專利名稱：Sip45基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SIP45基因，該基因編碼的SIP45蛋白，以及所述基因和蛋白在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
某些蛋白可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，這種調(diào)控是通過細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白分子間相互作用而實現(xiàn)的。通過探索與已知調(diào)控腫瘤生長的因子相互作用的新的蛋白，可以發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)腫瘤生長的新途徑，為腫瘤的治療提供新的方法和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種參與調(diào)控細(xì)胞生長增殖的新的蛋白，克隆了編碼該蛋白的基因，構(gòu)建了含有該基因的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，對該蛋白進(jìn)行了真核細(xì)胞的表達(dá)和體外純化，完成了其組織細(xì)胞表達(dá)譜的分析，并得到了特異性的多克隆抗體。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供了可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長和增殖的蛋白，尤其重組蛋白，該蛋白具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者通過所述氨基酸序列中的一個或多個氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼上述蛋白的基因，它是具有與SEQ ID No.1所示的DNA或者與所述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA。
在另一個方面，本發(fā)明提供了含有上述基因或者編碼上述蛋白的基因的表達(dá)載體。
在又一個方面，本發(fā)明提供了由上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的重組蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離出重組蛋白。
在另一個方面，本發(fā)明提供了針對上述蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產(chǎn)生的特異性抗體。它可以是單克隆或多克隆抗體。
在另一個方面，本發(fā)明提供了檢測所述蛋白的試劑盒，它含有上述特異性抗體，可以進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，用于檢測具有序列表SEQ IDNo.2所示的蛋白。
此外，本發(fā)明提供了用于檢測如序列表核苷酸序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與序列表核苷酸序列SEQ ID No.1中的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。它可以是一個具有15-300個堿基的DNA片段。通過探針雜交的方法，用于檢測含有所述核苷酸序列的mRNA的表達(dá)，該mRNA被翻譯為含有序列SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的蛋白。
此外，本發(fā)明提供了一個引物對，用于對進(jìn)行PCR擴增，引物如下所示引物15’-GGA ATT CAT GTC CCT TGC TCG GGG CCA TGG AG-3’引物25’-CGG GAT CCT CAG TAT TTC CGC TGC CGA GGG AAG-3’。
本發(fā)明還提供了上述基因、蛋白或抗體在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種治療腫瘤，尤其子宮癌的藥物組合物，該藥物組合物可以包含治療有效量的蛋白以及藥學(xué)可接受的載體或賦型劑，這樣的載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘醇，乙醇，或混合物，這些制劑應(yīng)適合給藥方式。
本發(fā)明的藥物組合物可以以適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、皮下等途徑給藥。給藥于患者的用量取決于許多因素，如給藥方式，待治療者的身體條件和診斷醫(yī)生的判斷。
SIP45(SRC-1 interacting protein，Molecular Weight 45kDa)是由p160家族成員之一的SRC-1通過酵母雙雜交的方法篩選出來的新基因。為了得到全長的SIP45基因ORF，我們提取了人子宮內(nèi)膜癌Ishkawa細(xì)胞的總mRNA，以其為模本，并前文所提供的相應(yīng)于SIP45基因ORF起始及終止區(qū)的特異引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。由于在上下游引物中分別含有EcoRI和BamHI的酶切位點，使得PCR產(chǎn)物可導(dǎo)入pCDNA3.1質(zhì)粒載體中，經(jīng)擴增，測序，從而確定得到正確的克隆。SIP45的ORF序列還被插入帶有5’端Flag標(biāo)簽的pCDNA3.1質(zhì)粒、原核表達(dá)載體pGEX4T3、及真核表達(dá)熒光融合蛋白所需的pEGFPC2質(zhì)粒中。所有SIP45-質(zhì)粒DNA均經(jīng)測序確定其讀碼框架及編碼序列的正確無誤。
SIP45基因位于人16號染色體短臂16p11.2區(qū)，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。其基因全長含有3607個堿基，其mRNA全長為1164個堿基。我們克隆到的SIP45的ORF有765個堿基，編碼一個254個氨基酸的蛋白，預(yù)測分子量為30kDa(最終的SDS-PAGE實際電泳所得為45kDa)。用SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)蛋白分析工具對SIP45的蛋白序列進(jìn)行的計算機模擬功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，在其蛋白序列的第196位氨基酸至213位氨基酸存在著一段核定位信號(Bipartate nuclear localization signal)。在整個的ORF中，雖不存在明確的已知功能域，但在其中間及靠近C端處，有部分序列與一些DNA binding domain(包括SIP45NT、BASIC、以及BRLZ domain)具有一定同源性，提示該蛋白可能也有類似的功能。進(jìn)化分析顯示，SIP45在小鼠(Mus musculus)和棕色大鼠(Rattus norvegicus)均有高度同源的蛋白質(zhì)(73％ similarity)，這種進(jìn)化保守性提示SIP45在體內(nèi)具有較為重要的生理功能。
通過使用本發(fā)明的蛋白或者免疫學(xué)上等效的多肽，可以獲得其抗體，抗體用于所述蛋白的檢測和純化?？梢岳帽景l(fā)明的蛋白或其部分氨基酸序列作為免疫原來產(chǎn)生抗體?？梢酝ㄟ^將抗體接種給宿主動物并回收血清的常規(guī)方法產(chǎn)生多克隆抗體。還可以通過常規(guī)雜交瘤方法產(chǎn)生單克隆抗體。


圖1.SIP45的基因結(jié)構(gòu)。SIP45基因全長為3607bp。它包含3個外顯子和2個內(nèi)含子以及5’端和3’端的非翻譯區(qū)。下方所示為SIP45的蛋白序列。圖中下畫線部分為核定位信號所在。
圖2.克隆全長的SIP45的編碼序列(ORF)。采用RT-PCR法由人子宮內(nèi)膜癌Ishkawa細(xì)胞中提取總mRNA，以其為模本，設(shè)計相應(yīng)于SIP45基因ORF起始及終止區(qū)的特異引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。圖中顯示得到768bp的特異性擴增產(chǎn)物。圖中最右列為陰性對照組。
圖3.Western Blot分析圖，為人乳腺癌MCF7細(xì)胞以Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染Flag-SIP45/pcDNA3.1質(zhì)粒24小時后，提取總蛋白的Western Blot分析。以單克隆抗Flag抗體檢測表達(dá)蛋白。如圖所示，轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白電泳位置相當(dāng)于46kDa左右(Flag標(biāo)簽約為1kDa大小)。圖中左列顯示未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無特異性條帶。
圖4.在大腸桿菌BL21中表達(dá)SIP45-GST融合蛋白。
圖5.SIP45基因的mRNA在人體內(nèi)各組織的分布情況。圖為以32P標(biāo)記SIP45的ORF全長為cDNA探針，與從Clontech公司購買的人體多組織總mRNA膜進(jìn)行Northern Blot雜交。結(jié)果顯示，SIP45在多種組織均有分布，在心臟、肝臟、骨骼肌及脾臟中含量尤為豐富。
圖6.免疫熒光法對SIP45蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。
圖7.多克隆抗體的Western Blot分析圖。以體外純化的SIP45-GST融合蛋白免疫實驗兔，得到SIP45特異性的多克隆抗體。
圖8.SIP45與SRC-1在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。免疫共沉淀實驗顯示，在單獨轉(zhuǎn)染SIP45-Flag表達(dá)載體(左lane)或與SRC-1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染(右lane)的MCF7細(xì)胞裂解液中，以Flag抗體沉淀蛋白復(fù)合體中，僅在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液中可以檢測到SRC-1蛋白。
實施例實施例1用RT-PCR方法從人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishkawa中克隆編碼SIP45蛋白的基因提取人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishkawa的總mRNA，以其為模本，并設(shè)計相應(yīng)于SIP45基因ORF起始及終止區(qū)的特異引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。用下列引物進(jìn)行PCR擴增Primer15’-GGA ATT CAT GTC CCT TGC TCG GGG CCA TGG AG-3’Primer25’-CGG GAT CCT CAG TAT TTC CGC TGC CGA GGG AAG-3’。
擴增反應(yīng)的條件在50μL的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(PH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，0.25U的pfu DNA聚合酶(Takara公司產(chǎn)品)。按下列條件反應(yīng)25個周期94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃ 2min 30sec。擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用EcoRI及BamHI雙酶切后，克隆到相同酶切的pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體中。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與預(yù)期相符。結(jié)果見圖2。
實施例2Northern Blot探針的標(biāo)記和雜交操作參照Clontech公司的SpotlightTMRandomPrimer Labeling Kit試劑盒說明書。過程如下(1)探針標(biāo)記25ng-1μgDNA溶于20μL體積中，90-100℃ 2-3分鐘，迅速冰浴5分鐘，加5μL[α-32P]dCTP標(biāo)記的RandomPrimers and Reaction Buffer Mix，補水至50μL，37℃孵育5-10min。
(2)雜交68℃預(yù)熱雜交液，將吸附有核酸的尼龍膜放入含有雜交液的雜交瓶中，加入含有100μg/mL的鮭精DNA的雜交液0.1mL/cm2，68℃預(yù)雜交30min。20ng/mL探針混入雜交液，95℃ 2-5分鐘，冰浴5分鐘。加入雜交瓶，68℃雜交1小時。
(3)洗膜用Wash Buffer 1室溫洗膜30-40分鐘，用Wash Buffer2 50℃洗膜40分鐘。
(4)顯色用鑷子取出膜，洗干Wash Buffer 2，用保鮮膜覆蓋，-70℃曝光1-3天后顯影，定影。
實施例3SIP45在原核細(xì)胞中的表達(dá)及純化pGEX4T3-SIP45可以在大腸桿菌BL21菌株中30℃誘導(dǎo)表達(dá)GST-SIP45的融合蛋白，首先制備BL21的感受態(tài)細(xì)胞挑取單克隆到適量培養(yǎng)基中，37℃ 250rpm培養(yǎng)至A6000.4-0.5，2500g離心15分鐘，備用。將1-50ng pGEX-4T-3-SIP45轉(zhuǎn)化到上述制備的感受態(tài)細(xì)胞中，用Glutathione Sepharose 4B進(jìn)行純化，純化的步驟如下(1)取單克隆到2-3mL 2YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5小時。轉(zhuǎn)接到100mL的錐形瓶中生長過夜。
(2)轉(zhuǎn)接到500mL的錐形瓶中培養(yǎng)3-5小時。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培養(yǎng)3-6小時。
(4)3000rpm 10分鐘離心收集細(xì)胞。
(5)用25mL PBS重懸細(xì)胞。超聲10分鐘。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混勻1小時。
(7)1000rpm 10分鐘離心，加入0.5mL 50％ slurry of GlutathioneSepharose 4B，室溫30分鐘。
(8)1000rpm 5分鐘離心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脫Buffer洗脫，短暫離心后收集上清。
圖4示出了在大腸桿菌BL21中表達(dá)SIP45-GST融合蛋白。圖為經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE膠。圖中1-3列均為純化的SIP45-GST蛋白。第4列為表達(dá)該蛋白的細(xì)菌裂解液。圖中第5-7列為純化的GST蛋白，而第8列為其相應(yīng)的細(xì)菌裂解液。
實施例4制備多克隆抗體。
提純足量的免疫實驗兔所需的SIP45蛋白。在選定實驗兔之前預(yù)先以Western Blot檢查兔血清中所具有的背景抗體滴度(用抗兔的二抗孵育)，避免選用含有與SIP45相似分子量的背景抗體的實驗兔。第1天和第3天各用300μg抗原加完全佐劑混勻后皮下注射實驗兔，第37天用ELISA測抗體滴度。采用頸動脈取血法。取血后將其置于37℃，2小時，然后4℃過夜，吸取血清。用Western Blot檢測所得的SIP45多克隆抗體的特異性及靈敏性。結(jié)果見圖7，圖中所示為使用該多克隆抗體檢測MCF7細(xì)胞中所表達(dá)的SIP45蛋白。Lane1為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞，Lane2為轉(zhuǎn)染了SIP45/pCDNA3.1質(zhì)粒的細(xì)胞，Lane3為轉(zhuǎn)染了SIP45/pEGFP質(zhì)粒的細(xì)胞。
實施例5SIP45在真核細(xì)胞中的表達(dá)Western Blot是在蛋白質(zhì)電泳和固相免疫測定的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本原理為抗原抗體反應(yīng)。細(xì)胞蛋白提取物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上(本實驗采用硝酸纖維素膜)。與特異的一抗反應(yīng)(本實驗用小鼠抗人Flag單克隆抗體，Sigma)，再與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(本實驗室保存兔抗鼠二抗)孵育，顯色，可以得到特異蛋白分子的免疫印跡圖。該方法具有從混雜抗原中檢測出特定的抗原的優(yōu)點，因此本實驗用于檢測內(nèi)源性SIP45或SIP45基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后的蛋白表達(dá)情況。
1)瞬時轉(zhuǎn)染實驗于轉(zhuǎn)染前一天將MCF-7細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)板中，接種密度為2×106個細(xì)胞/孔，每孔加入培養(yǎng)液10ml。24小時后，細(xì)胞長至覆蓋培養(yǎng)孔底面積約50-60％時，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。在EP管中配制下述溶液溶液A12μg pcDNA3.1(-)-SIP45表達(dá)質(zhì)粒，溶于1.5mL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液。溶液B將30μL脂質(zhì)體溶液(lipofectamine 2000 reagent)加入到1.5mL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液中。室溫靜置5分鐘。然后將溶液A、B混合，室溫靜置20分鐘。用無血清和不含雙抗的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。將上述溶液A、B的混合液中加入12mL無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混勻后加至細(xì)胞表面。37℃，5％ CO2條件下孵育4-6小時后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液取代前述培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至48小時。
2)細(xì)胞總蛋白的提取培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)0.25％胰酶消化使之分散，4℃低速離心去上清，將沉淀置于冰上30min，再用預(yù)冷的PBS洗2次，每106細(xì)胞加入裂解液100μL，使細(xì)胞充分裂解30min，再于4℃，20000×g離心15min，收集上清。
3)Bradford法測定細(xì)胞裂解液蛋白的濃度首先配制考馬斯亮藍(lán)染色液；將標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別將10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和5μL待測蛋白質(zhì)樣品加入3mL考馬斯亮藍(lán)染液中，室溫孵育10min，在595nm波長處測定吸收值。BSA標(biāo)準(zhǔn)樣品測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，在一定范圍內(nèi)OD595與蛋白濃度成正比。樣品蛋白質(zhì)的濃度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程來計算。4)電泳及免疫反應(yīng)流程如下A、制膠(5％濃縮膠，10％分離膠)；B、50μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸，上樣；C、電泳，濃縮膠80V電壓，分離膠120V電壓；D、轉(zhuǎn)膜，100V，1.5h；E、封閉，1h；F、一抗反應(yīng)，4℃，過夜；G、TBST洗膜，三次，每次10min；H、二抗反應(yīng)，1.5h；I、TBST洗膜，三次，每次10min；J、顯色、曝光。結(jié)果見圖3。
實施例6SIP45在細(xì)胞內(nèi)的定位利用發(fā)明人實驗室保存的pEGFP-C1載體構(gòu)建了pEGFP-C1-SIP45質(zhì)粒，它可以在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP-SIP45的融合蛋白，將該載體用Lipofectamine 2000TM的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行爬片，24小時后，用PBS洗三遍，用4％多聚甲醛/PBS進(jìn)行固定，室溫15分鐘，然后用PBS洗三遍。用0.1％Triton X-100/PBS透化15分鐘，然后用PBS洗三遍，加入200μL 2.5mg/mL的DAPI，室溫作用30分鐘，然后用PBS洗三遍，在熒光顯微鏡下分別用常規(guī)熒光波長和DAPI波長進(jìn)行觀察，并進(jìn)行拍照。結(jié)果見圖6，(A)MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag-SIP45/pCDNA3.1質(zhì)粒24小時后，固定，透膜，以Flag抗體為一抗，Rhodamine標(biāo)記的抗鼠抗體為二抗，進(jìn)行熒光染色。在絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，SIP45表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，如圖位于下方的兩個細(xì)胞。在個別細(xì)胞中，SIP45則較多的位于細(xì)胞核中，如圖最上方的細(xì)胞。(B)同A視野的DAPI染色顯示細(xì)胞核所在的位置。(C)MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIP45-GFP表達(dá)載體24小時后的活細(xì)胞直接免疫熒光觀察。絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞也顯示表達(dá)蛋白位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。(D)同C視野的DAPI染色顯示細(xì)胞核所在位置。相應(yīng)圖中的白線代表5μm。在絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，SIP45表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，在個別細(xì)胞中，SIP45則較多的位于細(xì)胞核中。
實施例7MTT法檢測不同濃度的SIP45對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響MTT(四甲基偶氮唑蘭)可被細(xì)胞攝取，并被活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶還原成一種不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲瓚，并沉淀于細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。甲瓚可溶于二甲基亞砜(DMSO)，溶液在570nm處有最大吸收。故該波段處吸收值越大代表存活細(xì)胞量越多。MTT法廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性實驗、細(xì)胞生長測定等。本實驗利用MTT法觀察SIP45對MCF-7生長的影響。具體操作方法如下將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×104個。次日按照濃度梯度加入SIP45(25、50、100ng)，每濃度作用6孔細(xì)胞，37℃，5％CO2進(jìn)行培養(yǎng)。分別培養(yǎng)1d、2d、3d、4d后，在每個細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入50μlL1mg/mL的MTT溶液，同樣培養(yǎng)條件下作用4小時后取出，小心吸出每孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜150μL，輕微振蕩10分鐘，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解在二甲基亞砜中。用自動酶標(biāo)儀測量96孔板中每孔在570nm處的吸光值。MTT實驗表明SIP45對MCF-7細(xì)胞生長增殖起抑制作用，并且與劑量有關(guān)。
實施例8瞬時轉(zhuǎn)染及熒光素酶(Luciferase)實驗應(yīng)用熒光素酶作為報告基因，為分析基因的調(diào)控元件和測量基因轉(zhuǎn)錄活性提供了便利的方法。本實驗就是將cyclinD1基因啟動子與熒光素酶讀碼框共同構(gòu)建到真核表達(dá)載體中，將該融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過測定熒光素酶的活性，從而研究轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)蛋白對cyclinD1基因啟動子的作用。實驗采用螢火蟲熒光素酶(Firefly)為報告基因，海三色堇(Renillar)熒光素酶為內(nèi)參照。用Promega公司出產(chǎn)的雙熒光報告基因分析系統(tǒng)試劑盒，在同一試管中測量兩種酶的活性。并應(yīng)用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。
2)瞬時轉(zhuǎn)染實驗于轉(zhuǎn)染前一天將MCF-7細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×105個細(xì)胞/孔，每孔加入培養(yǎng)液0.5mL。24小時后，細(xì)胞長至覆蓋培養(yǎng)孔底面積約50-60％時，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。在EP管中配制下述溶液溶液A0.8μg DNA(cyclinD1報告基因質(zhì)粒200ng；內(nèi)參Renillar質(zhì)粒10ng；SIP45表達(dá)質(zhì)粒600ng或pcDNA3.1(-)空載體質(zhì)粒600ng)，溶于50μL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液。溶液B將2μL脂質(zhì)體溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到50μL無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液中。室溫靜置5分鐘。然后將溶液A、B混合，室溫靜置20分鐘。用無血清和不含雙抗的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。將上述溶液A、B的混合液中加入400μL無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混勻后加至細(xì)胞表面。每個實驗組重復(fù)3孔。37℃，5％ CO2條件下孵育4-6小時后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液取代前述培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至48小時。裂解細(xì)胞，測量熒光素酶的活性。
2)用雙熒光報告基因試劑盒測量雙熒光素酶的活性(1)裂解細(xì)胞用冷PBS清洗細(xì)胞，將1×細(xì)胞裂解液(PLB)100μL加入每個細(xì)胞培養(yǎng)孔，室溫孵育15分鐘，使細(xì)胞充分裂解。所得到的細(xì)胞裂解液可直接用于熒光測量。
(2)熒光素酶底物的配制將螢火蟲熒光素酶底物冷凍干粉溶于10mL熒光素酶分析緩沖液中，所得溶液為LARII，分裝，-70℃保存。用Stop & Glo緩沖液將50×海三色堇熒光素酶底物稀釋到1×，所得溶液為Stop& Glo，現(xiàn)用現(xiàn)配。
(3)測量過程將20μL細(xì)胞裂解液放入96孔熒光測量板，加入100μLLARII，測量螢火蟲熒光素酶，測量條件為延遲2秒，測量10秒。再加入100μL Stop & Glo，測量海三色堇熒光素酶，測量條件同上。參看圖6，SIP45對cyclinD1啟動子啟動熒光素酶表達(dá)起抑制作用。
SIP基因[1].ST25SEQUENCE LISTING<110>北京大學(xué)<120>SIP45基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1164<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(16)..(777)<223>
<400>1ctgccctagt ggcct atg tcc ctt gct cgg ggc cat gga gac act gcg gcc 51Met Ser Leu Ala Arg Gly His Gly Asp Thr Ala Ala1 5 10agt acg gcg gcg cct ctg tct gaa gaa ggg gaa gtg acc tcc ggc ctc99Ser Thr Ala Ala Pro Leu Ser Glu Glu Gly Glu Val Thr Ser Gly Leu15 20 25cag gct ctg gcc gtg gag gat acc gga ggc ccc tct gcc tcg gcc ggt 147Gln Ala Leu Ala Val Glu Asp Thr Gly Gly Pro Ser Ala Ser Ala Gly30 35 40aag gcc gag gac gag ggg gaa gga ggc cga gag gag acc gag cgt gag 195Lys Ala Glu Asp Glu Gly Glu Gly Gly Arg Glu Glu Thr Glu Arg Glu45 50 55 60ggg tcc ggg ggc gag gag gcg cag gga gaa gtc ccc agc gct ggg gga 243Gly Ser Gly Gly Glu Glu Ala Gln Gly Glu Val Pro Ser Ala Gly Gly65 70 75gaa gag cct gcc gag gag gac tcc gag gac tgg tgc gtg ccc tgc agc 291Glu Glu Pro Ala Glu Glu Asp Ser Glu Asp Trp Cys Val Pro Cys Ser80 85 90gac gag gag gtg gag ctg cct gcg gat ggg cag ccc tgg atg ccc ccg 339Asp Glu Glu Val Glu Leu Pro Ala Asp Gly Gln Pro Trp Met Pro Pro95 100 105ccc tcc gaa atc cag cgg ctc tat gaa ctg ctg gct gcc cac ggt act 387Pro Ser Glu Ile Gln Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ala Ala His Gly Thr110 115 120ctg gag ctg caa gcc gag atc ctg ccc cgc cgg cct ccc acg ccg gag 435Leu Glu Leu Gln Ala Glu Ile Leu Pro Arg Arg Pro Pro Thr Pro Glu125 130 135 140gcc cag agc gaa gag gag aga tcc gat gag gag ccg gag gcc aaa gaa 483Ala Gln Ser Glu Glu Glu Arg Ser Asp Glu Glu Pro Glu Ala Lys Glu145 150 155gag gaa gag gaa aaa cca cac atg ccc acg gaa ttt gat ttt gat gat 531Glu Glu Glu Glu Lys Pro His Met Pro Thr Glu Phe Asp Phe Asp Asp160 165 170gag cca gtg aca cca aag gac tcc ctg att gac cgg aga cgc acc cca 579Glu Pro Val Thr Pro Lys Asp Ser Leu Ile Asp Arg Arg Arg Thr Pro175 180 185gga agc tca gcc cgg agc cag aaa cgg gag gcc cgc ctg gac aag gtg 627Gly Ser Ser Ala Arg Ser Gln Lys Arg Glu Ala Arg Leu Asp Lys Val190 195 200
SIP基因[1].ST25ctg tcg gac atg aag aga cac aag aag ctg gag gag cag atc ctt cgt 675Leu Ser Asp Met Lys Arg His Lys Lys Leu Glu Glu Gln Ile Leu Arg205 210 215 220acc ggg agg gac ctc ttc agc ctg gac tcg gag gac ccc agc ccc gcc 723Thr Gly Arg Asp Leu Phe Ser Leu Asp Ser Glu Asp Pro Ser Pro Ala225 230 235agc ccc cca ctc cga tcc tcc ggg agt agt ctc ttc cct cgg cag cgg 771Ser Pro Pro Leu Arg Ser Ser Gly Ser Ser Leu Phe Pro Arg Gln Arg240 245 250aaa tac tgattcccac tgctcctgcc tctagggtgc agtgtccgta cctgctggag827Lys Tyrcctgggccct ccttccccag cccagacatt gagaaacttg ggaagaagag agaaacctca 887agctcccaaa cagcacgttg cgggaaagag gaagagagag tgtgagtgtg tgtgtgtgtt 947ttttctattg aacacctgta gagtgtgtgt gtgtgttttc tattgaacac ctatagagag1007agtgtgtgtg ttttctattg aacatctata tagagagagt gtgtgagtgt gtgttttcta1067ttgaacacct attcagagac ctggactgaa ttttctgagt ctgaaataaa agatgcagag1127ctatcatctc ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1164<210>2<211>254<212>PRT<213>人<400>2Met Ser Leu Ala Arg Gly His Gly Asp Thr Ala Ala Ser Thr Ala Ala1 5 10 15Pro Leu Ser Glu Glu Gly Glu Val Thr Ser Gly Leu Gln Ala Leu Ala20 25 30Val Glu Asp Thr Gly Gly Pro Ser Ala Ser Ala Gly Lys Ala Glu Asp35 40 45Glu Gly Glu Gly Gly Arg Glu Glu Thr Glu Arg Glu Gly Ser Gly Gly50 55 60Glu Glu Ala Gln Gly Glu Val Pro Ser Ala Gly Gly Glu Glu Pro Ala65 70 75 80Glu Glu Asp Ser Glu Asp Trp Cys Val Pro Cys Ser Asp Glu Glu Val85 90 95Glu Leu Pro Ala Asp Gly Gln Pro Trp Met Pro Pro Pro Ser Glu Ile100 105 110Gln Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ala Ala His Gly Thr Leu Glu Leu Gln115 120 125Ala Glu Ile Leu Pro Arg Arg Pro Pro Thr Pro Glu Ala Gln Ser Glu130 135 140Glu Glu Arg Ser Asp Glu Glu Pro Glu Ala Lys Glu Glu Glu Glu Glu145 150 155 160
SIP基因[1].ST25Lys Pro His Met Pro Thr Glu Phe Asp Phe Asp Asp Glu Pro Val Thr165 170 175Pro Lys Asp Ser Leu Ile Asp Arg Arg Arg Thr Pro Gly Ser Ser Ala180 185 190Arg Ser Gln Lys Arg Glu Ala Arg Leu Asp Lys Val Leu Ser Asp Met195 200 205Lys Arg His Lys Lys Leu Glu Glu Gln Ile Leu Arg Thr Gly Arg Asp210 215 220Leu Phe Ser Leu Asp Ser Glu Asp Pro Ser Pro Ala Ser Pro Pro Leu225 230 235 240Arg Ser Ser Gly Ser Ser Leu Phe Pro Arg Gln Arg Lys Tyr245 250
權(quán)利要求
1.可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖的蛋白，該蛋白具有序列表中序列SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者通過所述氨基酸序列中的一個或多個氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1的蛋白的基因，它是具有序列表中序列SEQ IDNo.1所示的堿基序列的DNA或者與所述DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA。
3.含有權(quán)利要求2的基因或者編碼權(quán)利要求1的蛋白的基因的表達(dá)載體。
4.由權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
5.生產(chǎn)權(quán)利要求1的蛋白的方法，該方法包括下列步驟培養(yǎng)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生本發(fā)明的重組蛋白；和從培養(yǎng)物中分離出重組蛋白。
6.針對權(quán)利要求1的蛋白的抗體，它是使用所述重組蛋白作為免疫原而產(chǎn)生的特異性抗體。
7.檢測所述蛋白的試劑盒，它含有權(quán)利要求6的特異性抗體，可以進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，用于檢測具有序列SEQ ID No.2所示的蛋白。
8.用于檢測序列SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的探針診斷試劑盒，它含有與核苷酸序列SEQ ID No.1中的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求1的蛋白或權(quán)利要求2的基因在制備治療腫瘤，尤其乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的藥物中的用途。
10.含有權(quán)利要求1的蛋白和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及SIP45基因，該基因編碼的SIP45蛋白，以及所述基因和蛋白在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK101058603SQ20061007627
公開日2007年10月24日 申請日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者尚永豐, 梁靜, 張華 申請人:北京大學(xué)