貝的beta-globin隔離子，以及原核序列。其中在山羊beta-casein的外顯子2和7之間存在一個XhoI限制性內(nèi)切酶位點，用于將外源基因的編碼區(qū)連接上去。
在構(gòu)建溶菌酶基因表達(dá)載體時，我們首先分別對pBC1和pTOPO-HLY進行XhoI酶切與回收，再按110的比例混勻于16℃過夜連接，再進行電轉(zhuǎn)化。挑單克隆菌落進行搖菌提取質(zhì)粒，篩選重組質(zhì)粒pBC-HLY陽性克隆。
5)酶切鑒定及PCR檢測XhoI酶切pBC1-HLY陽性質(zhì)粒，結(jié)果顯示可以切出一條5kb外源片段和21kb的pBC1的骨架片段，表明重組質(zhì)粒的XhoI位點已連入5kb外源片段。
為進一步驗證，我們以溶菌酶基因序列為模板設(shè)計引物上游5`TTA TAC ACA CGG CTTTAC 3`下游5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`PCR條件94℃5min，94℃40sec，53℃40sec，72℃40sec，72℃7min，4℃1∞；30cycles。結(jié)果顯示以4號和12號質(zhì)粒為模板可以擴增到與以含人溶菌酶基因BAC為模板大小相同的DNA片段，表明人溶菌酶基因編碼區(qū)已經(jīng)連接到pBC1載體上6)方向鑒定由于上述連接屬于單酶切位點連接，所以必須進行插入片段的方向鑒定。我們選擇限制性內(nèi)切酶Drd進行方向鑒定，有一個Drd位點位于溶菌酶基因5`端(538)，同時在pBC1上也存在相應(yīng)酶切位點(2442、12109、12219、15035、17540、17953)。根據(jù)酶切產(chǎn)物的DNA片段大小，可以判斷外源片段的插入方向。
7)測序驗證為了保證該表達(dá)載體序列的正確性，我們又對pBC1-hLY陽性質(zhì)粒的外顯子1-4的部分進行測序，結(jié)果表明在PCR過程中，沒有造成溶菌酶基因外顯子部分序列的突變，連入pBC1的是完好的人溶菌酶基因基因組DNA。
8)pBC1-HLY轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及檢測(1)pBC1-HLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收與檢測pBC1-HLY expression vector的物理圖譜如圖1所示，本實驗用NotI和SalI雙酶切，除去質(zhì)粒的多余部分，用Qigen試劑盒回收約26kb大小的片段，溶于轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ肨E，調(diào)整DNA濃度為2μg/ml。
(2)顯微注射共注射受精卵1200枚，移植受體鼠70只，受孕鼠32只，共生小鼠83只(3)轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測取2-3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴組織樣，提取DNA。用前面已使用過的一對引物(上游5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`)分別對小鼠DNA樣PCR擴增，以普通小鼠基因組作為陰性對照，以人基因組作為陽性對照，如圖2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有6只小鼠為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，分別為6、30、34、41、48和50號。小鼠擴增出的PCR產(chǎn)物與陽性對照一致，咱們這些小鼠為攜帶有pBC1-hLY的轉(zhuǎn)基因小鼠(4)轉(zhuǎn)基因小鼠的Southern blot檢測將PCR檢測為陽性的6只小鼠尾巴組織樣DNA，取大約10μg用PstI內(nèi)切酶消化，低壓慢速電泳，轉(zhuǎn)膜后，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。以pBC1-HLY質(zhì)粒為陽性對照，以陰性小鼠基因組為陰性對照，雜交可得到5kb片段。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明6、30、34、41、48和50號轉(zhuǎn)基因小鼠均為陽性小鼠，與PCR檢測結(jié)果一致，而陰性小鼠的基因組(0)沒有雜交信號。根據(jù)Southern雜交信號強度，估算轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因整合的拷貝數(shù)。6、48號，3拷貝；30號，1拷貝；34、41號，2拷貝；50號，8拷貝。
(5)轉(zhuǎn)基因小鼠的Westernblot檢測在轉(zhuǎn)基因小鼠生仔鼠后的第5天，采集乳汁。將采集的乳汁進行4500rpm離心10min，去除乳脂。加入2倍體積滅菌水，調(diào)pH值至4.0左右去除酪蛋白，最后將pH值調(diào)到8.0，將乳清保存于-70℃冰箱。通過雜交的結(jié)果估算轉(zhuǎn)基因小鼠的溶菌酶的表達(dá)含量人乳汁溶菌酶的含量為0.5mg/ml，由此可以初步估測，6號乳清重組溶菌酶含量為0.2mg/ml；34號乳清重組溶菌酶含量為0.12mg/ml；41號沒有表達(dá)。(圖4)從圖中可看出34，6號小鼠奶樣可以檢測到重組人溶菌酶的表達(dá)，初步估測，6號乳清重組溶菌酶含量為0.2mg/ml；34號乳清重組溶菌酶含量為0.12mg/ml；41號沒有表達(dá)(6)、重組人溶菌酶的活性檢測a.溶菌酶對溶壁微球菌溶菌作用的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立配置標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶，濃度分別為50、75、100、125、150、175、200U/mL。取90ul細(xì)菌懸浮液置于比色皿中，加入酶液10ul，迅速用移液器吹勻，測定450nm下的光吸收值(OD450)。從加入酶液起計時，每隔1min記錄1次，每組數(shù)據(jù)要重復(fù)3次以上。以0至1分鐘的OD450的差值的平均值作為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)酶的濃度作為橫坐標(biāo)來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們可以得到回歸方程y＝0.0005x-0.002，y代表OD450的差值，x代表酶活力(U/ml)。由此公式可推導(dǎo)出x＝2000(y+0.002)。在乳清的制備過程中，被稀釋3倍，所以，乳清的酶活力計算公式為x＝2000(y+0.002)×3。
b.重組人溶菌酶的活性檢測根據(jù)上述方法，分別測定轉(zhuǎn)基因小鼠、人、陰性小鼠乳清對溶壁微球菌作用的OD450值變化，測定三次，取0至1分鐘的OD450差值。根據(jù)x＝2000(y+0.002)×3公式可以計算乳清中溶菌酶的濃度。轉(zhuǎn)基因小鼠6號的酶活力為480U/ml、34號301U/ml、41號37.98U/ml，陰性小鼠的酶活力為25.98U/ml，人的為1224U/ml。由此可見，與陰性小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠乳清的溶菌酶酶活力有非常明顯提高，其中6號小鼠提高了18倍，34號提高了11倍，但41號幾乎沒有提高。與人乳清相比，轉(zhuǎn)基因小鼠乳清中的溶菌酶酶活力度相對較低，其中6號占2/5，34號占1/4。由此可見，重組人溶菌酶的表達(dá)可以顯著提高小鼠乳汁中溶菌酶的活力，表明通過乳腺表達(dá)的重組人溶菌酶具有溶菌的生物學(xué)活性。
2.1.2pBC2-sigHLY表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立1).pBC2-sighLY表達(dá)載體的構(gòu)建策略為了構(gòu)建含有beta-casein信號肽DNA序列的溶菌酶表達(dá)載體，我們設(shè)計了如下構(gòu)建表達(dá)載體的策略。首先合成牛beta-casein信號肽DNA序列，5’和3’端分別含有XhoI和Csp45I，利用這兩個酶切位點連到pGEM-7zf質(zhì)粒上得到p7zf-sig質(zhì)粒。再利用長片段PCR方法擴增人溶菌酶基因的編碼區(qū)序列，5’端有Csp45I酶切位點，3’端依次有XhoI和HindIII兩個酶切位點。利用Csp45I和HindIII酶切位點連到p7zf-sig上得到p7zf-sigHLY質(zhì)粒。構(gòu)建pBC2載體，用XhoI將牛信號肽和溶菌酶編碼區(qū)融合序列切下來，連到pBC2的XhoI位點。
2).牛beta-casein信號肽的設(shè)計與合成為了獲得牛beta-casein信號肽，我們分別合成了兩條單鏈DNA序列。序列分別為正向5`TCGAGATGA AGGTCCTCAT CCTTGCCTGC CTGGTGGCTC TGGCCCTTGCAAAGGTCTT 3`，反向5`C GAAGACCTTT GCAAGGGCCA GAGCCACCAGGCAGGCAAGG ATGAGGACCT TCATC 3`。黑體劃線部分序列為牛beta-casein信號肽DNA序列。將兩條單鏈DNA退火成雙鏈后，5`端會形成XhoI酶切位點部分，3`端形成Csp45I酶切位點部分。將已合成的信號肽DNA溶解，終濃度達(dá)825ng/μl)。然后各取10μl混勻，沸水煮5分鐘進行變性，然后室溫冷卻進行退火，這樣就可以形成5`端和3`端分別包含XhoI和Csp45I部分酶切位點的牛beta-casein信號肽DNA3).牛beta-casein信號肽DNA的克隆我們利用牛beta-casein信號肽DNA上的XhoI和Csp45I部分酶切位點將其連接到pGEM-7zf載體上得到p7zf-sig重組質(zhì)粒。為了鑒定連上信號肽的重組質(zhì)粒，我們利用Kpn I進行酶切鑒定。由于在7zf質(zhì)粒XhoI和Csp45I之間連上信號肽DNA片段，原有的KpnI酶切位點被去掉。因此，p7zf-sig不能被KpnI切開，而pGEM-7zf可以被切開。同時，對其進行測序，再次證實信號肽序列已連到pGEM-7zf上，并完全正確。
4).溶菌酶基因編碼區(qū)(不含信號肽序列)的獲得為了獲得人溶菌酶基因的編碼區(qū)，我們利用探針從BAC庫調(diào)取含有溶菌酶基因的BAC克隆(BAC RP11-1143G9)。在含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，進行搖菌。然后按上述方法提取BAC，，濃度約為100ng/L。接下來，我們用BAC RP11-1143G9作為模板進行PCR擴增來獲得溶菌酶基因的編碼區(qū)序列片段。
為了得到溶菌酶編碼區(qū)(不含信號肽序列)片段，我們以溶菌酶基因組DNA序列為模版設(shè)計引物進行DNA擴增。設(shè)計的引物為上游5`ATT CGA AAG GTG TGA GTT GGCCAG AAC TCT G 3`，5`端分別含有Csp45I酶切位點，下游5`TAA GCT TCT CGA GACCAT CCT GGC TAA CAC G 3`，5`端包含Hind III和XhoI兩個酶切位點。擴增產(chǎn)物全長5255bp，不包含溶菌酶基因分泌肽部分的DNA片段。PCR條件94℃3min，94℃1min，60℃1min，68℃5min，68℃14min，4℃1∞；30cycles。再按上述的方法提取含有溶菌酶基因的BAC(RP11-1143G9)，以BAC為模板進行PCR擴增，PCR結(jié)果如下(圖5)。
5).PCR產(chǎn)物的克隆為了對PCR產(chǎn)物進行測序和驗證，我們首先把它克隆到pPCR-XL-TOPO vector上得到pTOPO-sigHLY重組載體。
6).p7zf-sighLY重組質(zhì)粒的獲得為了得到含有牛beta-casein信號肽DNA的溶菌酶基因編碼區(qū)，我們先利用Hind III和Csp45I將pTOPO-HLY重組載體上的溶菌酶基因編碼區(qū)(不含溶菌酶本身信號肽)切下來，連接到p7zf-sig質(zhì)粒上，從而得到牛beta-casein信號肽DNA和溶菌酶基因連在一起的重組質(zhì)粒p7zf-sigHLY。為了鑒定p7zf-sigHLY11為陽性重組質(zhì)粒，利用KpnI和XhoI分別進行酶切，由于在連接信號肽序列的過程中，KpnI酶切位點被去除，所以KpnI不能切開重組質(zhì)粒。而由于信號肽的5’端和溶菌酶編碼區(qū)3’端分別含有XhoI酶切位點，所以酶切可以得到3kb的7zf骨架片段和5kb的信號肽和溶菌酶編碼區(qū)片段。酶切結(jié)果如圖6所示，證實11號質(zhì)粒確實為陽性重組質(zhì)粒。
對p7zf-sighLY11進行測序，結(jié)果表明這個載體上包含牛beta-casein的信號肽序列和溶菌酶編碼區(qū)的部分序列，并且這些序列沒有發(fā)生任何突變。p7zf-sigHLY11質(zhì)粒測得序列的比對結(jié)果如圖24，該測序結(jié)果表明beta-casein的信號肽序列與hly序列成功連接7).pBC2-sighLY exprssion vector的構(gòu)建本發(fā)明采用pBC2作為構(gòu)建乳腺表達(dá)載體的骨架載體，pBC2是pBC1經(jīng)過修改所獲得的載體，即在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp(GAATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAG)所構(gòu)建的載體。這段序列位于pBC1中beta-casein啟動子區(qū)域，構(gòu)建pBC2的目的即是要檢測這段序列是否影響外源基因在哺乳動物乳腺中的表達(dá)。
pBC2構(gòu)建過程如下用ClaI和XhoI酶切pBC1質(zhì)粒DNA，回收4kb的片段，通過ClaI和XhoI酶切位點與pGEM-7zf進行連接獲得pGEM-CX1，通過EcoRI位點將缺失序列(pBC1L1AATTCATTTCCTAATCATGCAGATTTCTAGG，和pBC1 L2AATTCCTAGAAATCTGCATGATTA GGAAATG，兩序列退火形成雙鏈)與pGEM-CX1連接得到pGEM-CX2，用ClaI和XhoI酶切pGEM-CX2并回收4kb的片段，通過ClaI和XhoI酶切位點與pBC1進行連接即可獲得pBC2。
在構(gòu)建溶菌酶基因表達(dá)載體時，我們首先分別對pBC2和p7zf-sigHLY進行XhoI酶切與回收，再按1∶10的比例混勻于16℃過夜連接，再進行電轉(zhuǎn)化。挑單克隆菌落進行搖菌提取質(zhì)粒，篩選組質(zhì)粒的XhoI位點已連入約5kb外源片段(如圖7)。由于上述連接屬于單酶切位點連接，所以必須進行插入片段的方向鑒定。我們選擇限制性內(nèi)切酶KpnI和Csp45I與ClaI和Csp45I雙酶切進行方向鑒定，Csp45I在外源片段的5’端有1個酶切位點，在pBC2上，ClaI酶切位點位于4529bp，KpnI位于13772bp，在19kb的位置存在一個Csp45I酶切位點。根據(jù)酶切產(chǎn)物的DNA片段大小，可以判斷外源片段的插入方向。13號重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果如圖8，表明13號重組質(zhì)粒為正向型重組質(zhì)粒。
8).載體外顯子部位的測序為了保證所構(gòu)建溶菌酶基因表達(dá)載體的準(zhǔn)確性，我們要對載體的編碼區(qū)部位進行測序。因為前面已經(jīng)對外顯子1的部位完成了測序，所以這里主要對外顯子2、3、4進行測序。如圖25、26、27.綜合測序的結(jié)果，表明pBC2-sigHLY表達(dá)載體的外顯子序列沒有發(fā)生任何突變和錯配。這有利地保證了pBC2-sighLY表達(dá)載體能夠正確轉(zhuǎn)錄和翻譯。
載體外顯子2的測序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對如圖25，經(jīng)比對，外顯子2的序列與溶菌酶基因本身序列完全一致。也顯示內(nèi)含子2的序列沒有發(fā)生突變。
載體外顯子3的測序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對如圖26，經(jīng)比對，外顯子3的序列也沒有發(fā)生任何突變。上行為溶菌酶的基因序列，下行為外顯子3及其側(cè)翼序列。
外顯子4的測序結(jié)果及其與溶菌酶基因序列的比對如圖27，經(jīng)與溶菌酶基因序列比對，CDS4和外顯子4均沒有發(fā)生突變。
9)pBC2-sigHLY轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及檢測(1).pBC2-sigHLY expression vector的NotI和SalI酶切片段的回收與檢測用顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，線形DNA比環(huán)形DNA整合效率高，因此必須將人pBC2-sigHLY切成線形后(圖9)，方可進行顯微注射；另外，多余的質(zhì)粒片段也影響DNA整合效率。所以本實驗用NotI和SalI雙酶切，除去質(zhì)粒的多余部分，用Qigen試劑盒回收約26kb大小的片段，OD260/OD280值為1.75，將其濃度調(diào)至2ng/μl，通過顯微注射法建立轉(zhuǎn)基因小鼠。
(2).顯微注射共注射受精卵1500枚，移植受體鼠73只，受孕鼠34只，共生小鼠63只(3).轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測取2-3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴組織樣，提取DNA。用前面已使用過的一對引物(上游5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游5`CAG CAT CAG CGA TGT TAT CT 3`)分別對小鼠DNA樣PCR擴增，以普通小鼠基因組作為陰性對照，以人基因組作為陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有5只小鼠為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，陽性率為7.9％，如圖10.從檢測結(jié)果表明這些小鼠都轉(zhuǎn)有pBC2-sighLY。
(4).轉(zhuǎn)基因小鼠的Southern blot檢測將PCR檢測為陽性的5只小鼠尾巴組織樣DNA，取大約10μg用PstI內(nèi)切酶消化，低壓慢速電泳，轉(zhuǎn)膜后，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。雜交可得到5kb片段。結(jié)果如圖11所示，結(jié)果表明6、12、43、61和63號轉(zhuǎn)基因小鼠均為陽性小鼠，與PCR檢測結(jié)果一致，而陰性小鼠的基因組沒有雜交信號(0)。轉(zhuǎn)基因小鼠拷貝數(shù)的計算陽性對照包括3條帶(5、3、1)，分別相當(dāng)于基因組的5、3、1拷貝。根據(jù)Southern雜交信號強度，估算轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因整合的拷貝數(shù)。6號，1拷貝；12號，2拷貝；43和61號，高于30拷貝，63號，8拷貝。
(5).轉(zhuǎn)基因遺傳的檢測Founder轉(zhuǎn)基因小鼠一經(jīng)鑒定后立刻與非轉(zhuǎn)基因小鼠一起進行交配。共有6只陽性Founder小鼠，F(xiàn)1代共44只，采用與鑒定始祖轉(zhuǎn)基因小鼠同樣的程序提取基因組DNA及PCR檢測。其中6、12、61號小鼠后代的陽性率接近或小于50％；63號的后代為76.9％；43號的后代為100％。理論上，轉(zhuǎn)基因小鼠后代的陽性率至少為50％，并符合孟德爾分離規(guī)律。
(6).轉(zhuǎn)基因小鼠的Western blot檢測在轉(zhuǎn)基因小鼠生仔鼠后的第5天，采集乳汁，并采集一只陰性小鼠第5天的乳汁作為對照。在采集乳汁之前，需將母鼠與仔鼠隔離3小時以上，并通過腹腔注射一定劑量的催產(chǎn)素和按摩乳房才能順利采集到乳汁。以人奶作為陽性對照，以陰性小鼠奶樣作為陰性對照進行Western檢測。陰性小鼠的沒有雜交信號，人的有較強雜交信號作為陽性對照。對于轉(zhuǎn)基因小鼠，61和63號小鼠的奶樣有較強雜交信號，檢測到重組溶菌酶的表達(dá)。人乳中含有溶菌酶0.5mg/ml，根據(jù)信號的強度來估計，61號外源人溶菌酶的含量約為2mg/ml；63號約為0.5mg/ml；而12號沒有重組溶菌酶的表達(dá)，如圖12。
(7)、重組人溶菌酶的活性檢測A.溶菌酶對溶壁微球菌溶菌作用的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法如前所述B.重組人溶菌酶的活性檢測根據(jù)上述方法，分別測定轉(zhuǎn)基因小鼠、人、陰性小鼠乳清對溶壁微球菌作用的OD450值變化，測定三次，取0至1分鐘的OD450差值。根據(jù)x＝2000(y+0.002)×3公式可以計算乳清中溶菌酶的濃度。轉(zhuǎn)基因小鼠61號的酶活性為2160U/ml、63號948U/ml、12號30U/ml，陰性小鼠(ck)的酶活性為25.98U/ml，人的為1224U/ml。由此可見，與陰性小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠乳清的溶菌酶濃度有顯著提高，其中61號小鼠提高了83倍，63號提高了36倍，但12號幾乎沒有提高。與人乳清相比，61號的溶菌酶濃度提高了近1倍，63號也接近了人乳清的溶菌酶濃度，約為0.8倍。
從以上結(jié)果可以看出，我們構(gòu)建的pBC1-HLY和pBC2-sigHLY表達(dá)載體，都能在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中特異表達(dá)具有溶菌活性的重組人溶菌酶，而具有牛beta-casein信號肽序列的pBC2-sigHLY表達(dá)載體表達(dá)量以及相對溶菌活性都要明顯高于pBC1-HLY表達(dá)載體，因此pBC2-sigHLY表達(dá)載體是我們進行下一步實驗即進行轉(zhuǎn)基因克隆牛制作所采用的主要載體。而且從轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)情況可以看出，在山羊beta-casein啟動子區(qū)缺失31bp序列的pBC2與完整的pBC1的表達(dá)效果一致，證明我們構(gòu)建的pBC2也可以用于轉(zhuǎn)基因動物乳腺特異表達(dá)研究。
2.1.3pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO表達(dá)載體構(gòu)建1).pBC2-sighLY標(biāo)記表達(dá)載體的構(gòu)建策略為了便于篩選陽性細(xì)胞，我們首先構(gòu)建了含綠色熒光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因雙選擇標(biāo)記載體(pEGFP-NEO)以及新霉素基因單選擇標(biāo)記載體(pNEO)，然后分別將兩個標(biāo)記載體與此前構(gòu)建的pBC2-sigHLY載體連接構(gòu)建成pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO表達(dá)載體。
2)pEGFP-NEO的構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構(gòu)建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片斷EGFP-IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，并與EGFP-IRES-NEO連接即構(gòu)成pEGFP-NEO，如圖13.
3)pNEO的構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC1回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構(gòu)建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO并回收2kb片斷IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，并與IRES-NEO連接即構(gòu)成pNEO，如圖14.
4)pBC2-sigHLY-EGFP-NEO表達(dá)載體構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC2-sigHLY和pEGFP-NEO，將兩者連接即構(gòu)成pBC2-sigHLY-EGFP-NEO，通過酶切及測序分析，確定pBC2-sigHLY-EGFP-NEO載體構(gòu)建成功，載體圖如下(圖15)5)pBC2-sigHLY-NEO表達(dá)載體構(gòu)建用NotI和SalI酶切pBC-sigHLY和pNEO，將兩者連接即構(gòu)成pBC2-sigHLY-NEO，通過酶切及測序分析，確定pBC-sigHLY-NEO載體構(gòu)建成功，載體圖如下(圖16)2.2細(xì)胞培養(yǎng)，基因轉(zhuǎn)染及陽性細(xì)胞篩選2.2.1胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)在超凈工作臺中將胎兒浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗幾遍，以消毒過的手術(shù)器械取下耳部及脊背部的數(shù)塊表皮組織于DMEM+10％FCS培養(yǎng)液里。
↓在直徑60mm平皿中將胎兒組織切碎成為1mm3大小的組織碎塊，再將組織碎塊轉(zhuǎn)移至15mlmlml離心管中，1000rpm下離心洗滌數(shù)次。
↓用消毒玻璃彎頭吸管將小組織碎塊吸至25cm2培養(yǎng)瓶中，通過玻璃吸管彎頭使組織塊均勻分布在瓶壁上。
↓小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(防止組織塊落下)讓組織塊黏附于瓶壁上，置于37度，5％CO2培養(yǎng)箱中放置2～4h，待組織塊貼壁后，再正置培養(yǎng)瓶，補加適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
2.2.2胎兒成纖維細(xì)胞的傳代、冷凍、及復(fù)蘇待種植的原代細(xì)胞生長至80％匯合時，將細(xì)胞一部分冷凍，一部分傳代繼續(xù)培養(yǎng)。
2.2.2.1傳代用消毒玻璃彎頭吸管小心吸除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，沿著細(xì)胞生長壁的對面瓶壁注入無鈣鎂PBS(37度溫育)沖洗細(xì)胞兩次，以祛除殘余血清及細(xì)胞代謝物。
↓用同樣方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量為可覆蓋細(xì)胞單層即可(直徑100mm培養(yǎng)皿一般加入1ml消化液，35mm培養(yǎng)皿中加入200uL消化液)，放入培養(yǎng)箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞開始變圓時，用手指敲打培養(yǎng)皿壁，使細(xì)胞徹底脫壁，然后加入培養(yǎng)液終止消化。
↓用消毒玻璃彎頭吸管反復(fù)吹打，細(xì)胞，使其分散成為單個細(xì)胞，1000rpm下離心5min收集細(xì)胞。用培養(yǎng)液按1∶2或1∶3比例稀釋并重新接種細(xì)胞至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
2.2.2.2冷凍貼壁細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞于離心管中，在1000rpm下離心5min以去盡上清。
↓加4度預(yù)冷的冷凍液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞濃度約為107個細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至凍存管中。
↓放入4度冰箱預(yù)冷30min，再把凍存管插于厚泡沫上后置于液氮液面熏蒸2h，然后迅速投入液氮保存。
2.2.2.3復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，并在水浴中不斷快速搖動凍存管以迅速解凍。
↓待冷凍液徹底解凍后，以新鮮培養(yǎng)液稀釋10倍并將溶解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm下離心5min去除DMSO以緩減冷凍液毒性。
↓用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.2.3轉(zhuǎn)染用DNA的準(zhǔn)備大提質(zhì)粒pBC2-sigHLY-EGFP-NEO和pBC2-sigHLY-NEO，以SalI酶切質(zhì)粒，酶切反應(yīng)如下質(zhì)粒DNA約10-20μg
10×反應(yīng)buffer20μl限制性內(nèi)切酶 10-20UddH2O 補足體系至200μl上述試劑加好后，混勻，37度水浴消化2h，取5μL酶切產(chǎn)物以0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍體積無水乙醇和0.1倍體積乙酸鈉(PH5.2)，混勻后置-20度過夜；12000rpm離心15min回收沉淀，70％乙醇洗滌一次，真空干燥，加TE溶解。
2.2.4牛胎兒成纖維細(xì)胞對G418毒性敏感性檢測細(xì)胞培養(yǎng)到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×105個細(xì)胞接種到13個直徑35mm培養(yǎng)皿中以使細(xì)胞盡量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入終濃度從100μg/ml到1200μg/ml的G418，還有一孔中不加入G418作為對照。連續(xù)培養(yǎng)三周，每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細(xì)胞生長或死亡情況。
2.2.5電擊轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前將10～50μg純化回收的DNA融入500μL2×HeBS中，補充滅菌超純水至1ml，冰浴預(yù)冷。
↓在轉(zhuǎn)染前2～3天，用0.25％胰蛋白酶溶液消化培養(yǎng)細(xì)胞。將1×106個細(xì)胞轉(zhuǎn)接于75cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入完全培養(yǎng)液，置37度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
↓轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，確定細(xì)胞處于對數(shù)生長后期。用0.25％胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，1000rpm離心5min沉淀細(xì)胞。
↓將細(xì)胞沉淀用冰浴預(yù)冷的1×HeBS離心洗滌1次，同時進行細(xì)胞計數(shù)。
↓將一定數(shù)量的細(xì)胞重新懸浮于加有DNA的電極緩沖中，混合均勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中，在電擊前冰浴10min。
↓當(dāng)細(xì)胞準(zhǔn)備好進行電擊時，設(shè)置電場強度(E)和脈沖時間(t)，先試一下，確保產(chǎn)生了所需的脈沖。將電擊杯插入電擊槽中，按照選定的電場強度(E)和脈沖時間(t)，電擊細(xì)胞。
↓將經(jīng)電擊后的細(xì)胞冰浴10min后轉(zhuǎn)入75cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含20％FCS的DMEM培養(yǎng)液中于37度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
↓
1-2天后待細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)，將細(xì)胞擴大10倍培養(yǎng)，加入適量的G418進行篩選。
↓每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細(xì)胞生長或死亡情況。6-10天后，挑選陽性克隆細(xì)胞。
2.2.6陽性細(xì)胞的單克隆培養(yǎng)在熒光顯微鏡下觀察上述方法所得細(xì)胞克隆的發(fā)光情況，用記號筆圈住分散良好(遠(yuǎn)離其它克隆)且細(xì)胞數(shù)量多的熒光克隆；吸除培養(yǎng)液，用無鈣鎂PBS漂洗細(xì)胞二次，在高倍解剖鏡下，將30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在標(biāo)記好的細(xì)胞克隆上，待克隆的大多數(shù)細(xì)胞收縮脫壁后，不等細(xì)胞懸浮，快速吸取細(xì)胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的細(xì)胞；轉(zhuǎn)移細(xì)胞到加有500μl培養(yǎng)液的四孔板中，吹打分散細(xì)胞團塊；挑出的克隆繼續(xù)培養(yǎng)，降低G418濃度至300μg/ml維持篩選；待克隆細(xì)胞數(shù)量擴大后或匯合后，將一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到35mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，另一部分用于轉(zhuǎn)基因檢測，其它擴大后的細(xì)胞盡早冷凍。
2.3轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆2.3.1卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理鹽水在4h內(nèi)送到實驗室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2～8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/mlbLH+1μg/ml estradiol)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18～20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入0.1％透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2～3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞為體細(xì)胞核受體.
2.3.2卵母細(xì)胞的去核將帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml細(xì)胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內(nèi)徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培養(yǎng)箱中備用.
2.3.3移核與融合將血清饑餓2～4d的供體細(xì)胞用0.25％trypsin消化2～4min，選擇直徑為10～12μm的體細(xì)胞用20μm直徑玻璃管將其移入去了核的卵母細(xì)胞透明帶內(nèi)，然后將其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動卵細(xì)胞使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.5kV/cm、脈沖時間為10μs、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進行下一步激活處理.
2.3.4重構(gòu)胚的激活與培養(yǎng)將重構(gòu)胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min后換到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CRlaa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后觀察分裂率，7d后觀察囊胚發(fā)育率2.3.5胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體母牛的子宮角內(nèi).受體母牛選擇的都是經(jīng)產(chǎn)母牛，其中紅系冀南黃牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入魯西黃牛.在移植后的第60d進行直腸檢測，以確定妊娠率.
2.4轉(zhuǎn)基因克隆的PCR和Southern鑒定本發(fā)明共獲得四頭轉(zhuǎn)有pBC-sigHLY-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆牛，一頭轉(zhuǎn)有pBC-sigHLY-EGFP-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆牛。采集轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因克隆牛和普通荷斯坦奶牛耳部組織樣，提取DNA，然后進行PCR鑒定和Southern鑒定。
PCR檢測的引物序列為上游5`TTA TAC ACA CGG CTT TAC 3`下游5`CAG CAT CAGCGA TGT TAT CT 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，53℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃1∞，產(chǎn)物長度為700bp。結(jié)果如圖17和18。
對于NEO基因，引物序列為上游5`AGGATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTC CTG3`下游5`AAGAAC TCG TCAAGAAGG CGATAGAAG GCG 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃1∞，產(chǎn)物長度為490bp。結(jié)果如圖19和20。
對于EGFP基因，引物序列為上游5`TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3`下游5`CTCAGG TAG TGG TTG TCG GG 3`。PCR條件94℃ 5min；94℃ 40sec，62℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，產(chǎn)物長度為380bp。結(jié)果如圖21。
我們所使用的pBC2載體啟動子為山羊酪蛋白啟動子，并在啟動子區(qū)有31bp缺失。我們在缺失處設(shè)計了一對引物(pBCF15′GGG GAC AGA AAA ATA GGA AG 3′，pBCF15′AGA GGA GAA GAA GTGAAG GA 3′)，PCR條件94℃5min；94℃30sec，60℃ 30sec，72℃30sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，完整pBC1的擴增產(chǎn)物為174bp，而pBC2為143bp。擴增結(jié)果如圖22，泳道3和6擴增產(chǎn)物約為140bp，這是因為pBC2-sigHLY-NEO質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)基因小鼠DNA均含有缺失序列的pBC2；而1，2，3，4號牛，對照牛以及完整pBC的擴增產(chǎn)物均含有一條約為170bp帶，這可能是由于牛與羊的酪蛋白啟動子區(qū)同源性較高(pBCF1和2引物與牛酪蛋白啟動區(qū)同源性為100％和95％)的緣故，而2和3號克隆牛則還含有一條約為140bp的條帶，進一步證明2和3號克隆牛為轉(zhuǎn)有pBC2-sighLY-NEO的轉(zhuǎn)基因克隆牛。
從以上PCR結(jié)果可以看出，在我們得到的四頭克隆牛均轉(zhuǎn)有pBC2-sigHLY-NEO，而另有一頭轉(zhuǎn)有pBC2-sigHLY-EGFP-NEO。
取PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因克隆牛DNA約10μg用PstI內(nèi)切酶消化，低壓慢速電泳，轉(zhuǎn)膜后，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的5kb的hLY基因。以pBC2-sigHLY-NEO質(zhì)粒為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因克隆?；蚪M為陰性對照，雜交可得到5kb片段，如圖23所示進一步確定了金娃和盼娃轉(zhuǎn)有溶菌酶基因，可以估計金娃和盼娃轉(zhuǎn)有20個拷貝的人溶菌酶基因，根據(jù)轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果，可以推測這兩頭轉(zhuǎn)基因牛將能在乳腺中高效表達(dá)人溶菌酶。
2.5轉(zhuǎn)基因牛重組人乳鐵蛋白表達(dá)分析2.5.1藥物催乳以西安草灘藥廠生產(chǎn)的催乳針按1/4劑量對6-8月齡的轉(zhuǎn)基因克隆牛進行藥物催乳，同時以雙標(biāo)記載體轉(zhuǎn)基因克隆牛、普通克隆牛、同月齡普通黑白花奶牛作為對照進行催乳，還以普通牛奶為對照，每天收集3次奶樣，共收集兩周。
2.5.2轉(zhuǎn)基因牛奶的PAGE電泳、Western和放免測定本實施例對四頭轉(zhuǎn)基因牛乳樣進行分析。對轉(zhuǎn)基因牛的乳樣用重蒸滅菌水稀釋三倍，進行去乳脂、去酪蛋白的處理，最后得到乳清部分。重組人溶菌酶即存在于乳清中。對轉(zhuǎn)基因牛奶樣和對照乳樣進行脫脂和去酪蛋白后，用減性(reducing)SDS上樣Buffer變性的PAGE膠進行電泳，結(jié)果如圖24。從此圖可以看出轉(zhuǎn)基因牛奶樣有一條與人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品大小一致的特異條帶。用兔抗人溶菌酶抗體進行Western雜交，結(jié)果如圖25。從Western結(jié)果可以看出轉(zhuǎn)基因牛乳樣和人奶有一條與人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品大小一致的特異條帶，表明轉(zhuǎn)基因牛乳腺中能表達(dá)完整的重組人溶菌酶。
利用放射性免疫法檢測轉(zhuǎn)基因牛奶樣中重組人溶菌酶的表達(dá)量。人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品用125I用氯胺-T法標(biāo)記，取6個時間點的乳樣進行檢測。測得轉(zhuǎn)基因牛乳樣中重組人溶菌酶的表達(dá)量平均值金娃為3.49g/l，盼娃為0.55g/l，329為0.52g/l，而0365牛為2.48g/l，表明我們所使用的人溶菌酶基因結(jié)構(gòu)可以在轉(zhuǎn)基因牛乳腺中高效表達(dá)完整的重組人溶菌酶。
2.5.3重組人溶菌酶的活性檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線建立如前所述(轉(zhuǎn)基因小鼠)，經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)基因牛金娃的重組人溶菌酶酶活性為3065U/ml、盼娃922U/ml、329號986U/ml，0365號2740U/ml，陰性小鼠(ck)的酶活性為25.98U/ml，人的為1224U/ml?？梢姳景l(fā)明所生產(chǎn)的重組人溶菌酶具有與天然人溶菌酶相當(dāng)?shù)纳锘钚?，甚至超過天然人溶菌酶生物活性。
附SEQ ID NO 1本序列為人溶菌酶一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列，共148個氨基酸，其中前18個氨基酸為信號肽。
1 MKALIVLGLV LLSVTVQGKV FERCELARTL KRLGMDGYRG ISLANWMCLA51 KWESGYNTRA TNYNAGDRST DYGIFQINSR YWCNDGKTPG AVNACHLSCS101ALLQDNIADA VACAKRVVRD PQGIRAWVAW RNRCQNRDVR QYVQGCGV
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的生產(chǎn)方法，其操作步驟如下(1)構(gòu)建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建人溶菌酶乳腺特異表達(dá)載體與雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，將串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA導(dǎo)入家畜體細(xì)胞核內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)基因克隆動物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，所述乳腺特異表達(dá)載體為pBC2-sigHLY，所述的pBC2為在pBC1的6407-6438bp處缺失31bp所構(gòu)建的骨架載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其中所述的sigHLY由牛beta-casein信號肽序列，人溶菌酶的14外顯子和1-3內(nèi)含子組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，所述的導(dǎo)入方法為電穿孔轉(zhuǎn)染法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，所述的雙標(biāo)記選擇載體以增強型綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因為標(biāo)記選擇基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法，所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA為pBC2-sigHLY-EGFP-NEO。。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，所述的單標(biāo)記選擇載體以新霉素抗性基因為標(biāo)記選擇基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA為pBC2-sigHLY-NEO。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)方法，所述大型家畜為牛。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆大型家畜的生產(chǎn)方法，其操作步驟如下(1)構(gòu)建含有人溶菌酶基因的乳腺特異表達(dá)載體，(2)構(gòu)建人溶菌酶乳腺特異表達(dá)載體與雙標(biāo)記選擇載體和單標(biāo)記選擇載體的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，將串聯(lián)結(jié)構(gòu)DNA導(dǎo)入家畜體細(xì)胞核內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，(3)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為核供體進行體細(xì)胞克隆，獲得轉(zhuǎn)有人溶菌酶基因的轉(zhuǎn)基因克隆動物。本發(fā)明所研究的重組人溶菌酶，具有與天然人溶菌酶相同的生物活性；含有重組人溶菌酶的牛奶可以開發(fā)成保健牛奶及奶制品；純化的重組人溶菌酶可以開發(fā)成防腐劑、食品添加劑、保健品和藥品。
文檔編號C12N15/56GK1891821SQ20061007624
公開日2007年1月10日 申請日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者湯波, 戴蘊平, 龔國春, 于政權(quán), 張磊, 李寧 申請人:李寧