專利名稱：固定化酶生物催化劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酶生物催化劑，特別涉及一種以二氧化硅為載體的固定化酶生物催化劑及其制備方法，以及在催化水解青霉素鉀鹽反應(yīng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酶催化工藝已成功地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥品、農(nóng)業(yè)化學(xué)品的生產(chǎn)，并且越來越多地應(yīng)用于有機化學(xué)合成領(lǐng)域。但是酶催化法在實際應(yīng)用中存在酶脫離其自然環(huán)境后，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等問題，且大多數(shù)酶是水溶性的，酶溶于水后將污染產(chǎn)品，也難以回收利用。酶的固定化(Enzymatic Immobilization)是克服以上問題最成功的方法。如固定化青霉素?；?Immobilized Penicillin Acylase)，用于裂解青霉素生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸(6-APA)的工藝顯示出很大優(yōu)越性。它不僅能克服可溶性酶或菌體在使用時穩(wěn)定性差、不易回收、不能反復(fù)使用的缺點，而且由于此工藝不會將蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)帶入產(chǎn)物，簡化了提純工藝、提高了產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。同時固定化青霉素?；高€具有催化水解和合成青霉素及頭孢霉素的能力。由于不同的酶具有不同的性質(zhì)和組成，底物和產(chǎn)物的性質(zhì)不同，以及產(chǎn)物的用途不同，因此對各種酶采用的載體和固定化方法不盡相同，其中載體材料的選擇與制備是技術(shù)的關(guān)鍵，優(yōu)異的載體可以提高固定化酶的催化性能，降低酶法生產(chǎn)的成本。
目前，已產(chǎn)業(yè)化的固定化酶多以有機聚合物作為載體，這些固定化載體很少能夠重復(fù)利用，存在材料的后處理及廢載體的閑置問題。Singh等[Curr Sci 1988；57(22)1229-1231]以瓊脂-聚丙烯酰胺樹脂為載體，采用雙吸附工藝固定從E.coli NCIM2563提取的青霉素?；?。藻酸鹽類和聚丙烯酰胺載體在其它方面的應(yīng)用取得了一定的成功，但是它們并不適用于固定青霉素酰化酶，因為磷酸鹽緩沖液的使用使得這類載體穩(wěn)定性下降。
無機載體較有機載體存在著較大的經(jīng)濟優(yōu)勢，其較高的機械強度更有利于在生物反應(yīng)器中進行工業(yè)生產(chǎn)。無機載體有二氧化硅和功能化硅烷的溶膠—凝膠、陶瓷、高嶺土和大孔玻璃，見[Appl.Clay Sci.2005，29，111-126；J.Membrane Sci.2004，241，161-166；Current Appl.Physics 2003，3，129-133]。但這些載體受載體材料孔徑、比表面積、顆粒粒度等因素的限制，酶在載體上的包覆量一般不高；分子擴散阻力較大，影響底物和酶的有效接觸，影響產(chǎn)物及時脫離反應(yīng)體系而降低了酶的催化活性；并且有些載體與酶分子結(jié)合力較弱，固定化酶在重復(fù)使用過程中，酶很容易從載體上脫落流失，因而也限制了其工業(yè)應(yīng)用。
介孔材料作為酶的固定化載體是最熱門的研究對象，其中各種介孔材料由于其本身具有的較大孔徑、高比表面積、較小擴散阻力，且孔道表面富含羥基功能基團而表現(xiàn)出優(yōu)異的固定化性能。其中，二氧化硅系列材料因其具有強的物理、機械、化學(xué)性能以及較強的有機物和生物耐受性，更是引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和研究。目前文獻報道的有序納米介孔二氧化硅的可控孔徑為20-500，比表面積高達500-1000m2/g，介孔二氧化硅材料MCM-41[J.Mol.Catal.B.2000，11，45-53]、SBA[Micropor.Mecropor.Mater.2001，44/45，755-762]、FSM[J.Am.Chem.Soc.2002，124，1142-1149]被報道用于酶的固定化研究，J.He[J.Mol.Catal.B.2000，11，45-53]等人發(fā)現(xiàn)青霉素?；冈谳d體二氧化硅分子篩MCM-41上具有高的負(fù)載量，他們采用了兩種固定化方法一種是物理吸附法也稱為直接固定化法；另一種是共價交聯(lián)法(戊二醛為交聯(lián)劑)。研究結(jié)果表明通過物理吸附法制備的固定化酶的活性是共價交聯(lián)法制備的固定化酶的5倍，但是在使用過程中吸附在載體上的酶容易脫落。通過交聯(lián)劑和偶聯(lián)劑對載體表面的修飾作用可以增強酶和載體之間的作用力，保證酶的有效吸附，又可以減少酶分子的脫落，從而延長固定化酶的使用壽命。研究表明載體材料的形貌、表面特性、孔徑和孔結(jié)構(gòu)影響酶的有效負(fù)載。本申請人(北京化工大學(xué))申請的中國專利CN1445311A和CN1511785A公開了以納米碳酸鈣為模板，以硅酸鈉為硅源，通過反應(yīng)在碳酸鈣表面包覆二氧化硅，并根據(jù)碳酸鈣的顆粒大小和形狀來調(diào)控，制備出球狀、管狀等不同形狀的空心二氧化硅介孔材料，該材料不僅具有介孔分子篩的優(yōu)點，其獨有的空心結(jié)構(gòu)可以大大提高負(fù)載能力，還可以通過選擇不同的載體形狀，滿足不同催化反應(yīng)活性組分分布的要求，在催化劑領(lǐng)域有廣泛的開發(fā)潛力，如中國專利(申請?zhí)?00510085389.5)針對加氫催化反應(yīng)活性中心的分布要求，提出利用這種空心二氧化硅介孔材料為載體，在其壁上負(fù)載金屬活性組分，得到活性組分呈蛋殼型分布的金屬催化劑及制備方法，提高了金屬活性的利用率。除此之外，本申請人對該材料的應(yīng)用進行了系列研究，以該空心二氧化硅介孔材料為載體，制備新的固定化酶生物催化劑是本發(fā)明的任務(wù)，具有廣闊的開發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種以管狀空心SiO2介孔材料為載體的固定化酶生物催化劑及其制備方法，該催化劑具有良好的酶活性中心分散性，較高的酶催化活性和儲存、操作穩(wěn)定性；該制備方法有效的提高了載體對酶的固定化性能、使酶分子能分散在管狀空心SiO2的外表面、內(nèi)表面以及壁內(nèi)微孔中，改善酶的催化活性；本發(fā)明的另一目的是以管狀空心SiO2介孔材料為載體固定青霉素?；覆?yīng)用于青霉素鉀鹽的水解反應(yīng)。
本發(fā)明的生物催化劑在二氧化硅載體上固定有生物酶，其中所述載體是管狀空心二氧化硅介孔顆粒，在管狀空心二氧化硅介孔顆粒的外表面、內(nèi)表面以及壁內(nèi)微孔中固定有生物酶分子。以固定化酶制劑重量百分比為基準(zhǔn)，其組成為0.01％～10.00％的生物酶、80.00％～99.99％管狀空心結(jié)構(gòu)二氧化硅載體，0～10.00％的偶聯(lián)劑或/和交聯(lián)劑。
所述的生物酶是公知的適宜二氧化硅作載體的各種酶，如蛋白酶、淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、?；被崴饷?、L-天冬酰胺酶、青霉素酰化酶、天冬氨酸酶、多核苷酸磷酸化酶、右旋醣酐酶、細(xì)胞壁溶解酶、辣根過氧化物酶或乙酰膽堿脂酶中的一種或幾種；所述的具有空心結(jié)構(gòu)SiO2介孔顆粒載體，是由中國發(fā)明專利申請公布說明書CN 1511785A中公開的方法制備而成的。本發(fā)明催化劑則選用其中管狀結(jié)構(gòu)，具有較大的孔容和比表面積，并在壁內(nèi)有排列規(guī)則的微小孔道的SiO2顆粒為載體，管狀空心SiO2顆粒的比表面積為200～1000m2/g，優(yōu)選為500～800m2/g；孔容為0.1～1.0mL/g，優(yōu)選為0.4～0.8mL/g；平均直徑為20～600nm，優(yōu)選為80～250nm，平均長度為1～10μm，優(yōu)選為2～8μm。
本發(fā)明生物催化劑的制備方法是以管狀空心二氧化硅介孔顆粒材料為載體，采用物理吸附法或載體表面改性后的共價鍵連接法制備固定化酶制劑。
物理吸附法，依次包括如下步驟將管狀空心二氧化硅載體和至少一種結(jié)晶酶或溶液酶加入到去離子水、醋酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹵化物的溶液中，并與之充分混合，溫度控制在0～50℃；負(fù)載結(jié)束后進行洗滌，過濾，冷凍干燥1～6h。這種通過簡單物理吸附法制備的固定化酶的酶活回收率較高，而且能很好地維持酶分子的三維結(jié)構(gòu)。
共價鍵連接法，依次包括如下步驟將偶聯(lián)劑或/和交聯(lián)劑加入到管狀空心SiO2載體的膠體溶液中，并與之充分?jǐn)嚢?，攪拌速度控制?00～600r/min，維持體系的pH值在8～10之間，攪拌時間為12～24h；載體表面改性后進行洗滌，過濾，然后以5～10℃/min升溫到50～80℃，干燥；改性后的粉體和至少一種結(jié)晶酶或溶液酶加入到的去離子水、醋酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹵化物的溶液中，控制pH值在5～8之間，并與之充分混合，溫度控制在0～50℃；負(fù)載結(jié)束后進行洗滌，過濾，冷凍干燥1～6h；將干燥后的粉體保存在冰柜內(nèi)備用。
所述的偶聯(lián)劑選自溴化氰、均三氯三嗪、酰肼、硫芥子氣和鈦、錫、鋅、釩及鐵的氯化物中的一種或幾種；偶聯(lián)劑的作用是對載體材料的表面處理增強酶分子與載體之間的粘結(jié)性能，從而增大酶在載體上的吸附量。
所述的交聯(lián)劑選自戊二醛、二重氮聯(lián)苯胺-2，2’-二磺酸、4，4’-二氟-3，3’-二硝基二苯砜、1，5’-二氟-2，4’-二硝基苯、甲苯-2-異氰酸-異硫氰酸鹽中的一種或幾種。交聯(lián)劑是含有雙功能基團的試劑，它的一種功能基團能與載體材料形成較強共價鍵結(jié)合，有效地降低了酶分子從載體上脫落。而另一功能基團又能和酶分子的氨基或羧基形成牢固的共價結(jié)合，較強的作用力可能影響到酶分子的三維結(jié)構(gòu)，從而使酶分之失去活性。因此偶聯(lián)劑和交聯(lián)劑的用量應(yīng)該控制在以固定化酶制劑重量百分比為基準(zhǔn)的10.00％以內(nèi)。
上述空心管狀結(jié)構(gòu)的SiO2載體是按照CN 1511785A中公開的納米CaCO3/SiO2復(fù)合材料制備方法得到的。以針狀碳酸鈣為模板，以正硅酸乙酯/硅酸鈉為硅源，在堿性條件下，加入一定量的表面活性劑，正硅酸乙酯發(fā)生水解反應(yīng)，并在碳酸鈣的表面包覆一層SiO2。同時還可以根據(jù)針狀碳酸鈣的顆粒大小、加入正硅酸乙酯的量和加入表面活性劑的量來調(diào)控管狀空心二氧化硅的顆粒大小、壁厚和壁內(nèi)微孔的大小。優(yōu)選采用平均直徑20～400nm，長徑比為10～15左右，CaCO3粒子中文石相含量為88.75％的納米針狀CaCO3微粒作無機模板，最終制備得到管狀空心SiO2顆粒的比表面積為200～1000m2/g，孔容為0.1～1.0mL/g，平均直徑為20～600nm，平均長度為1～10μm的載體材料。
用本發(fā)明以管狀空心二氧化介孔顆粒為載體固定青霉素?；傅拇呋瘎?yīng)用于青霉素鉀的水解工藝，按照青霉素鉀的水解的常規(guī)方法操作，催化劑用量以重量份數(shù)計，是青霉素鉀的1-3倍，水解反應(yīng)溫度4～70℃，pH控制在5.0～9.0，獲得藥物中間體6-APA。
本發(fā)明固定化酶生物催化劑的應(yīng)用不限于上述固定青霉素酰化酶在水解工藝，還涉及固定其他各種(如前所例舉)生物酶，用于不同的領(lǐng)域，如在蛋白脫糖、全蛋脫糖、糖尿試紙、食品的除氧、微型生物傳感器中以及在抗菌和滅菌工藝中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)效果1、本發(fā)明的固定化酶生物催化劑，以具有空心管狀結(jié)構(gòu)的SiO2為載體，在空心管狀結(jié)構(gòu)SiO2載體的管內(nèi)、外壁面、壁微孔內(nèi)負(fù)載有酶分子，因此，很容易實現(xiàn)酶活性中心在載體上的分布，并能充分發(fā)揮酶活性中心的催化活性，而且能大大減少酶的用量，能有針對性地應(yīng)用于液-固非均相酶催化反應(yīng)體系；2、本發(fā)明的制備方法，使酶分子能分散在管狀空心SiO2的外表面、內(nèi)表面以及壁內(nèi)微孔中，改善酶的催化活性；有效的提高了載體對酶的固定化性能、實現(xiàn)了溶液酶固定化后的重復(fù)利用，大大降低酶制劑的使用成本；3、本發(fā)明的催化劑制備的固定青霉素?；复呋瘎┩杂汕嗝顾仵；副容^固定化青霉素?；傅淖钸mpH(8.5)偏向中性，自由青霉素?；缸钸mpH(9.0)，而且同樣的酶活性要求條件下，固定化青霉素?；妇哂懈鼘挼膒H范圍；固定化青霉素?；傅淖钸m溫度為51℃，而自由青霉素酰化酶的最適溫度為43℃，最適溫度的提高將有利于該種酶的工業(yè)化應(yīng)用；通過自由酶和固定化酶儲存穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)固定化酶在4℃保存100天，保留酶活性為86％，而在同樣條件下，自由酶的保留酶活性不足66％。因此本發(fā)明固定青霉素酰化酶催化劑用于青霉素鉀鹽的水解反應(yīng)，可以提高催化水解和合成青霉素及頭孢霉素的能力。


圖1是用于制備本發(fā)明催化劑載體的針狀碳酸鈣模板的TEM照片。
圖2是針狀碳酸鈣模板的XRD圖譜。
圖3是本發(fā)明管狀空心二氧化硅載體的TEM照片。
圖4是本發(fā)明固定化酶生物催化劑的TEM照片。
圖5是管狀空心二氧化硅、青霉素?；负凸潭ɑ干锎呋瘎┑腇T-IR比較圖譜，圖中曲線1為管狀空心二氧化硅圖譜，曲線2為青霉素?；笀D譜。曲線3為固定化青霉素?；笀D譜。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的制備方法進行詳細(xì)描述1、物理吸附法制備本發(fā)明的催化劑將一定重量的針狀CaCO3微粒加入到50～200mL去離子水中，超聲裝置進行分散，再加入10～50mL的乙醇和0.01-3g表面活性劑，充分?jǐn)嚢?5～30分鐘；然后將一定量的正硅酸乙酯緩慢滴加到混合溶液中，陳化2～3h，過濾，用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次，干燥，煅燒，用鹽酸溶解除去模板CaCO3，最終制得管狀空心SiO2介孔材料載體，備用；以固定化酶生物催化劑重量百分比為基準(zhǔn)，將80.00％～99.99％的管狀空心結(jié)構(gòu)二氧化硅的載體材料和0.01％～10.00％的至少一種結(jié)晶酶或溶液酶加入到的去離子水、醋酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹵化物的溶液中，并與之充分混合，控制pH值在5～8之間，溫度控制在0～50℃；負(fù)載結(jié)束后進行洗滌，過濾，冷凍干燥；將干燥后的粉體保存在冰柜內(nèi)備用。
2、載體表面改性后的共價鍵連接法制備本發(fā)明催化劑第一種將一定量的偶聯(lián)劑選自溴化氰、均三氯三嗪、酰肼、硫芥子氣和鈦、錫、鋅、釩及鐵的氯化物中的一種或幾種加入到管狀空心SiO2載體的膠體溶液中，并與之充分?jǐn)嚢?，攪拌速度控制?00～600r/min，維持體系的pH值在8～10之間，攪拌時間為2～8h；載體表面改性后進行洗滌，過濾，然后以5～10℃/min升溫到50～80℃，干燥；將改性后的粉體和至少一種結(jié)晶酶或溶液酶加入到的去離子水、醋酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹵化物的溶液中，控制pH值在5～8之間，并與之充分混合，溫度控制在0～50℃；負(fù)載結(jié)束后進行洗滌，過濾，冷凍干燥；將干燥后的粉體保存在冰柜內(nèi)備用，其中以固定化酶生物催化劑重量百分比為基準(zhǔn)，管狀空心結(jié)構(gòu)二氧化硅的載體材料為80.00％～99.99％，生物酶為0.01％～10.00％，偶聯(lián)劑在10.00％以內(nèi)。
第二種將一定量的交聯(lián)劑選自戊二醛、二重氮聯(lián)苯胺-2，2’-二磺酸、4，4’-二氟-3，3’-二硝基二苯砜、1，5’-二氟-2，4’-二硝基苯、甲苯-2-異氰酸-異硫氰酸鹽中的一種或幾種加入到管狀空心SiO2載體的水/磷酸緩沖溶液中，并與之充分?jǐn)嚢?，攪拌速度控制?00～600r/min，維持體系的pH值在8～10之間，攪拌時間為12～24h；載體表面改性后進行洗滌，過濾，然后以5～10℃/min升溫到50～80℃，干燥；改性后的粉體和至少一種結(jié)晶酶或溶液酶依次加入到的去離子水、醋酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹵化物的溶液中，控制pH值在5～8之間，并與之充分混合，溫度控制在0～50℃；負(fù)載結(jié)束后進行洗滌，過濾，冷凍干燥1～6h；將干燥后的粉體保存在冰柜內(nèi)備用，其中以固定化酶生物催化劑重量百分比為基準(zhǔn)，管狀空心結(jié)構(gòu)二氧化硅的載體材料為80.00％～99.99％，生物酶為0.01％～10.00％，交聯(lián)劑在10.00％以內(nèi)。
第三種將上述第二、三種方法中所述的一種或幾種偶聯(lián)劑和交聯(lián)劑依次加入到管狀空心SiO2載體的膠體溶液中，并與之充分?jǐn)嚢瑁瑪嚢杷俣瓤刂圃?00～600r/min，維持體系的pH值在8～10之間，攪拌時間為12～24h；載體表面改性后進行洗滌，過濾，然后以5～10℃/min升溫到50～80℃，干燥；改性后的粉體和至少一種結(jié)晶酶或溶液酶加入到的去離子水、醋酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹵化物的溶液中，控制pH值在5～8之間，并與之充分混合，溫度控制在0～50℃；負(fù)載結(jié)束后進行洗滌，過濾，冷凍干燥1～6h；將干燥后的粉體保存在冰柜內(nèi)備用，其中以固定化酶生物催化劑重量百分比為基準(zhǔn)，管狀空心結(jié)構(gòu)二氧化硅的載體材料為80.00％～99.99％，生物酶為0.01％～10.00％，交聯(lián)劑和偶聯(lián)劑在10.00％以內(nèi)。
本發(fā)明的方法制備固定青霉素酰化酶的生物催化劑，以及該催化劑用于青霉素鉀鹽的水解工藝，制備藥物中間體6-APA以管狀空心二氧化硅介孔顆粒為載體，按照上述的方法負(fù)載青霉素?；福频霉潭ㄓ星嗝顾仵；傅纳锎呋瘎?，將該催化劑應(yīng)用于常規(guī)的青霉素鉀鹽的水解工藝，催化劑用量以重量份數(shù)計，是青霉素鉀的1-3倍，反應(yīng)溫度40～60℃，Ph5～8，青霉素鉀鹽溶液的濃度為4％(W/W)。用以下方法測試活性取100mL4％(W/W)的青霉素鉀溶液于燒杯中攪拌，加入100mLpH＝7.5的0.1mol/l磷酸緩沖溶液于30℃恒溫，用0.25mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液至pH＝8.00，加入準(zhǔn)確稱取的固定化相酶樣品，開始計時，同時用0.25mol/L的NaOH溶液滴定維持pH＝8.00±0.1，記錄反應(yīng)前5分鐘的耗堿量，整理數(shù)據(jù)計算出固定化酶的活性可達2000U/g。
本發(fā)明固定化酶生物催化劑的應(yīng)用不限于上述固定青霉素?；冈谒夤に?，還涉及固定其他各種(如前所例舉)生物酶，用于不同的領(lǐng)域，如固定蛋白酶在蛋白脫糖、全蛋脫糖、糖尿試紙的應(yīng)用，固定葡萄糖氧化酶在食品的除氧、微型生物傳感器中的應(yīng)用；在抗菌和滅菌等領(lǐng)域中的應(yīng)用等。
以下通過實施例對本發(fā)明的實施進一步說明，但是本發(fā)明不應(yīng)限于這些實施例，還應(yīng)包括在不偏離本發(fā)明范圍條件下，對公開的方法進行本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見各種改變。
實施例1本實施例是制備載體的針狀碳酸鈣模板稱取一定質(zhì)量的工業(yè)級生石灰，投入到7～8倍于生石灰質(zhì)量、溫度為70℃左右的熱水中，消化一段時間，待冷卻后分別用80目和250目的標(biāo)準(zhǔn)篩過濾一遍，得到精制的Ca(OH)2懸浮液，然后用已經(jīng)標(biāo)定的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其中Ca(OH)2的濃度，然后用配制好的Ca(OH)2懸浮液進行碳化反應(yīng)，在本實驗中，氣相(CO2氣體)持續(xù)通入，液相循環(huán)流動，與氣相在旋轉(zhuǎn)填充床中接觸并進行反應(yīng)。碳化反應(yīng)具體步驟如下(1)調(diào)溫旋轉(zhuǎn)填充床和攪拌釜均設(shè)有夾套，反應(yīng)體系的溫度通過控制流過夾套的循環(huán)水的溫度來控制。在實驗前需將循環(huán)水溫度控制到預(yù)設(shè)反應(yīng)溫度；(2)加料安裝酸度計電極，開啟旋轉(zhuǎn)填充床，量取4L精制后的Ca(OH)2懸浮液加入到攪拌釜中，開啟料液泵使料液在管路中循環(huán)流動同時與循環(huán)水換熱到達反應(yīng)溫度；(3)反應(yīng)待體系溫度達到設(shè)定值并趨于穩(wěn)定之后，加入添加劑(晶型控制劑)，循環(huán)5分鐘，開始進氣，同時開始計時，當(dāng)pH下降到低于7時，反應(yīng)結(jié)束，停止進氣，循環(huán)一段時間至pH值基本無變化，取出CaCO3漿液；(4)旋轉(zhuǎn)床的清洗在取出CaCO3漿液之后，依次用自來水、稀硝酸溶液、自來水清洗反應(yīng)裝置，清洗完畢后關(guān)閉料液泵，關(guān)閉旋轉(zhuǎn)填充床和攪拌釜電機，取下酸度計電極。接著進行產(chǎn)品后處理；將所得CaCO3漿料過濾后在電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥24小時，溫度設(shè)定為100℃，得到針狀CaCO3干粉，其中紋石相含量為88.75％，將所得針狀CaCO3干粉作比表面積測試，測得其比表面積為22.16m2/g。圖1是針狀碳酸鈣的TEM照片。圖2是針狀碳酸鈣粉體的文石相晶型含量測定的XRD圖譜。
實施例2將實施例1制備的主要含有紋石相晶型的針狀碳酸鈣配制成濃度為0.8mol/L的懸浮液，取200mL納米碳酸鈣懸浮液置于反應(yīng)器中，并開始加熱升溫和攪拌，攪拌速度控制在400～500r/min；配制濃度為0.68mol/L的硅酸鈉溶液500mL和10wt％的稀鹽酸溶液。在溫度升到80℃時，開始滴加硅酸鈉溶液，同時加入稀鹽酸，調(diào)節(jié)體系的pH在8.5～9.5之間，生成CaCO3/SiO2核—殼結(jié)構(gòu)材料。待硅酸鈉溶液全部滴加到體系中后，停止加酸，并在此反應(yīng)溫度下攪拌陳化，陳化時間控制在4h，以便使得SiO2在CaCO3表面沉積、固化。陳化后的漿料經(jīng)過過濾、洗滌，在105℃下干燥12h，然后在馬弗爐內(nèi)煅燒，升溫速度4℃/min，煅燒溫度600～700℃，煅燒時間6h。經(jīng)過煅燒后的粉體，用20wt％的稀鹽酸500mL溶解，去除CaCO3模板，并在pH值小于1的情況下溶解12h；最后經(jīng)過乙醇和去離子水洗滌數(shù)次、過濾，在105℃下干燥，即得到管狀空心二氧化硅顆粒。管狀空心二氧化硅顆粒的比表面積為200～1000m2/g，平均直徑為80-250nm，孔容為0.3～1.0mL/g，平均孔徑為1-10nm，平均長度為1～10μm。
實施例3將針狀碳酸鈣配制成濃度為0.8mol/L的懸浮液，取200mL碳酸鈣懸浮液置于反應(yīng)器中，進行攪拌，攪拌速度控制在400～500r/min；按照SiO2/CaCO3質(zhì)量比為0.2的比例稱取5.35g的正硅酸乙酯(含Si質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28％)，并用乙醇溶解，將正硅酸乙酯的乙醇溶液加入到碳酸鈣漿料中，再加入20mL的17wt％的濃氨水，在室溫下攪拌3h，反應(yīng)后的漿料經(jīng)過過濾、洗滌，在105℃下干燥12h，粉碎后在馬弗爐內(nèi)煅燒，升溫速度4℃/min，煅燒溫度600～700℃，煅燒時間6h。經(jīng)過煅燒后的粉體，用10wt％的稀鹽酸500mL溶解，去除CaCO3模板，并在pH值小于1的情況下溶解12h；最后經(jīng)過洗滌、過濾，在105℃下干燥，即得到管狀空心二氧化硅顆粒。管狀空心SiO2顆粒的比表面積為200～1000m2/g，孔容為0.1～1.0mL/g，平均直徑為20～600nm，平均長度為1～10μm。
實施例4將針狀碳酸鈣配制成濃度為0.8mol/L的懸浮液，取200mL碳酸鈣懸浮液置于反應(yīng)器中，進行攪拌，攪拌速度控制在400～500r/min；按照SiO2/CaCO3質(zhì)量比為0.2的比例稱取5.35g的正硅酸乙酯(含Si質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28％)，并用乙醇溶解，將正硅酸乙酯的乙醇溶液加入到碳酸鈣漿料中，再加入20mL的17wt％的濃氨水和0.5g十六烷基三甲基溴化氨表面活性劑，在室溫下攪拌3h，反應(yīng)后的漿料經(jīng)過過濾、洗滌，在105℃下干燥12h，粉碎后在馬弗爐內(nèi)煅燒，升溫速度4℃/min，煅燒溫度600～700℃，煅燒時間6h。經(jīng)過煅燒后的粉體，用10wt％的稀鹽酸500mL溶解，去除CaCO3模板，并在pH值小于1的情況下溶解12h；最后經(jīng)過洗滌、過濾，在105℃下干燥，即得到管狀空心二氧化硅顆粒。管狀空心SiO2顆粒的比表面積為500～800m2/g，孔容為0.4～0.8mL/g，平均直徑為80～250nm，平均長度為2～8μm。圖3是該管狀空心二氧化硅的TEM照片。
實施例5稱取實施例4制備的管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.2g青霉素?；讣尤肷鲜鰬腋∫褐?，同時開始攪拌、浸漬?？刂曝?fù)載溫度為10℃左右，攪拌時間為5h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后冷凍干燥，即得固定化青霉素酰化酶制劑。圖4是該催化劑的TEM照片，將所得固定化?；赣糜谇嗝顾剽浀乃?，其催化活性是2000U/g，最適溫度為51℃，最適pH為8.5。
實施例6稱取實施例4制備的管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.15g葡萄糖氧化酶和0.01g辣根過氧化物酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬?？刂曝?fù)載溫度為50℃左右，攪拌時間為0.5h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶組合固定化酶，可用于制備微型生物傳感器以測定血糖含量和尿糖的含量。
實施例7稱取實施例4制備的管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.1g葡萄糖氧化酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬?？刂曝?fù)載溫度為4℃左右，攪拌時間為24h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得固定化葡萄糖氧化酶，該固定化酶可用制備糖尿試紙和食品除氧。
實施例8稱取實施例3制備的管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.05g細(xì)胞壁溶解酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬。控制負(fù)載溫度為10℃左右，攪拌時間為5h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得固定化細(xì)胞壁溶解酶，該固定化酶可用于抗菌和滅菌工藝中。
實施例9
稱取實施例3制備的管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.1g纖維素酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬?？刂曝?fù)載溫度為10℃左右，攪拌時間為5h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得固定化纖維素酶，可用于纖維素的水解反應(yīng)。
實施例10稱取實施例4制備的管狀空心二氧化硅10g固體粉末，加入到200mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將5mL交聯(lián)劑戊二醛(15wt％)加入上述懸浮液中，同時開始攪拌?？刂茰囟葹?0℃左右，攪拌時間為12h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的在100℃真空干燥，即得表面改性的管狀空心二氧化硅。
實施例11稱取實施例10制備的表面改性的管狀空心二氧化硅10g固體粉末，加入到200mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將8mL對-β-硫酸脂乙砜基苯胺(5wt％)加入上述懸浮液中，同時開始攪拌?？刂茰囟葹?0℃左右，攪拌時間為24h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的在100℃真空干燥，即得含有偶聯(lián)劑活性基團表面改性的管狀空心二氧化硅。
實施例12稱取實施例10制備的表面改性管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.05青霉素?；讣尤氲缴鲜鰬腋∫褐校瑫r開始攪拌、浸漬?？刂曝?fù)載溫度為0℃左右，控制負(fù)載pH值為5，攪拌時間為1h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得固定化青霉素?；?，將此固定化青霉素?；赣糜谇嗝顾剽浰?，其催化活性為1800U/g，最適溫度為45℃，最適pH為8.8，重復(fù)使用5次未見其催化活性降低。
實施例13稱取實施例11制備的含有偶聯(lián)劑活性基團表面改性管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.1g青霉素酰化酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬?？刂曝?fù)載溫度為20℃左右，控制負(fù)載pH值為8，攪拌時間為6h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得固定化青霉素?；?。
實施例14稱取實施例11制備的含有偶聯(lián)劑活性基團表面改性管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.15g細(xì)胞壁溶解酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬。控制負(fù)載溫度為50℃左右，攪拌時間為5h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得固定化細(xì)胞壁溶解酶。
實施例15稱取實施例10制備的表面改性管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將將0.05g葡萄糖氧化酶和0.1g辣根過氧化物酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬。控制負(fù)載溫度為50℃左右，攪拌時間為5h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的復(fù)合固定化酶，可用于制備微型生物傳感器以測定血糖含量和尿糖的含量。
實施例16稱取實施例10制備的含有偶聯(lián)劑活性基團表面改性管狀空心二氧化硅2g固體粉末，加入到100mL去離子水中，超聲分散后得到管狀空心二氧化硅懸浮液，將0.1g葡萄糖氧化酶和0.05g辣根過氧化物酶加入上述懸浮液中，同時開始攪拌、浸漬。控制負(fù)載溫度為20℃左右，攪拌時間為5h，然后進行真空過濾，并經(jīng)過去離子水洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)，過濾后的冷凍干燥，即得葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的復(fù)合固定化酶。
權(quán)利要求
1.一種固定化酶生物催化劑，在二氧化硅載體上固定有生物催化酶，其特征是，所述載體是管狀空心二氧化硅介孔顆粒，在管狀空心二氧化硅載體的外表面、內(nèi)表面以及壁內(nèi)微孔中固定有生物酶分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化酶生物催化劑，其特征是，以固定化酶生物催化劑重量百分比為基準(zhǔn)的組成包括0.01％～10.00％的生物酶，80.00％～99.99％管狀空心二氧化硅載體，0～10.00％偶聯(lián)劑或/和交聯(lián)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化酶生物催化劑，其特征是，管狀空心二氧化硅介孔顆粒的比表面積為200～1000m2/g，孔容為0.1～1.0mL/g，平均直徑為40～600nm，平均長度為1～10μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化酶生物催化劑，其特征是，管狀空心二氧化硅介孔顆粒的比表面積為500～800m2/g，孔容為0.4～0.8mL/g，平均直徑為80～250nm，平均長度為2～8μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化酶生物催化劑，其特征是，生物酶選自蛋白酶、淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、?；被崴饷浮-天冬酰胺酶、青霉素?；?、天冬氨酸酶、多核苷酸磷酸化酶、右旋醣酐酶、細(xì)胞壁溶解酶、辣根過氧化物酶、乙酰膽堿脂酶中的一種或幾種。
6.一種權(quán)利要求1所述的固定化酶生物催化劑的制備方法，其特征是，該方法依次包括如下步驟將空心管狀二氧化硅載體加入到至少一種生物酶的水溶液中，并與之充分混合0.5～24h，溫度控制在4～50℃，浸埋結(jié)束后進行過濾，然后冷凍干燥。
7.一種權(quán)利要求1所述固定化酶生物催化劑的制備方法，其特征是，該方法依次包括如下步驟將偶聯(lián)劑或/和交聯(lián)劑加入到管狀空心SiO2載體的膠體溶液中，并與之充分?jǐn)嚢?，攪拌速度控制?00～600r/min，維持體系的pH值在8～10之間，攪拌時間為12～24h；載體表面改性后進行洗滌，過濾，然后以5～10℃/min升溫到50～80℃，干燥；改性后的粉體和至少一種結(jié)晶酶或溶液酶加入到的去離子水、醋酸鹽溶液、磷酸鹽緩沖溶液或鹵化物的溶液中，并與之充分混合進行酶的負(fù)載，控制pH值在5～8之間，溫度控制在0～50℃；負(fù)載結(jié)束后進行洗滌，過濾，冷凍干燥1～6h。
8.根據(jù)權(quán)利要求6、7所述的固定化酶生物催化劑的制備方法，其特征是，偶聯(lián)劑選自對-β-硫酸脂乙砜基苯胺、溴化氰、均三氯三嗪、酰肼、硫芥子氣和鈦、錫、鋅、釩及鐵的氯化物中的一種或幾種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6、7所述的固定化酶生物催化劑的制備方法，其特征是，交聯(lián)劑選自戊二醛、二重氮聯(lián)苯胺-2，2’-二磺酸、4，4’-二氟-3，3’-二硝基二苯砜、1，5’-二氟-2，4’-二硝基苯、甲苯-2-異氰酸-異硫氰酸鹽中的一種或幾種。
10.一種按照權(quán)利要求6、7制備的固定化青霉素?；干锎呋瘎?，在青霉素鉀鹽的水解制備藥物中間體6-APA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及固定化酶生物催化劑及其制備方法和應(yīng)用。該固定化酶生物催化劑以管狀空心二氧化硅介孔材料為載體，在管狀空心二氧化硅載體的外表面、內(nèi)表面以及壁內(nèi)微孔中固定有生物酶分子。該制備方法包括物理吸附包埋法或表面修飾的化學(xué)偶聯(lián)/交聯(lián)法，生物催化劑具有良好的酶分散性和高的載酶量，較高的酶活性回收率以及較低的酶流失率，重復(fù)利用率高，而且優(yōu)操作和儲存穩(wěn)定；本發(fā)明可以對青霉素?；?、葡糖糖氧化酶、過氧化物酶、細(xì)胞壁溶解酶等多種酶的固定，用于蛋白脫糖、全蛋脫糖、食品的除氧、微型生物傳感器、抗菌和滅菌等反應(yīng)。其中，固定化青霉素?；干锎呋瘎┯糜谇嗝顾剽浰夤に嚕苽渌幬镏虚g體6－APA，具有較高的催化活性。
文檔編號C12N11/00GK101058824SQ20061007633
公開日2007年10月24日 申請日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者陳建峰, 肖清貴, 陶霞 申請人:北京化工大學(xué)