專利名稱：一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域中一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物。
背景技術：
大豆的大部分農(nóng)藝性狀是由多基因或QTL控制的數(shù)量性狀，在這樣一個多基因體系中，每個基因對目標性狀只表現(xiàn)微效作用，沒有明顯的顯性，而且表現(xiàn)型受環(huán)境條件影響很大。因而采用傳統(tǒng)的育種途徑對這些性狀進行選擇有很大的難度。分子標記輔助選擇為數(shù)量性狀的改良提供了新的研究思路。Paterson等(Paterson A H，Landon E S，Hewitt J D，et al.Resolution of quantitativeinto Mendelian factors by using acomplete RFLP linkage map.Nature，1988，335721-726)認為高密度分子遺傳圖譜的建立，使覆蓋全基因組的分子標記將控制數(shù)量性狀的微效多基因分解成孟德爾遺傳因子，并定位到分子標記所在的染色體上，進而按照經(jīng)典遺傳模式進行研究。這就使得利用與QTL緊密連鎖的分子標記對這些QTL進行轉移以達到對這些數(shù)量性狀的改良成為可能。
微衛(wèi)星是以少數(shù)幾個核苷酸為核心單位多次串聯(lián)重復的DNA序列，是一種簡單序列重復(simple sequence repeats，SSR)，兩側一般是保守序列。由于它具有多態(tài)性高、共顯性、容易用PCR檢測和結果穩(wěn)定可靠等特點，因此是一種十分理想的分子標記。
油分是大豆重要的品質性狀和數(shù)量性狀，利用分子標記技術尋找與高油基因連鎖的分子標記一直是大豆數(shù)量性狀定位研究中的重點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物。
本發(fā)明所提供的用于輔助篩選高油大豆品種的引物，名稱為Satt160，由正向引物和反向引物組成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
本發(fā)明所提供的輔助篩選高油大豆品種的方法，是以待測大豆的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如待測大豆得到450-500bp的DNA片段，則該待測大豆為候選高油大豆品種。
實驗證明，以24個大豆品種品系的總DNA為模板，以用Satt160引物進行PCR擴增，擴增得到的帶型與高油親本黑農(nóng)45的帶型的符合率為83.33％。說明Satt160引物可用于高油大豆的輔助選擇。本發(fā)明的輔助篩選高油大豆品種的方法將在高油大豆的育種中發(fā)揮重要作用，為選育高油大豆提供了一種快捷的選擇方法。


圖1為部分SSR引物多態(tài)性篩選結果圖2為satt160引物在120個單株中的PCR擴增結果圖3為6個連鎖群的分子遺傳圖譜圖4為satt160引物在24個大豆品種品系及親本中的PCR擴增結果具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的大豆品種品系均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1、與大豆高油基因連鎖的分子標記的獲得1、多態(tài)性SSR引物的篩選以高蛋白大豆品系哈交99-5448-4為父本和高油大豆品種黑農(nóng)45作為母本，配制雜交組合。雜種F1代種子溫室種植。F2代種子在實驗田種植，小區(qū)行長3米，株距10厘米，獲得F2:3家系，共120個單株，作為供試分離群體。通過田間鑒定和室內(nèi)鑒定對親本和群體農(nóng)藝性狀進行考察。
參照Cregan(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map ofthe soybean genome.Crop Sci，1999，35(5)1464-1490)的“大豆公共圖譜”選擇SSR引物，選擇的標準之一是座位分布均勻，二是基因多樣性程度高。選擇基本覆蓋大豆全基因組的239對SSR引物(見表1)SSR引物的序列在大豆數(shù)據(jù)庫SoyBase中獲得，網(wǎng)站地址是http//www.soybase.com/。
表1 本實驗所使用的239對SSR引物


分別從供試分離群體中的120株供試單株、兩個親本植株哈交99-5448-4和黑農(nóng)45上取大小約為2cm2的嫩綠葉片，置于1.5ml離心管中，向離心管中加入少量液氮，用玻璃棒或不銹鋼錐子將凍干的葉片迅速搗碎(無液氮時可直接用玻璃棒將葉片搗碎)，備用。DNA提取采用SDS法(關榮霞，常汝鎮(zhèn)，邱麗娟.用于SSR分析的大豆DNA的快速提取.大豆科學，2003，21(1)73-74)。在上述裝有備用材料的1.5ml離心管中加入400μl預熱的SDS提取液(含100mmol/L Tris-HCl pH8.5，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，2％SDS)，65℃水浴30min，冷卻后加入等體積酚/氯仿(1∶1)，充分混勻，靜置10min，1000rpm離心5min，取上清液于另一新離心管中，加入2倍體積無水乙醇6000rpm離心2min，棄上清，用70％乙醇洗DNA沉淀一次，風干，加300μl超純水溶解。
PCR反應在PCR擴增儀ABI-9700上進行。20ul反應體系中含有50-100ng基因組DNA模板，1×PCR緩沖液、1.25mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.2μM SSR引物和1U Tag DNA聚合酶。PCR反應程序為先95℃4min預變性；再95℃ 30s，47℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)。72℃ 10min后，于4℃保存。擴增產(chǎn)物用測序膠(6％聚丙烯酰胺，8mol/L尿素)分離，銀染技術檢測。檢測結果表明所有251對SSR引物均擴增出穩(wěn)定的產(chǎn)物，其中48對SSR引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物頻率為25.1％(圖1)，該48對SSR引物為(見表2)。
表2 48對在親本間產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物

2、多態(tài)性SSR標記的分離分析將這48對多態(tài)性引物逐一在F2分離群體(120個單株)中進行展開，所得擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后進行銀染檢測，統(tǒng)計銀染的帶型并記錄數(shù)據(jù)。經(jīng)x2檢驗，其中有41個SSR標記在群體中呈1∶2∶1的分離比例，占85.42％，符合共顯性標記的遺傳特征，該41個SSR標記中的satt160引物在120個單株中的PCR擴增結果如圖2所示；有7個SSR標記呈現(xiàn)偏分離，5個SSR標記偏向黑農(nóng)45，2個SSR標記偏向哈交00-5448-4，偏分離引物的比例為14.58％，與Keim等(Keim，P.，B.W.Diers，T.C.Olson，and R.C.Shoemaker.1990.RFLP mapping in soybeanAssociationbetween marker loci and variation in quantitative traits.Genetics126735-742.)報道的13.3％相近，但低于張德水等(張德水，董偉，惠東威，陳受宜，莊炳昌.用栽培大豆與野生大豆間的雜種F2群體構建基因組分子標記連鎖圖譜框架圖.科學通報，1997，42(2)1326-1330)報道的25.0％和吳曉雷等(吳曉雷，王永軍，賀超英，陳受宜，蓋鈞鎰，王學臣.大豆重要農(nóng)藝性狀的QTL分析.遺傳學報，2001a，28(10)947-955)報道的21.7％。各標記的雜合率在39.58％～59.90％之間，平均49.74％，基本符合F2群體的遺傳特征。分離群體中標記的偏分離現(xiàn)象普遍存在，與已有的報道相比，本研究群體的偏分離標記比例較小，這與吳曉雷等(吳曉雷，王永軍，賀超英，陳受宜，蓋鈞鎰，王學臣.大豆重要農(nóng)藝性狀的QTL分析.遺傳學報，2001a，28(10)947-955)的結果相似，他們也認為從不同類型的分子標記位點的偏分離情況來看，SSR位點偏分離比例最低。
3、SSR遺傳圖譜的構建利用篩選的48個多態(tài)性SSR標記，在分離群體中，對個體進行SSR座位進行等位變異統(tǒng)計，與父本帶型相同的等位變異記錄為“A”，與母本帶型相同的等位變異記錄為“B”，雜合帶型記錄為“H”，數(shù)據(jù)缺失記錄為“-”。應用軟件MAPMAKER/EXPV3.0(Lander等，1987)進行圖譜的構建。利用“Group”命令進行標記間的連鎖分析和分組(LOD＝3.0)，連鎖標記數(shù)小于8個的使用“Compare”命令進行排序，標記數(shù)大于等于8個的要重復使用Ripple命令進行排序。利用QTL Cartographer1.1軟件進行復合區(qū)間作圖，LR值11.5(LOD值2.5)為閾值對QTL進行定位和效應估算。結果得到一張包括6個連鎖群的分子遺傳圖譜(圖3)，圖譜上的SSR標記數(shù)為18個，沒有連鎖的SSR標記為30個，整個圖譜覆蓋的基因組長度為306cM，平均長度為17cM，符合QTL定位的要求。而且與公共圖譜(Cregan P B，Jarvik T.An integrated genetic linkage map of the soybean genome.CropSci，1999，35(5)1464-1490)進行比較，結果表明6個連鎖群完全可以與公共圖譜中的連鎖群對應上。圖3中，連鎖群(LG)中的數(shù)字表示相鄰的兩個SSR標記或QTL和相鄰的SSR標記之間的遺傳距離。
利用Mapmaker QTL1.1進行QTL定位，在連鎖群F上定位了一個控制大豆油分含量的QTL，此QTL位于satt160-satt193這個區(qū)間內(nèi)，與satt160的遺傳距離是26.0cM，其遺傳貢獻率為23.2％。
其中，Satt160的引物序列為正向引物TCC CAC ACA GTT TTC ATA TAA TATA，反向引物CAT CAA AAG TTT ATA ACG TGT AGA T。
實施例2、利用satt160引物輔助篩選高油大豆品種實驗材料包括父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品種黑農(nóng)45和表1中的24個材料。
表3 用于分子標記輔助選擇的大豆品種品系


上述大豆材料的種子取單粒磨成豆粉，分別置于1.5ml離心管中，4℃保存，按照實施例1的方法提取基因組DNA。
用父本高蛋白大豆品系哈交99-5448-4、母本高油大豆品種黑農(nóng)45和表3中的24個材料的分子標記輔助選擇，具體方法如下利用引物satt160，按照實施例1的方法對這26個品種品系的DNA進行PCR擴增，電泳檢測，結果如圖4所示，表明有12個材料(黑農(nóng)44、黑農(nóng)45(與P2同)、Hobbit、合豐25、合豐43、墾農(nóng)4、墾農(nóng)18、遼豆14、M14、嫩豐17、中32、5186)具有高油親本黑農(nóng)45所擴增出來的DNA片段，檢測符合率達到了50％，其中所檢測到的高油品種中只有二個材料(合豐25、5186)不是高油品種品系，在檢測到的高油品種中的符合率達到了83.33％，說明與satt160這個標記連鎖的高油基因同時在這10份材料中能夠找到，從而達到了利用分子標記進行輔助選擇的目的。圖4中，P1為哈交99-5448-4，P2為黑農(nóng)45，1至24對應表3中的品種。
序列表<160>2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tcccacacag ttttcatata atata 25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2catcaaaagt ttataacgtg tagat 2權利要求
1.用于輔助篩選高油大豆品種引物，由正向引物和反向引物組成，所述正向引物具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述反向引物具有序列表中序列2的核苷酸序列。
2.一種輔助篩選高油大豆品種的方法，以待測大豆的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如待測大豆得到450-500bp的DNA片段，則該待測大豆為候選高油大豆品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助篩選高油大豆品種的方法及其專用引物。該輔助篩選高油大豆品種的方法，以待測大豆的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如待測大豆得到450－500bp的DNA片段，則該待測大豆為候選高油大豆品種。
文檔編號C12Q1/68GK1876842SQ200610076250
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月21日 優(yōu)先權日2006年4月21日
發(fā)明者劉麗君, 楊喆, 吳俊江, 高明杰, 蒲國鋒, 張雷 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大豆研究所