專利名稱：輔助篩選高油玉米的方法及其專用數(shù)量性狀基因位點的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種篩選高油玉米的輔助方法及其專用數(shù)量性狀基因位點。
背景技術：
大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、品質(zhì)、熟期等均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點，即受許多數(shù)量基因座位(或位點)(Quantitative Trait Loci，QTLs)和環(huán)境因子的共同作用。長期以來，數(shù)量遺傳學是以統(tǒng)計推理為基礎的，即將控制數(shù)量性狀的多基因作為一個整體，通過數(shù)理統(tǒng)計學的一級和二級統(tǒng)計量來剖析描述QTLs的遺傳特征。但這無法確定控制數(shù)量性狀的QTLs的數(shù)目，更無法確定單個QTL的遺傳效應以及它們在染色體上的位置。如果能將多基因性狀分解成若干個單一的遺傳組分，則可實現(xiàn)用研究單基因的方法去研究QTLs，并進而定位乃至克隆QTLs。許多學者運用傳統(tǒng)標記在不同生物上進行了類似的研究，但由于所用的常規(guī)標記的局限性，難以實現(xiàn)對單個QTL的遺傳效應的追蹤。DNA分子標記技術及分子連鎖圖譜的迅猛發(fā)展，提供了這種可能。
微衛(wèi)星是以少數(shù)幾個核苷酸為核心單位多次串聯(lián)重復的DNA序列，是一種簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)，兩側一般是保守序列。由于它具有多態(tài)性高、共顯性、容易用PCR檢測和結果穩(wěn)定可靠等特點，因此是一種十分理想的分子標記。
普通玉米含油量為4％左右，一般5％以下。籽粒油分含量超過6％的玉米被稱之為高油玉米，高油玉米是玉米遺傳育種學家借助于先進的分析儀器，而創(chuàng)造的新型優(yōu)質(zhì)高附加值玉米(宋同明等，高油玉米前途光明，玉米科學，1997(3)73-77)。油分含量是一種重要數(shù)量性狀。國內(nèi)外在這方面開展了一些研究，取得了一定的成果。Goldman等(Goldman I.，T.R.Rocheford，J.w.Dudley，1994 Crop Sci.34908-915)研究發(fā)現(xiàn)在IHP×ILP的后代群體中，有23個QTL影響籽粒淀粉和蛋白質(zhì)含量，在13個不同的染色體臂上有25個QTL與油分含量明顯相關，這些位點常以2或2個以上位點相連鎖的形式分布于第2、4、6、8染色體長臂上。Sughroue和Rocheford發(fā)現(xiàn)在Illinois長期選擇試驗中，不同高油玉米品系(strains)中RFLP位點上等位基因頻率的變化與選擇響應一致。Berke和Rocheford(Berke T.，T.Richeford，1995 Crop Sci.351542-1549)在兩年多的時間里，用RFLP方法對IHO和ILO群體進行研究分析，發(fā)現(xiàn)了80個RFLP多態(tài)性位點中，有31個位點分布在11個染色體區(qū)間，它們與含油量顯著相關，含油量的主效QTL位于第2，5，6，9染色體；Wassom等(Theor.Appl.Genet.，2003)對IHO和B73的回交群體(BC1S1)以及與Mo17的測交群體(TCs)的研究發(fā)現(xiàn)，110個共顯性標記(38 RFLP和72 SSR)覆蓋了基因組的96.8％，相鄰標記間的平均距離為20cM。在BC1S1中，第1，3，5，6，7，8染色體上的7個QTL與油分含量相關，其中第6染色體上64cM位置上的QTL所能夠解釋油分含量變異最大，為36.7％，在TCs中，第1，3，5，3，9染色體上有6個QTL控制籽粒油分含量。Alrefai等(Alrefai R，Berke TG，&Rocheford，TR，Genome，1995，38894-901)檢測到15個RFLP位點與棕櫚酸含量相關，12個RFLP位點油酸和亞油酸含量相關，17個位點與亞麻酸含量相關，第6染色體上控制油酸和亞油酸比率的QTL與umc65緊密連鎖，在linoleic acidl(ln1)位點上。ln1，最早在IHO×R84中被證明為調(diào)控油酸和亞油酸比率的基因，位于第6染色體長臂上Yellowl(Y1)基因附近。2004年宋秀芳等(X.F.Song，T.M.Song，J.R.Dai，T.Rocheford，J.S.Li，2004Maydica 4941-48)利用BHO和B73的F2群體檢測到27個QTL與籽粒油份含量顯著相關，單個QTL所能解釋的油份含量變異為1.83％-15.8％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選高油玉米的輔助方法及其專用數(shù)量性狀基因位點。
本發(fā)明所提供的輔助篩選高油玉米的方法，是分別以待測玉米的基因組DNA和已知籽粒油分含量的高油玉米的基因組DNA為模板，用引物P-bnlg1422，和/或p-umc2313，和/或p-bnlg1188，和/或p-bnlg107進行PCR擴增，如待測玉米擴增產(chǎn)物的帶型與已知籽粒油分含量的高油玉米的帶型一致，則該待測玉米為候選高油玉米；所述P-bnlg1422是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物；所述p-umc2313是由序列表中序列3的核苷酸序列和序列4的核苷酸序列組成的一對引物；所述p-bnlg1188是由序列表中序列5的核苷酸序列和序列6的核苷酸序列組成的一對引物；所述p-bnlg107是由序列表中序列7的核苷酸序列和序列8的核苷酸序列組成的一對引物。
所述方法還包括根據(jù)高油親本籽粒顏色篩選高油玉米的步驟，如待測籽粒顏色與高油親本籽粒顏色一致，則該待測籽粒為候選高油玉米。
在實際應用中，分別以待測玉米的基因組DNA和已知籽粒油分含量的高油玉米的基因組DNA為模板，用引物P-bnlg1422，和/或p-umc2313，和/或p-bnlg1188，0和/或p-bnlg107進行PCR擴增，同時以位于該區(qū)段控制籽粒顏色(黃色或白色)的基因及其表型為另一標記(Seed color，即SC)，選擇時，可根據(jù)待測玉米擴增產(chǎn)物的帶型與已知高油玉米的帶型是否一致作出判斷，也可根據(jù)籽粒顏色或SC與分子標記(P-bnlg1422，和/或p-umc2313，和/或p-bnlg1188，和/或p-bnlg107)同時作出判斷。假設高油親本為白粒，而普通玉米為黃色籽粒，如果其后代中某個體或株系的帶型和粒色與高油親本一致，則待測玉米即為候選高油玉米。
分子標記P-bnlg1422，和/或p-umc2313，和/或p-bnlg1188，和/或p-bnlg107與表型標記，如籽粒顏色(或依據(jù)黃白粒基因位點所開發(fā)的分子標記)相結合是對高油玉米進行輔助選擇是一種最行之有效的選擇技術。
本發(fā)明所提供的與玉米油分含量相關的數(shù)量性狀基因位點，名稱為oilc6-m1，定位于玉米的第六染色體的短臂上，位于p-bnlg1422和p-umc2313兩個SSR引物位點之間，在F2∶3籽粒中與p-bnlg1422和p-umc2313的遺傳距離分別為0.8cM和16cM，在F2籽粒中與p-bnlg1422和p-umc2313的遺傳距離分別為13.4cM和1.8cM。
所述數(shù)量性狀基因位點在F2∶3籽粒中檢測的LR值為25.96，對應LOD值為5.632，可解釋13.4％的遺傳變異，加性效應為-0.78；在F2籽粒中檢測到的LR值為36.82，可解釋17.2％的遺傳變異，加性效應為-0.75。
本發(fā)明還提供了用于輔助篩選高油玉米的引物，它為由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物，和/或為由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的一對引物，和/或為由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的一對引物，和/或為由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列組成的一對引物。
第六染色體連鎖圖譜如圖1所示，包括p-umc1002、p-umc1023、p-phi075、p-umc1883、p-umc1625、p-bnlg1165、p-umc2312、p-phi423796、p-umc1229、p-bnlg1867、p-umc2056、p-bnlg391、p-umc1133、SC、p-bnlg1422、p-bnlg1188、p-bnlg107、p-umc2313、p-umc1257、p-umc1595、p-umc1979、p-umc1143、p-umc2319、p-phi129、p-umc1187、p-bnlg1732、p-umc2162、p-phi299852、p-phi123、p-umc1127、p-umc2059引物位點；位于“OcM”的SSR引物位點是p-phi129，總遺傳距離為280cM。其中SC為表型標記(Seed Color)。
實驗證明，以204個F2∶3代玉米單株的基因組DNA為模板，以p-bnlg1422(序列表中的序列1和序列2)或p-umc2313(序列表中的序列3和序列4)為引物進行PCR擴增，擴增得到的帶型與高油親本CE03005帶型的符合率為91.9％和94.2％；在F2∶3籽粒中擴增得到的帶型與高油親本CE03005帶型的符合率為84.8％和89.7％；與表型標記SC的符合率F2∶3和F3∶4中分別為91.6％和83％，說明oilc6-m1位點與控制玉米顏色的基因位點緊密連鎖，與玉米油分含量關系密切，證明oilc6-m1是與玉米油分含量相關的一個數(shù)量性狀基因位點。
在實際應用中，可以油分含量未知的高油突變體玉米后代的品系的基因組DNA為模板，用下述引物之一或其任意組合p-bnlg1422(序列表中的序列1和序列2)、p-bnlg1188(序列表中的序列5和序列6)、p-bnlg107(序列表中的序列7和序列8)、p-umc2313(序列表中的序列3和序列4)進行PCR擴增，如果擴增得到的帶型與已知的高油玉米品種帶型一致，并且其籽粒顏色與高油親本籽粒顏色相同，則該油分含量未知的玉米品系為高油品系。
可用本發(fā)明的數(shù)量性狀基因位點及其分子標記與籽粒顏色表型標記相結合進行高油玉米輔助選擇，快速準確地鑒別后代高油個體，選育高油玉米材料。本發(fā)明以玉米油分含量相關的數(shù)量性狀基因位點及其標記，以及以籽粒顏色作為表型標記，或者前兩種方法的結合進行高油玉米材料的選擇，將在高油玉米的育種和生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的輔助篩選高油玉米的方法，為選育高油玉米提供了一種快捷的選擇方法。


圖1為高油玉米第六染色體的連鎖群遺傳圖譜以及連鎖群油分QTL分析圖譜圖2為F2群體所結的種子(F3籽粒)中的黃色籽粒和白色籽粒的油分含量頻率分布3A為p-umc2313擴增15單株高油后代的驗證聚丙烯酰胺3B為p-bnlg1422擴增15單株高油后代的驗證聚丙烯酰胺3C為p-bnlg107擴增15單株高油后代的驗證聚丙烯酰胺3D為p-bnlg1188擴增15單株高油后代的驗證聚丙烯酰胺4A為p-umc2313擴增204個單株的聚丙烯酰胺電泳4B為p-bnlg1188擴增204個單株的聚丙烯酰胺電泳4C為p-bnlg1422擴增204個單株的聚丙烯酰胺電泳4D為p-bnlg107擴增204個單株的聚丙烯酰胺電泳圖
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的玉米品種(玉米品系)均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1、oilc6-m1的獲得1、準備材料以紫色莖桿、白色籽粒的高油玉米突變體CE03005(♀)為母本，籽粒油分含量為8.198％，以引自美國的普通玉米自交系B73(♂)為父本，按常規(guī)方法得到214單株的F2群體，大喇叭口期采集單株葉片，放入-70℃冰箱備用，收獲F2植株上所結出的種子(F3籽粒)，測油分含量。從F1所結的種子中隨機挑選600粒種子單粒種于農(nóng)場，收獲自交的F2所結的種子(F3籽粒)，測油分含量。將F2所結的種子在實驗站種植，完全區(qū)組設計，三次重復，小區(qū)內(nèi)混合授粉，成熟后收獲混粉的F3所結的種子，測油分含量。測定籽粒油分含量。該群體的籽粒油分含量頻率分布結果如圖2所示，表明籽粒油分含量呈正態(tài)分布，符合重組自交系群體理論分布。圖2中w為白色籽粒的分布，y為黃色籽粒的分布，oc表示油分含量。
2、基因組DNA的提取采用CTAB法提取步驟1中玉米各單株的基因組DNA。
3、SSR分析按照maizegdb網(wǎng)址(http://www.maizegdb/)上提供的玉米微衛(wèi)星序列合成下列SSR引物，其名稱分別為p-bnlg1136 p-umc1020 p-bnlg1740 p-umc2141p-umc1424 p-umc1187 p-dupssr15 p-phi364545 p-umc1063 p-umc1462p-pumc1751 p-umc2170 p-phi126 p-phi070 p-umc65 p-nc009 p-phi129p-bnlg1154 p-phi077 p-umc1127 p-umc1250 p-umc1143 p-umc2162p-nc013 p-bnlg1732 p-bnlg1617 p-umc1979 p-phi075 p-umc2314p-umc2208 p-umc2313 p-umc2319 p-umc1595 p-ylssr p-bnlg391p-umc2059p-phi299852 p-umc1792 p-umc2049 p-bnlg1189 p-bnlg2162p-umc1545 p-phi101049 p-bnlg2086 p-phi075 p-umc1553 p-phi96100p-bnlg1429 p-umc1506 p-umc2101 p-phi082 p-umc1460 p-phi057p-bnlg1185 p-umc1149 p-umc2162 p-umc1979 p-umc2314 p-phi083p-umc1294 p-umc1403 p-umc2025 p-umc2083 p-bnlg1014 p-bnlg1179p-umc1071 p-bnlg1614 p-umc1919 p-umc1122 p-umc1122 p-bnlg1057p-umc1838 p-phi423298 p-bnlg1671 p-umc2100 p-phi96100 p-phi127p-bnlg1520 p-phi104127 Phi374118 p-umc2275 p-umc2276 p-phi047p-umc1758 p-bnlg2162 p-umc1964 p-bnlg2291 p-umc2286 p-umc1532p-phi076 p-umc1308 p-umc1491 p-phi024 p-umc1365 p-umc1587p-bnlg1046 p-phi113 p-bnlg1237 p-bnlg1346 p-umc1257 p-umc1020p-umc1805 p-phi078 p-phi299852 p-phi123 p-umc1127 p-bnlg1247p-umc1983 p-umc1301 p-umc2332 p-umc1377 p-umc1460 p-phi080p-phi041 p-bnlg1064 p-umc1637 p-umc65A p-phi159819 p-phi382202p-umc1883 p-umc2010 p-umc2068 p-umc1002 p-umc1018 p-umc1023p-umc1143 p-umc1753 p-umc1996 p-umc2196 p-umc2311 p-umc2312p-umc2315 p-bnlg1047 p-bnlg107 p-bnlg1139 p-bnlg1165 p-bnlg1188p-bnlg1246 p-bnlg1371 p-bnlg1422 p-bnlg1432 p-bnlg1433 p-bnlg1641p-bnlg1753 p-bnlg1867 p-bnlg2097 p-bnlg249 p-bnlg426 p-phi423796p-umc1625 p-umc1832 p-umc2056 p-umc1195 p-umc1229 p-umc1376p-umc1517 p-umc2074 p-phi077 p-umc1133 p-umc1444 p-umc1498p-umc1186 p-umc1606 p-umc1354 p-bnlg1811 p-umc1988 p-bnlg1556p-umc1128 p-bnlg400 p-phi308707 p-umc1265 p-umc1518 p-umc1635p-umc1165 p-phi036 p-umc1012 p-umc1693 p-umc1750 p-umc1399p-phi046 p-umc1062 p-umc1164 p-umc1294 p-umc2082 p-bnlg1217p-dupssr28 p-umc1466 p-umc1180 p-umc1097 p-umc2036 p-umc1416p-umc1260 p-umc1679 p-umc1060 p-umc1990 p-umc1375 p-bnlg389p-mmc0171 p-umc2177 p-umc1695 p-umc1241 p-bnlg1792 p-phi091p-dupssr13 p-phi328175 p-umc2042 p-umc1075 p-umc1034 p-phi119p-umc1360 p-phi100175 p-umc1904 p-umc1960 p-umc1268 p-umc1673p-umc2337 p-umc1519 p-umc1094 p-umc1771 p-umc1078 p-umc2343 p-umc1657p-umc2134 p-umc1417 p-bnlg1655 p-umc2016 p-umc2180 p-umc2163p-umc2122 p-umc1196 umc1500 phi265454 p-bnlg1014 p-phi056p-umc1169 p-umc1035 p-umc2151 p-bnlg1025 p-bnlg1643 p-umc1028p-umc1755 p-umc1042 p-umc1497 p-bnlg2144 p-phi453121 p-bnlg1523p-bnlg1452 p-umc2002 p-umc1773 p-phi053 p-umc1539 p-bnlg1796p-umc1528 p-umc2277 p-bnlg1350 p-umc1915 p-bnlg1754 p-umc1757p-bnlg1937 p-nc005 p-umc1847 p-umc1332 p-umc1171 p-bnlg278 p-umc2164 p-umc1792 p-phi452693 p-umc2006 p-umc1014 p-umc1350p-bnlg398 p-phi034 p-bnlg339 p-bnlg1666 p-bnlg1863 p-umc1741 p-bnlg666p-umc1562 p-umc1997 p-umc1069 p-phi065 p-umc1494 p-umc1733p-umc1380 p-umc1319 p-umc2069 p-umc1053 p-umc1993 p-bnlg1450p-bnlg1006 p-bnlg1035 p-bnlg1083 p-bnlg1209 p-bnlg1257 p-bnlg1270p-bnlg1305 p-bnlg1306 p-bnlg1380 p-bnlg1434 p-bnlg1451 p-bnlg1484p-bnlg1496 p-bnlg1518 p-bnlg1525 p-bnlg1538 p-bnlg1597 p-bnlg1621p-bnlg1633 p-bnlg1716 p-bnlg1755 p-bnlg1805 p-bnlg1879 p-bnlg1904p-bnlg2132 p-bnlg2180 p-bnlg2291 p-bnlg2305 p-bnlg292 p-bnlg640p-mmc0271 p-MZETC34 p-nc003 p-ncO12 p-nc030 p-nc133 p-phi001 p-phi008p-phi011 p-phi026 p-phi027 p-phi029 p-phi059 p-phi062 p-phi072p-phi079 p-phi092 p-phi109188 p-phi116 p-phi118 p-phi213984p-phi265454 p-phi323152 p-phi427913 p-umc1017 p-umc1019 p-umc1029p-umc1033 p-umc1047 p-umc1061 p-umc1065 p-umc1109 p-umc1124p-umc1136 p-umc1155 p-umc1173 p-umc1178 p-umc1185 p-umc1223p-umc1232 p-umc1291 p-umc1293 p-umc1310 p-umc1336 p-umc1337 p-umc1366p-umc1464 p-umc1479 p-umc1504 p-umc1525 p-umc1545 p-umc1620 p-umc1692p-umc1710 p-umc1746 p-umc1776 p-umc1782 p-umc1829 p-umc1844 p-umc1887p-umc1888 p-umc1935 p-umc2032 p-umc2039 p-umc2043 p-umc2050 p-umc2067p-umc2081 p-umc2115 p-umc2119 p-umc2127 p-umc2142 p-umc2197 p-umc2256p-umc2372 p-umc2373。其中引物p-bnlg1422 p-bnlg1188 p-bnlg107p-umc2313的序列分別如表1所示。
表1.部分SSR引物核苷酸組成

以步驟2中提取的基因組DNA為模板，分別利用上述SSR引物進行PCR擴增。其中PCR反應體系為采用15μl反應體系，包括30ng玉米基因組DNA，各1.5μmol/L的上游引物和下游引物，2.5μmol/L dNTP，1.5μl 10×緩沖液，1U Taq酶，用超純水補足15μl。循環(huán)擴增程序為95℃預變性5分鐘，進入循環(huán)94℃變性50秒；58℃復性50秒；72℃延伸50秒；循環(huán)32次后在72℃延伸5分鐘，置于4℃下保存。擴增產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法顯示，照相，統(tǒng)計帶型。
4、數(shù)據(jù)處理將來源于親本CE03005(♀)的帶型記為1，來源于B73(♂)帶型記為2，雙親雜合帶型為3，缺失或模糊帶型記為0。利用Mapmaker/EXP3.0作圖軟件，構建分子標記連鎖圖譜。應用Group命令進行連鎖分析和分組(LOD＝3.0)，用Compare和Ripple命令進行優(yōu)化排序，錯誤檢測水平設為1％，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉化為遺傳圖距(cM)。構建的玉米遺傳圖譜如圖1所示。圖1中， 表示在F2籽粒(F1植株所結的種子)中的QTL， 表示在F2∶3籽粒中的QTL。
利用MapChart 2.1版本繪制連鎖圖譜。利用Windows QTL Cartographer V2.0進行復合區(qū)間作圖掃描農(nóng)藝性狀的QTLs，以似然比LR(Likehood Ratio)大于11.5，即對應LOD值大于2.5作為QTLs存在的閾值，并分析確定由p-bnlg1142與p-umc2313兩個引物區(qū)間得到的olic6-m1為與玉米油分含量相關的一個數(shù)量性狀基因位點。由圖可知olic6-m1定位于第六染色體，位于p-bnlg1142和p-umc2313兩個SSR引物位點之間，在F2∶3籽粒中與p-bnlg1142和p-umc2313的遺傳距離分別為0.8cM和16cM，在F2籽粒中與p-bnlg1142和p-umc2313的遺傳距離分別為13.4cM和1.8cM。
在F2∶3(F2∶3代指F2植株上的籽粒實際上是F3的籽粒，由該籽粒種植的穗行稱為F2∶3家系)籽粒中檢測的LR值為25.96(對應LOD值為5.632)，可解釋13.4％的遺傳變異，加性效應為-0.78。在F2籽粒(是F1植株結的種子)中檢測到的LR值為36.82，可解釋17.2％的遺傳變異，加性效應為-0.75。
實施例2、利用引物p-bnlg1142，和/或p-umc2313，和/或p-bnlg1188，和/或p-bnlg107輔助篩選高油玉米品種1、實驗材料包括高油親本CE03005(籽粒的油分含量為8.198％)和從高油后代中挑選的高油玉米突變體的F3∶4(F3∶4代指F3植株上的籽粒實際上是F4的籽粒所種成的家系)代的15個高油品系(籽粒的油分含量均大于6.3％，最高為9％)。
按照實施例1的方法進行以下操作提取上述玉米品種的基因組DNA，以上述玉米品種的基因組DNA為模板，分別以P-bnlg1422(序列表中的序列1和序列2)、p-umc2313(序列表中的序列3和序列4)、p-bnlg1188(序列表中的序列5和序列6)和p-bnlg107(序列表中的序列7和序列8)為引物進行PCR擴增，結果如圖3A-D(四個引物的電泳圖譜)所示，表明P-bnlg1422擴增的結果在15個高油品種品系中，共有13個擴增帶型與高油親本CE03005帶型一致，符合率為86.7％；p-umc2313擴增的結果在15個高油品種品系中，共有13個擴增帶型與高油親本CE03005帶型一致，符合率為86.7％；p-bnlg1188擴增的結果在15個高油品種品系中，有14個擴增帶型與高油親本CE03005帶型一致，符合率為93.3％；p-bnlg107擴增的結果在15個高油品種品系中，共有13個擴增帶型與高油親本CE03005帶型一致，符合率為86.7％。說明oilc6-m1位點與玉米高油突變體油分含量關系密切，證明oilc6-m1是與玉米油分含量相關的一個數(shù)量性狀基因位點。圖3A中，泳道5和6分別為普通玉米親本B73和高油親本CE03005，其余泳道為挑選的15個高油品系；圖3B中，泳道8和9分別為普通玉米親本B73和高油親本CE03005，其余泳道為挑選的15個高油品系；圖3C中，泳道13和12分別為普通玉米親本B73和高油親本CE03005，其余泳道為挑選的15個高油品系；圖3D中，泳道12和13分別為普通玉米親本B73和高油親本CE03005，其余泳道為挑選的15個高油品系。各泳道中的帶型同親本B73相同的記作1，帶型同CE03005相同的記作2，帶型二者兼具有的記作3。
2、實驗材料包括高油親本CE03005(籽粒的油分含量為8.198％)和從高油后代中挑選的高油玉米突變體的204個F2∶3代玉米單株。
以204個F2∶3代玉米單株的基因組DNA為模板，分別以P-bnlg1422(序列表中的序列1和序列2)、p-umc2313(序列表中的序列3和序列4)、p-bnlg1188(序列表中的序列5和序列6)和p-bnlg107(序列表中的序列7和序列8)為引物進行PCR擴增，結果如圖4A-D所示，圖4A表明引物P-umc2313在F2∶3籽粒中擴增得到的帶型與高油親本CE03005帶型的符合率為94.2％；圖4B表明引物P-bnlg1188在F2∶3籽粒中擴增得到的帶型與高油親本CE03005帶型的符合率為84.8％；圖4C表明引物P-bnlg1422在F2∶3籽粒中擴增得到的帶型與高油親本CE03005帶型的符合率為91.9％；圖4D表明引物p-bnlg107在F2∶3籽粒中擴增得到的帶型與高油親本CE03005帶型的符合率為89.7％；圖4A-D中泳道P為高油親本CE03005。
籽粒顏色(黃色或者白色籽粒)是輔助篩選高油玉米的一種重要表型標記。表型標記SC(籽粒顏色)與玉米油分含量的符合率(籽粒油分含量大于6％的籽粒同時籽粒顏色同親本CE03005為白色籽粒)在F2和F2∶3中分別為91.6％和83％，表型標記SC與用QTLCart運算的QTL最高峰值的遺傳距離在F2∶3籽粒中為2.0cM，在F2籽粒中為12.8cM，說明oilc6-m1位點與控制玉米顏色的基因位點緊密連鎖，與玉米油分含量關系密切。證明oilc6-m1是與玉米油分含量相關的一個數(shù)量性狀基因位點。
序列表<160>8<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gacgattaac aggtggggac20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atgatgcaaa tgaggcacaa20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cctctagtca cggttcaaag gaca24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4aaggaggatg cagtctcggt tt 22<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5attaagtaaa tgactatcta gtgtttgtcg 30<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6aatagcaagg catcagccat20<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7gcaactagaa gtagatggct tgttatgg 28<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8caacaacaag tggctggcta gggtgaa2權利要求
1.一種輔助篩選高油玉米的方法，是分別以待測玉米的基因組DNA和已知籽粒油分含量的高油玉米的基因組DNA為模板，用引物P-bnlg1422，和/或p-umc2313，和/或p-bnlg1188，和/或p-bnlg107進行PCR擴增，如待測玉米擴增產(chǎn)物的帶型與已知籽粒油分含量的高油玉米的帶型一致，則該待測玉米為候選高油玉米；所述P-bnlg1422是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物；所述p-umc2313是由序列表中序列3的核苷酸序列和序列4的核苷酸序列組成的一對引物；所述p-bnlg1188是由序列表中序列5的核苷酸序列和序列6的核苷酸序列組成的一對引物；所述p-bnlg107是由序列表中序列7的核苷酸序列和序列8的核苷酸序列組成的一對引物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括根據(jù)高油親本籽粒顏色篩選高油玉米的步驟，如待測籽粒顏色與高油親本籽粒顏色一致，則該待測籽粒為候選高油玉米。
3.一個與玉米油分含量相關的數(shù)量性狀基因位點，定位于玉米的第六染色體的短臂上，位于分子標記p-bnlg1422和p-umc2313兩個SSR引物位點之間，在F2:3籽粒中與p-bnlg1422和p-umc2313的遺傳距離分別為0.8cM和16cM，在F2籽粒中與p-bnlg1422和p-umc2313的遺傳距離分別為13.4cM和1.8cM。
4.根據(jù)權利要求3所述的數(shù)量性狀基因位點，其特征在于所述數(shù)量性狀基因位點在F2:3籽粒中檢測的LR值為25.96，對應LOD值為5.632，可解釋13.4％的遺傳變異，加性效應為-0.78；在F2籽粒中檢測到的LR值為36.82，對應LOD值為8.060，可解釋17.2％的遺傳變異，加性效應為-0.75。
5.用于輔助篩選高油玉米的引物，為由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物，和/或為由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的一對引物，和/或為由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的一對引物，和/或為由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列組成的一對引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助篩選高油玉米的方法及其專用數(shù)量性狀基因位點。該輔助篩選高油玉米的方法，是分別以待測玉米的基因組DNA和已知籽粒油分含量的高油玉米的基因組DNA為模板，用引物p－bnlg1142和/或p－umc2313和/或p－bnlg1188和/或p－bnlg107進行PCR擴增，如待測玉米擴增產(chǎn)物的帶型與已知籽粒油分含量的高油玉米的帶型一致，則該待測玉米為候選高油玉米品種。可用本發(fā)明的數(shù)量性狀基因位點及其分子標記與籽粒顏色表型標記相結合進行高油玉米輔助選擇，快速準確地鑒別后代高油個體，選育高油玉米材料。本發(fā)明以玉米油分含量相關的數(shù)量性狀基因位點及其標記，以及以籽粒顏色作為表型標記，或者前兩種方法的結合進行高油玉米材料的選擇，將在高油玉米的育種和生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1880481SQ20061007657
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月8日 優(yōu)先權日2006年5月8日
發(fā)明者陳紹江, 韓靜 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學