專利名稱：：來源于棉花的基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因啟動子及其應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來源于棉花的植物基因啟動子及其在植物品質(zhì)改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferases，GTs)催化糖基連接到不同的受體分子上，基于其序列相似性、催化特異性、保守序列和供體糖種類的不同，這類酶被分成不同的家族(T.Vogt，P.Jones，Glycosyltransferasesinplantnaturalproductsynthesischaracterizationofasupergenefamily，TrendsPlantSci.5(2000)380-386；W.G.T.Willats，L.McCartney，W.Mackie，J.P.Knox，Pectincellbiologyandprospectsforfunctionalanalysis.PlantMol.Biol.47(2001)9-27.)。在植物中，糖基轉(zhuǎn)移酶能將光合作用的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成二糖、寡糖、多糖等不同類型的糖類小分子物質(zhì)，因而在植物的發(fā)育過程中起重要作用。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，由4個(gè)獨(dú)立的家族GT1、GT43、GT47和GT70組成。根據(jù)對碳水化合物有活性的酶分類數(shù)據(jù)庫(Carbohydrate-ActiveEnzymes，CAZy)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，植物葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶主要屬于GT47家族(J.A.Campbell，G.J.Davies，V.Bulone，B.Henrissat，Aclassificationofnucleotide-diphospho-sugarglycosyltransferasesbaseduponamino-acidsimilarities，Biochem.J.326(1997)929-942.)。葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶可催化轉(zhuǎn)移一個(gè)尿苷5’二磷酸葡萄糖醛酸基團(tuán)(GLCA)到不同的受體底物。這些底物主要是糖苷配基類物質(zhì)，如木聚糖、花青素或果膠等。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在木聚糖骨架上，每隔6個(gè)木聚糖殘基就加入一個(gè)葡萄糖醛酸基團(tuán)到葡萄糖醛酸木聚糖分子中，形成I型細(xì)胞壁，并且，α-D-葡萄糖醛酸基團(tuán)以側(cè)鏈形式加到木聚糖骨架的0-2位置上(N.Carpita，D.M.Gibeaut，Structuralmodelsofprimarycellwallsinfloweringplantsconsistencyofmolecularstructurewiththephysicalpropertiesofwallsduringgrowth，PlantJ.3(1993)1-30.)。Sawada等證明BpUGAT(B.perennisglucuronosyltransferases)催化葡萄糖醛酸基團(tuán)專一性地結(jié)合到底物花青素的2’羥基基團(tuán)上(S.Sawada，H.Suzuki，F(xiàn).Ichimaida，M.Yamaguchi，T.Iwashita，Y.Fukui，H.Hemmi，T.Nishino，T.Nakayama，UDP-glucuronicAcidAnthocyaninGlucuronosyltransferasefromRedDaisy(Bellisperennis)Flowers，J.Biol.Chem.280(2005)899-906.)。由于底物不同，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶可能參與分化和次生代謝等許多重要生理調(diào)節(jié)過程(R.S.Bandurski，J.D.Cohen，J.Slovin，D.M.Reinecke，Hormonebiosynthesisandmetabolism，inP.J.Davies(ed)，PlantHormonesPhysiology，Biochemistry，andMolecularBiology，Dordrecht，TheNetherlands，KluwerAcademicPublishers，1995，pp.39-65.)。在植物中，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶或其相關(guān)基因被認(rèn)為在植物生長和代謝過程中起重要作用。在豌豆下胚軸延伸期，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性達(dá)到最大值，且在伸長幾乎完全停止后仍然活性很高。據(jù)報(bào)導(dǎo)豌豆葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(Pisumsativumglucuronosyltransferases，PsUGT1)催化UDP-葡萄糖醛酸基團(tuán)與未知的底物結(jié)合，且該基因與有絲分裂有關(guān)，并在分裂的細(xì)胞中高效表達(dá)。通過組成性表達(dá)反義mRNA抑制PsUGT1基因的表達(dá)，能顯著性地延緩轉(zhuǎn)基因苜蓿(alfalfa)的生長和發(fā)育。在煙草(Nicotianaplumbaginifolia)中，Iwai等通過T-DNA插入的方法，獲得一個(gè)命名為nolac-H18(nonorganogeniccalluswithlooselyattachedcells，nolac-H18)突變體，它編碼一個(gè)花藥葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，該酶參與果膠的合成，并在植物分生組織和器官的細(xì)胞間粘附(intercellularattachment)中起至關(guān)重要的作用(H.Iwai，N.Masaoka，T.Ishii，S.Satoh，Apectinglucuronyltranferasegeneisessentialforintercellularattachmentintheplantmeristem，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(2002)16319-16324.)。雖然這些報(bào)導(dǎo)表明葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶在植物中呈現(xiàn)不同的表達(dá)譜和功能，但是對調(diào)控其表達(dá)的啟動子結(jié)構(gòu)特征還知道得很少，而且，還沒有見到有對植物葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶啟動子區(qū)域鑒定的研究報(bào)導(dǎo)。棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其纖維來自于胚珠外表皮細(xì)胞極性延長和次生加厚，也是研究細(xì)胞壁和多糖合成的極好材料(H.Liu，R.G.Creech，J.N.Jenkins，D.Ma，CloningandpromoteranalysisofthecottonlipidtransferproteingeneLtp3.Biochim.Biophy.Acta1487(2000b)106-111.)，因而研究棉花細(xì)胞壁合成相關(guān)的酶將對了解棉花纖維的發(fā)育調(diào)控具有重要的參考價(jià)值。本發(fā)明的發(fā)明人先前通過差異顯示和RACE方法獲得了一個(gè)棉花葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因(GhGlcat1)，并對該基因的序列特征和表達(dá)譜進(jìn)行了分析(Y.T.Wu，J.Y.Liu.Molecularcloningandcharacterizationofacottonglucuronosyltranferasegene，J.PlantPhysiol.162(2005)573-582.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來自于棉花的植物基因啟動子，是一個(gè)棉花葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GhGlcat1的啟動子。本發(fā)明所提供的棉花葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GhGlcat1的啟動子，名稱為pGhGlcat1，來源于陸地棉(Gossypiumhirsutum)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)與序列表中SEQID№1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有轉(zhuǎn)錄起始作用的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下洗膜。序列表中的SEQID№1由1677bp個(gè)堿基組成。自5’端第1617位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；自5’端第1544-1548位堿基為CAAT盒；自5’端第1579-1584位堿基為TATA框；自5’端第198位堿基開始是1個(gè)淀粉酶元件(asmylase-box)，自5’端第851和1091位堿基開始是2個(gè)反向淀粉酶元件；分別自5’端第428、859、1264和1524位堿基開始是4個(gè)E-box；自5’端第1343位堿基開始是CARE；分別自5’端第198、851和1091位堿基開始是3個(gè)GAREs；自5’端第13位堿基開始是GCN4；自5’端第850位堿基開始是AACA；4個(gè)ACGT序列分別位于自5’端第215-218位堿基，第302-305位堿基，第1004-1007位堿基和第1023-1026位堿基；6個(gè)MYB響應(yīng)元件分別位于自5’端第124-129位堿基，第257-262位堿基，第268-273位堿基，第856-858位堿基，第859-864位堿基和第1349-1354位堿基；8個(gè)W-box元件分別位于自5’端第15-19位堿基，第156-160位堿基，第176-180位堿基，第293-297位堿基，第618-622位堿基和第1065-1069位堿基，第1115-1119位堿基，第1250-1254位堿基；一個(gè)反向的生長素元件AuxRE位于自5’端第1516-1521位堿基。含有本發(fā)明啟動子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增pGhGlcatl中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供了一個(gè)來源于棉花的植物基因啟動子pGhGlcatl，該啟動子中含有6個(gè)MYB-Like基因識別位點(diǎn)和4個(gè)E-box，表明GhGlcat1可能被MTB和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控。此外，煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明pGhGlcat1能賦予GUS報(bào)告基因在表皮毛、頂端分生組織區(qū)和植物花器官的雄蕊和雌蕊中高水平表達(dá)，而在維管束組織幾乎不表達(dá)，且受脅迫響應(yīng)，分生組織是初生細(xì)胞壁合成的主要器官，表明GhGlcat1棉纖維初生細(xì)胞壁合成期、細(xì)胞伸長、花器官發(fā)育及脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，pGhGlcat1的功能研究為揭示GhGlcat1的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了線索。此外，pGhGlcat1還可應(yīng)用于植物(包括單子葉和雙子葉植物，尤其是棉花)的品質(zhì)及抗性的基因工程改良中，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為pGhGlcat1的序列分析結(jié)果圖2為pBI-pGhGlcat1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草不同發(fā)育時(shí)期GUS活性的組織化學(xué)分析結(jié)果圖3為生長4周的pBI-pGhGlcat1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS報(bào)告基因的定量分析結(jié)果圖4為經(jīng)非生物脅迫處理的pBI-pGhGlcat1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草的GUS相對活性測定結(jié)果圖5為含有不同長度pGhGlcat1啟動子缺失片斷和GUS基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖與轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性分析結(jié)果圖6為轉(zhuǎn)化有含不同長度pGhGlcat1啟動子缺失片斷和GUS基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛的GUS染色結(jié)果具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物序列均由上海生工合成，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、棉花葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GhGlcat1的啟動子pGhGlcat1的克隆及序列分析一、棉花葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GhGlcat1的啟動子pGhGlcat1的克隆參照Paterson等的方法(PatersonAH，BrubakerCL，WendelJF.Arapidmethodforextractioncotton(Gossypiumspp.)GenomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolBiolRep1993；11122-7.)提取棉花品種中棉12(Gossypiumhirsutumcv.CRI12)葉片的核基因組DNA，然后用改良的染色體步行法(A.M.Wu，J.Y.Liu，Animprovedmethodofgenomicwalkingforpromotersequencescloning，Chin.J.Biochem.Mol.Biol.22(2006)243-246.)克隆棉花葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GhGlcat1的啟動子序列。將克隆并經(jīng)純化的DNA片段連接至載體pGEM-TEasy(Promega公司)中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，用Qiagen公司的QIAprepSpinMiniProp試劑盒對所提質(zhì)粒進(jìn)行純化后，用ABIPRISMTM377DNA測序儀進(jìn)行測序。結(jié)果獲得一個(gè)長度為1677bp的DNA片段，具有序列表中SEQID№1的DNA序列。與已克隆的GhGlcat1的cDNA序列進(jìn)行比較，結(jié)果該1677bp的DNA片段含有GhGlcat1cDNA序列5’端非編碼區(qū)的60個(gè)核苷酸，即5’端非編碼區(qū)部分重疊，表明所克隆到的長度為1677bp的DNA片段就是目標(biāo)基因GhGlcat1的啟動子序列，將該啟動子命名為pGhGlcat1。而將上述含有pGhGlcat1的重組載體命名為pGEM-TEasy-pGhGlcat1。二、pGhGlcat1的序列分析對棉花葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GhGlcat1的啟動子pGhGlcat1的核苷酸序列(序列表中的SEQID№1)進(jìn)行初步的序列分析，分析結(jié)果見圖1，將用5’-RACE法擴(kuò)增分離到的GhGlcat1cDNA序列的第一個(gè)堿基定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(記為+1，見圖1中帶箭頭的堿基)，即序列表中SEQID№1自5’端的第1617位堿基，其中TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-39至-34位堿基，而CAAT框位于-74至-70位堿基，這些元件在轉(zhuǎn)錄中是基本啟動子元件。再用PLACE(HigoK，UgawaY，IwamotoM，KorenagaT.Plantcis-actingregulatoryDNA-elements(PLACE).NuclAcidsRes1999；27297-300.)和PlantCARE(LescotM，DéhaisP，ThijsG，MarchalK，MoreauY，VandePeerY，RouzéP，RombautsS.PlantCARE，adatabaseofplantcis-actingregulatoryelementsandaportaltotoolsforinsilicoanalysisofpromotersequences.NuclAcidsRes2002；30325-7.)軟件對pGhGlcat1的核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，分析結(jié)果如表1所示，啟動子pGhRGP1中含有眾多與已知真核生物的順式作用元件的同源序列，如在種子/胚乳特異表達(dá)的順式作用元件，包括淀粉酶元件(asmylase-box)、E-box、CARE、GARE、GCN4元件、ACGT元件和AACA元件，其中，淀粉酶元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-1420位、-527位和一個(gè)反向淀粉酶元件位于-767位，它被認(rèn)為與在種子中高表達(dá)相關(guān)(N.Huang，T.D.Sutliff，J.C.Litts，R.L.Rodriguez，Classificationandcharacterizationofthericealpha-amylasemultigenefamily，PlantMol.Biol.14(1990)655-668.)；4個(gè)E-box位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-1190位，-759位，-354位和-94位，它被認(rèn)為與種子特異表達(dá)的種子儲藏蛋白有關(guān)(Y.Kawagoe，N.Murai，F(xiàn)ourdistinctnuclearproteinsrecognizeinvitrotheproximalpromoterofthebeanseedstorageproteinP-phaseolingeneconferringspatialandtemporalcontrol，PlantJ.2(1992)927-936.；K.Stalberg，M.Ellerstom，I.Ezcurra，S.Ablov，L.Rask.DisruptionofanoverlappingE-box/ABREmotifabolishedhightranscriptionofthenapAstorage-proteinpromoterintransgenicBrassicanapusseeds，Planta199(1996)515-519.)；堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)蛋白可結(jié)合到E-box上，并且bHLH蛋白與種子中花青素的表達(dá)有關(guān)(S.R.Ludwig，L.F.Habera，S.L.Dellaporta，S.R.Wessler，Lc，amemberofthemaizeRgenefamilyresponsiblefortissue-specificanthocyaninproduction，encodesaproteinsimilartotranscriptionalactivatorsandcontainsthemyc-homologyregion，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)7092-7096.)，因而bHLH蛋白可能與E-box元件相結(jié)合，調(diào)控種子蛋白基因的特異表達(dá)；1個(gè)CARE和3個(gè)GAREs分別位于啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-275位、-561位和反向的-767位、-527位，它們與種子的萌發(fā)有關(guān)(K.Sutoh，D.Yamauchi，Twocis-actingelementsnecessaryandsufficientforgibberellin-upregulatedproteinaseexpressioninriceseeds，PlantJ.34(2003)635-645.；M.Ogawa，A.Hanada，Y.Yamauchi，A.Kuwahara，Y.Kamiya，S.Yamaguchi，GibberellinbiosynthesisandresponseduringArabidopsisseedgermination，PlantCell15(2003)1591-1604.)；啟動子中還含有1個(gè)GCN4、1個(gè)AACA序列和4個(gè)ACGT序列，而組合的GCN4、ACGT和AACA序列足以賦予高水平的胚珠特異表達(dá)(H.Washida，C.Y.Wu，A.Suzuki，U.Yamanouchi，T.Akihama，K.Harada，F(xiàn).Takaiwa，Identificationofcis-regulatoryelementsrequiredforendospermexpressionofthericestorageproteinglutelingeneGluB-1.PlantMol.Biol.40(1999)1-12.；C.Y.Wu，H.Washida，Y.Onodera，K.Harada，F(xiàn).Takaiwa，Quantativenatureoftheprolamin-box，ACGTandAACAmotifsinariceglutelingenepromoterminimalcis-elementrequirementsforendosperm-specificgeneexpression，PlantJ.23(2000)415-421.)；此外，啟動子pGhGlcat1中還含有6個(gè)MYB響應(yīng)元件(圖1中陰影處序列)分別位于啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-269位，-762位，-1361位，-1350位，-1494位和-759位，與表皮毛特異表達(dá)有關(guān)(E.Wang，S.Gan，G.J.Wagner，IsolationandCharacterizationoftheCYP71D16trichomes-specificpromoterfromNicotianatabacumL.J.Exp.Bot.53(2002)1891-1897；S.Wang，J.W.Wang，N.Yu，C.H.Li，B.Luo，J.Y.Gou，L.J.Wang，X.Y.Chen，ControlofplanttrichomesdevelopmentbyacottonfiberMYBgene，PlantCell16(2004)2323-2334.)；一些花粉特異表達(dá)的元件，如AGAAA、AAATGA和GTGA序列(K.Weterings，J.Schrauwen，G.Willems，D.Twell，F(xiàn)unctionaldissectionofthepromoterofthepollen-specificgeneNtp303revealsanovelpollen-specificandconservedcis-regulatoryelement.PlantJ.8(1995)55-63.)；pGhGlcat1啟動子中還含有一些可能與誘導(dǎo)調(diào)節(jié)相關(guān)的元件，如W-box和AuxRE，8個(gè)W-box元件(TGACT)分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1603位，-1462位，-1442位，-1325位，-1000位，-553位，-503位和-368位(圖1中方框內(nèi)序列)，它們可能與糖誘導(dǎo)響應(yīng)相關(guān)(C.Sun，S.Palmqvist，H.Olsson，M.Boren，S.Ahlandsberg，C.Jansson，AnovelWRKYtranscriptionfactor，SUSIBA2，participatesinsugarsignalinginbarleybybindingtothesugar-responsiveelementsoftheisolpromoter，PlantCell15(2003)2076-2092.)，一個(gè)反向的生長素元件AuxRE(GAGACA)位于-102位(圖1中斜體表示的序列)(T.Ulmasov，G.Hagen，T.J.Guilfoyle，DimerizationandDNAbindingofauxinresponsefactors，PlantJ.19(1999)309-319.)。上述啟動子pGhGlcat1的序列分析結(jié)果表明GhGlcat1基因可能在棉花纖維發(fā)育和脅迫誘導(dǎo)中受到復(fù)雜因素的調(diào)控。表1GhGlcat1啟動子序列中的調(diào)控元件分析①N代表A，C，G或T；R代表A或G。實(shí)施例2、將含有pGhGlcat1啟動子及GUS基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草及GUS活性測定和組織化學(xué)定位一、含有pGhGlcat1啟動子及GUS基因的植物表達(dá)載體pBI-pGhGlcat1::GUS的構(gòu)建為檢測GhGlcat1啟動子pGhGlcat1在轉(zhuǎn)基因煙草中的活性，現(xiàn)構(gòu)建含有pGhGlcat1和GUS基因的煙草表達(dá)載體，具體方法為以實(shí)施例1構(gòu)建的含pGhGlcat1的重組載體pGEM-TEasy-pGhGlcat1為模板，在正向引物15’-CAAGCTTCAGACCTGAGTCATTC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII識別位點(diǎn))和反向引物25’-CTGGATCCCTTATGAGTAAAATGGAATT-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增pGhGlcat1，并在序列兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI的識別位點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約1647bp的目的片段，對回收片段用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pBI121(Clontech公司)連接，將pGhGlcat1取代載體pBI121中的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，并位于GUS報(bào)告基因的上游，得到含有pGhGlcat1和GUS基因的煙草表達(dá)載體，命名為pBI-pGhGlcat1::GUS。同時(shí)，以含有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子和GUS基因(35S::GUS)的載體pBI121作為陽性對照，以不含啟動子、僅含有GUS報(bào)告基因(promoterless::GUS)的載體pBI101(Clontech公司)作為陰性對照。二、將煙草表達(dá)載體pBI-pGhGal1::GUS轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定將步驟一構(gòu)建的雙元植物表達(dá)載體載體pBI-pGhGlcat1::GUS，陽性對照pBI121和陰性對照pBI101分別通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)篩選得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，再用葉盤法將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化煙草(N.tabacumcv.shangxi)，包括以下步驟1)挑取攜帶目標(biāo)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落過夜培養(yǎng)，次日擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值約為0.6-0.8；2)4500g離心5min收集菌體，用1/2MS液體培養(yǎng)基(大量元素和微量元素是MS液體培養(yǎng)基的一半，其余成分不變)洗滌菌體一次，并將其稀釋到新的1/2MS液體培養(yǎng)基中(至OD600＝0.1-0.2)，準(zhǔn)備侵染用；3)取煙草無菌苗葉片，用直徑6mm的打孔器制取葉盤外植體，并將其浸入準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，緩慢振蕩侵染15min；4)將侵染的葉盤經(jīng)過2天共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到的再生培養(yǎng)基(MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LIAA)上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，直至分化出抗性芽；5)切下抗性芽轉(zhuǎn)接含有500mg/L羧芐青霉素(Carb)和150mg/L卡那霉素(Kan)的生根培養(yǎng)基(MS+0.5mg/LIAA)上誘導(dǎo)生根，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。根據(jù)GUS基因的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對內(nèi)部引物(正向引物35’-CTCATTACGGCAAAGTGTGGG-3’和反向引物45’-GTGCACCATCAGCACGTTATCG-3’)，以卡那霉素抗性小苗的基因組DNA為模板，在引物3和引物4的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測GUS報(bào)告基因表達(dá)盒是否已整合進(jìn)再生苗。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到665bp擴(kuò)增片段，表明GUS報(bào)告基因已整合進(jìn)再生苗。篩選陽性T0代植株，在25℃、16h光照/8h黑暗的溫室內(nèi)培植、開花、結(jié)籽。三、GUS活性的組織化學(xué)定位分析和熒光定量測定取步驟二在溫室中生長不同時(shí)期的pBI-pGhGlcat1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草的幼苗，將轉(zhuǎn)基因煙草的不同組織分別置于研缽中加入液氮研磨成勻漿。然后將勻漿懸浮于GUS提取緩沖液(含50mMNa3PO4緩沖液(pH7.0)，0.1％TritonX-100，10mMβ-巰基乙醇，10mM1，2-diaminocyclohexane-N，N，N，N-tetraaceticacid以及0.1％月桂酸鈉)中，在12,000g、4℃離心10min后收集上清。參考Jefferson等的熒光組織化學(xué)定位法(JeffersonRA，KavanaghTA，BevanMW.GUSfusionsp-Glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ1987；63901-7.)測定GUS活性，具體方法為將待測上清樣品在含0.5％多聚甲醛的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中固定30min，然后置于GUS反應(yīng)液(含0.1mol/LNa3PO4緩沖液(pH7.0)，10mmol/LEDTA，5mmol/L鐵氰化鉀，1.0mmol/LX-gluc及0.1％TritonX-100)中3-12h，直至著色達(dá)到足夠強(qiáng)度，再將光合組織用70-100％系列乙醇脫色以去掉葉綠素，最后用尼康8700相機(jī)(Nikon公司)或體視鏡(Leica公司)照相，進(jìn)行觀察。GUS熒光的定量測定方法為參照Bradford的方法(BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalBiochem1976；72248-54.)對提取液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃度定量，用牛血清白蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。GUS活性以每mg可溶性蛋白每分鐘產(chǎn)生的pmol4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，4-MU)為單位。GUS活性數(shù)據(jù)是5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系測定值的平均值。收集的樣品可置于液氮中速凍，于-70℃儲存?zhèn)溆?。不同時(shí)期取樣并進(jìn)行的GUS熒光組織化學(xué)定位結(jié)果如圖2所示，萌發(fā)1d大的幼苗，GUS在整個(gè)小植株中都很深著色(圖2中的圖A)；而萌發(fā)后還發(fā)現(xiàn)GUS著色在萌發(fā)種子的種皮上(圖2中的圖B)。植物的種皮含有大量的花青素，并且有報(bào)導(dǎo)證明葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因參與了花青素的合成(SawadaS，SuzukiH，IchimaidaF，etal.UDP-glucuronicAcidAnthocyaninGlucuronosyltransferasefromRedDaisy(Bellisperennis)Flowers.J.Biol.Chem.2005，280899-906.)，GUS基因在種皮上的表達(dá)暗示了棉花GhGlcat1基因可能也與花青素的生物合成有關(guān)。更進(jìn)一步，啟動子pGhGlcat1中含有4個(gè)E-box，而調(diào)控E-box的轉(zhuǎn)錄因子bHLH類蛋白，正好與花青素的合成有關(guān)(LudwigSR，HaberaLF，DellaportaSL，etal.Lc，amemberofthemaizeRgenefamilyresponsiblefortissue-specificanthocyaninproduction，encodesaproteinsimilartotranscriptionalactivatorsandcontainsthemyc-homologyregion.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1989，867092-7096.)，因而E-box可能參與啟動子調(diào)控種皮的表達(dá)。此外，2d大的幼苗，GUS染色主要分布在根分生區(qū)和子葉，但根毛較少著色(圖2中的圖C)；當(dāng)幼苗3周大時(shí)，GUS著色主要在根尖，包括主根和側(cè)根(圖2中的圖D和圖E)以及上半部份莖(圖2中的圖F)中，仔細(xì)觀察GUS在莖部的著色，其主要位于莖部節(jié)間的維管束(圖2中的圖F)和外層表皮細(xì)胞的表皮毛(圖2中的圖G)中；而葉片中GUS活性非常低，未見有著色(結(jié)果未顯示)。GUS在莖部維管束高表達(dá)也與先前報(bào)導(dǎo)該基因的RNA雜交檢測結(jié)果在莖部有較高的信號相一致(Y.T.Wu，J.Y.Liu.Molecularcloningandcharacterizationofacottonglucuronosyltranferasegene，J.PlantPhysiol.162(2005)573-582.)，上述GUS熒光組織化學(xué)定位結(jié)果表明了GhGlcat1基因在植物體內(nèi)的表達(dá)是一個(gè)動態(tài)變化的過程。為了更準(zhǔn)確地給出pGhGlcat1轉(zhuǎn)基因植株中GUS報(bào)告基因表達(dá)的量化指標(biāo)，以4周大的煙草為材料對GUS報(bào)告基因進(jìn)行定量分析。根和莖分別取靠近分生組織的頂部，葉片取第4張葉片，結(jié)果如圖3中的圖A和圖B所示(圖A根尖部(rt)、莖頂部(st)和第4片葉(lf)在轉(zhuǎn)基因煙草中的位置圖；圖B相應(yīng)部位的GUS活性測定結(jié)果)，GUS活性在根尖和莖頂部較高，而在葉片中的活性非常低，其中根中的GUS活性是葉中活性的5.19倍。此結(jié)果也與上述組織化學(xué)定位分析結(jié)果相一致，暗示了GhGlcat1基因可能主要在分生組織區(qū)和維管束中表達(dá)。在生殖生長階段，GUS可著色在花粉囊和花粉粒中(圖2中的圖H和圖I)；由于該實(shí)施例所用的轉(zhuǎn)基因植株為T1代，所以在單倍體的花粉中著色和不著色的分離比平均值接近1∶1，表明T1代植株是單拷貝插入。10d大的果實(shí)橫切面中，GUS著色在種子上，而胎座中沒有著色(圖2中的圖J-圖L)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，有73.2％的種子表現(xiàn)出較強(qiáng)的GUS著色，接近于3∶1的分離比例。與GUS組織化學(xué)定位結(jié)果相符，啟動子中也含有多個(gè)與種子/胚乳特異表達(dá)相關(guān)的元件，如amylase-box、CARE、GARE、GCN4、ACGT元件等(N.Huang，T.D.Sutliff，J.C.Litts，R.L.Rodriguez，Classificationandcharacterizationofthericealpha-amylasemultigenefamily，PlantMol.Biol.14(1990)655-668.；K.Sutoh，D.Yamauchi，Twocis-actingelementsnecessaryandsufficientforgibberellin-upregulatedproteinaseexpressioninriceseeds，PlantJ.34(2003)635-645.；M.Ogawa，A.Hanada，Y.Yamauchi，A.Kuwahara，Y.Kamiya，S.Yamaguchi，GibberellinbiosynthesisandresponseduringArabidopsisseedgermination，PlantCell15(2003)1591-1604.；H.Washida，C.Y.Wu，A.Suzuki，U.Yamanouchi，T.Akihama，K.Harada，F(xiàn).Takaiwa，Identificationofcis-regulatoryelementsrequiredforendospermexpressionofthericestorageproteinglutelingeneGluB-1.PlantMol.Biol.40(1999)1-12.)，而陰性對照中，相對應(yīng)的組織中都沒有GUS著色(結(jié)果未顯示)?；ㄆ鞴俚腉US定量分析結(jié)果如圖3中的圖C和圖D所示(圖A花器官包括花粉囊(ant)、柱頭(sti)、花柱(sty)、萼片(sep)、花瓣(pet)、子房(ova)、花托(rec)和花梗(ped)；圖B相應(yīng)部位的GUS活性測定結(jié)果)，報(bào)告基因最高水平表達(dá)在花粉囊中，其次是柱頭和花柱，低水平表達(dá)在萼片、花瓣、花梗、花托和子房中，其中花粉囊中的GUS活性是203.12±25.42pmol/mgprotein/min，是柱頭中的2倍，花梗中的7.1倍。表明GhGlcat1啟動子指導(dǎo)GUS基因高表達(dá)在花粉囊中，與組織化學(xué)染色GUS著色在花粉囊和花粉粒中相一致，也與啟動子中含有一些花粉特異表達(dá)的元件(AGAAA，AAATGA和GTGA)相符。實(shí)施例3、檢測pGhGlcat1轉(zhuǎn)基因煙草對非生物脅迫的影響取在溫室中生長3周的T2代pBI-pGhGlcat1::GUS轉(zhuǎn)基因煙草，做非生物脅迫處理，將植株根部分別浸于下列以MS培養(yǎng)液為溶劑的溶液中200mM蔗糖(Suc)、200mM葡萄糖(Glu)、200mM果糖(Fru)、200mM甘露醇(Man)、200mM山梨醇(Sor)、50μM萘乙酸(NAA)、10μM赤霉素(GA)、50μM脫落酸(ABA)、20％PEG8000(PEG)、250mMNaCl、50μM甲基茉莉酸(MeJA)和1mM乙烯(Eth)，放在25℃的培養(yǎng)箱中處理24h，然后測定GUS活性，設(shè)MS培養(yǎng)液為對照(CK)，所有GUS活性數(shù)據(jù)是5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系測定值的平均值±SE(標(biāo)準(zhǔn)誤)。經(jīng)上述不同溶液脅迫處理的轉(zhuǎn)基因植物的GUS相對活性分析結(jié)果如圖4所示(將對照(CK)組的GUS活性定為100％)，在所有脅迫處理中，葡萄糖和蔗糖處理的轉(zhuǎn)基因植株，GUS活性明顯地提高，它們比MS對照植株的GUS活性提高大約80％，而果糖處理的轉(zhuǎn)基因植株，GUS活性只獲得小幅提高；甘露醇和山梨醇則完全沒有誘導(dǎo)作用。上述結(jié)果也與葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶具有轉(zhuǎn)糖基的功能相符(CampbellJA，DaviesGJ，BuloneV，etal.Aclassificationofnucleotide-diphospho-sugarglycosyltransferasesbaseduponamino-acidsmilarities.BiochemJ.1997，326929-942；VogtT，JonesP.Glycosyltransferasesinplantnaturalproductsynthesischaracterizationofasupergenefamily.TrendsPlantSci.2000，5380-386.)，同時(shí)說明了這種酶的表達(dá)是受底物(糖)誘導(dǎo)的，而且對底物糖是有選擇性的。同樣，經(jīng)GA和NAA處理的轉(zhuǎn)基因植株，GUS活性也增加，它們分別比MS處理的對照植株的GUS活性提高大約31％和18％；ETH、NaCl和MeJA處理植株與對照植株相比，GUS活性變化不大；而經(jīng)ABA和PEG8000處理后反而降低了轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性，PEG8000處理的主要用途是脫水作用，ABA和PEG8000在植株中的作用與GA和NAA的作用相反，這也正好與上述誘導(dǎo)效果相一致，暗示了GhGlcat1受到GA和NAA的正調(diào)控。因而，推測GhGlcat1基因在纖維發(fā)育過程中可能受到糖(葡萄糖和蔗糖)和激素(NAA和GA)的誘導(dǎo)，并共同調(diào)控它的表達(dá)。實(shí)施例1的pGhGlcat1的序列分析結(jié)果表明，該啟動子含有1個(gè)與生長素響應(yīng)有關(guān)的AuxRE，與非生物脅迫啟動子受生長素誘導(dǎo)的結(jié)果相一致。GUS染色結(jié)果又進(jìn)一步表明該啟動子能指導(dǎo)報(bào)告基因在根和莖的頂端組織區(qū)表達(dá)。莖頂端生長點(diǎn)是生長素的合成部位，而根尖中的生長素的濃度也相對較高。與莖生長點(diǎn)一樣，根尖也是細(xì)胞分裂活躍的部位。因而推測，GhGlcat1基因在頂端組織表達(dá)，也是受這兩個(gè)部位的激素濃度精細(xì)調(diào)控的。實(shí)施例4、啟動子pGhGlcat1的缺失分析和對糖的響應(yīng)區(qū)域分析一、含有不同長度pGhGlcat1啟動子缺失片斷及GUS基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建以實(shí)施例1構(gòu)建的含pGhGlcat1的重組載體pGEM-TEasy-pGhGlcat1為模板，上游引物pF1、pF2、pF3、pF4、pF5、pF6和pF7(圖1中pF1到pF77個(gè)上游引物為帶下劃線序列)分別與反向引物pR1配對作為引物組合(引物序列見表2)，PCR擴(kuò)增7個(gè)不同長度的GhGlcat1啟動子pGhGlcat1缺失序列，其對應(yīng)的長度分別是1617bp、1355bp、1049bp、813bp、635bp、457bp和281bp(核苷酸長度值是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至上游擴(kuò)增位點(diǎn)長度，5’非翻譯區(qū)的長度是30bp)，并在序列兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI的識別位點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化上述缺失片段，對不同長度回收片段用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pBI121(Clontech公司)連接，將不同長度的pGhGlcat1缺失片斷取代載體pBI121中的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，并位于GUS報(bào)告基因的上游，得到含有不同長度pGhGlcat1啟動子缺失片斷和GUS基因的煙草表達(dá)載體，分別命名為P1617(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1617/+30)，P1355(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1355/+30)，P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)，P813(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-813/+30)，P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)，P457(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-457/+30)和P281(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-281/+30)。同時(shí)，以含有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子和GUS基因(35S::GUS)的載體pBI121作為陽性對照，以不含啟動子、僅含有GUS報(bào)告基因(promoterless::GUS)的載體pBI101(Clontech公司)作為陰性對照。表2構(gòu)建中所用的引物名稱及序列①引物pF1、pF2、pF3、pF4、pF5、pF6和pF7中帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶HindIII識別位點(diǎn)，引物pR1中帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamHI識別位點(diǎn)。二、轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及GUS活性檢測用與實(shí)施例2相同的方法將上述含有不同長度pGhGlcat1啟動子缺失片斷和GUS基因的煙草表達(dá)載體P1617(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1617/+30)，P1355(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1355/+30)，P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)，P813(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-813/+30)，P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)，P457(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-457/+30)和P281(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-281/+30)，以及對照質(zhì)粒pBI121和pBI101轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)篩選得到轉(zhuǎn)化有上述不同質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)基因植株。選取3周大的每種陽性轉(zhuǎn)基因植株至少5個(gè)不同的T1代轉(zhuǎn)基因株系測定整株GUS活性。GUS活性測定結(jié)果如圖5所示(橫線代表不同缺失長度的GhGlcat1啟動子，左邊數(shù)字代表啟動子長度，右邊為載體的命名。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被定義為+1，并用小豎線標(biāo)出。GUS活性為5個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系的平均值，誤差為標(biāo)準(zhǔn)誤(±)。GUS活性的比值是指糖誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株GUS活性除以未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株GUS活性。)，P1617(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1617/+30)至P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)3種轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性有一定的上升，暗示了可能有負(fù)調(diào)控元件位于-1049bp之前；而P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)至P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)3種轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性有較明顯的降低，P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)至P281(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-281/+30)3種轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性變化不大。由此認(rèn)為，311bp長(P281)的pGhGlcat1啟動子缺失片斷仍然有活性。另外，當(dāng)缺失P1617(-1617/+30)、P457(-457/+30)和P281(-281/+30)bp時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株中仍然可見GUS著色在表皮毛中(見圖6中的圖A-C)，而不含啟動子的pBI101未見GUS著色(見圖6中的圖D)。因而，推斷決定表皮毛中特異表達(dá)的元件可能位于311bp(-281/+30)之內(nèi)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在這段序列中含有一個(gè)MYB和一個(gè)E-box，推測這兩個(gè)元件可能與P281(-281/+30)啟動子在表皮毛中的表達(dá)相關(guān)。三、啟動子pGhGlcat1對糖的響應(yīng)區(qū)域分析實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GhGlcat1的啟動子pGhGlcat1能被糖(葡萄糖和蔗糖)誘導(dǎo)，因而用不同長度的啟動子pGhGlcat1缺失片斷的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行糖誘導(dǎo)試驗(yàn)，以研究其響應(yīng)糖誘導(dǎo)的區(qū)域。上述每種轉(zhuǎn)基因植株至少取5株，用與實(shí)施例3相同的方法用含0.2M葡萄糖的MS溶液進(jìn)行處理，樣品均被放置在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)，在黑暗條件下處理24h后測定GUS活性。結(jié)果如圖5所示(橫線代表不同缺失長度的GhGlcat1啟動子，左邊數(shù)字代表啟動子長度，右邊為載體的命名。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被定義為+1，并用小豎線標(biāo)出。+代表有誘導(dǎo)作用，-代表沒有誘導(dǎo)作用。)對于含有P1617(-1617/+30)，P1355(-1355/+30)，P1049(-1049/+30)，P813(-813/+30)和P635(-635/+30)的5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株在含蔗糖的MS溶液中，GUS活性能被較強(qiáng)誘導(dǎo)。可是在P457(-457/+30)轉(zhuǎn)基因煙草中，誘導(dǎo)作用明顯下降；而含有P281(-281/+30)的轉(zhuǎn)基因煙草完全失去糖誘導(dǎo)作用(結(jié)果見圖5)。這些結(jié)果暗示了對糖誘導(dǎo)起主要作用的元件可能位于pGhGlcat1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-635至-457位之間，而起次要作用的元件可能位于-457和-281位之間。糖對陰性對照和陽性對照的轉(zhuǎn)基因植株沒有任何誘導(dǎo)作用。實(shí)施例1的啟動子pGhGlcat1的序列分析結(jié)果表明GhGlcat1啟動子中含有8個(gè)W-box，而W-box被認(rèn)為與糖脅迫響應(yīng)有關(guān)(C.Sun，S.Palmqvist，H.Olsson，M.Boren，S.Ahlandsberg，C.Jansson，AnovelWRKYtranscriptionfactor，SUSIBA2，participatesinsugarsignalinginbarleybybindingtothesugar-responsiveelementsoftheisolpromoter，PlantCell15(2003)2076-2092.)。這8個(gè)W-box中，有2個(gè)正向元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-635至-457位之間，一個(gè)反向元件位于-457至-281位之間，而-281位的下游則沒有W-box。序列分析結(jié)果剛好與上述GhGlcat1啟動子的糖誘導(dǎo)特征相吻合，暗示了該啟動子中的W-box可能與糖誘導(dǎo)存在較密切的關(guān)系，并且位于-635至-457位之間的2個(gè)正向W-box可能在糖誘導(dǎo)中起主要作用，而-457和-281位之間的反向W-box起相對較弱的誘導(dǎo)作用。序列表<160>1<210>1<211>1677<212>DNA<213>陸地棉(Gossypiumhirsutum)<400>1aagcttcagacctgagtcattcttgcttcgttaacatcatgaattcattgccagtctcta60gttccttgtgaagttagaaaagtgaggcatcaattaaattaaaattaaggttaattacac120aaacagttactcaattttgatctcaatgacaaaatagtcactcaacttttaattcagtca180ctcaacttttaaaacagtaacaaatcggtcactaacgttattaaaaagtgacaaatcagt240cattcattaatattttccgttacagtctaacgggttagttgatgtggcttgttgacttcc300cacgttgaacatgaggagcagaaaggtcttcctcttcttcttcttcttctaaaattggtc360ccttctttcttttcccctcttttcttcattttttttctgtttgtgtgttctatatctaga420ataatctcatttggtagagtttgaatttgaagttgaaaatttgggttttattatactcgt480taagttttaccaccaaaccacgccgattatacttgttttcccattaaacaaagagaaatt540aaagataaaaaatcaaacaataactcaaaaaacttaaaccccaattccgaaatgggttgc600ttcaatttcaagaaagaagtcaaagaataaatgaaaccttaaaattttttttaagaaatg660agaaaggaaatgaggtaaaaataattgtttgatacaaaacacaaaagcaaatagacaaac720gaaacaaaatacaaatttcatgaaattaaaggattaaaatggggggaaaatcaagaaaat780aatatctagatttcctctctattttctctatatgatagttggcagaaactttatcttcct840ctttctagggtttgttaacagttgtattggatttttggaagaaaagattgttctaaagag900agaaaaataaaacggagaaaagaattttaatttttggtaataaacactaactttgatttc960tttttcttcttttggggttatttaaatgacagcatagactccaacgtaactagttaaatg1020tcacgttaatttgctattatgtctgtaatgaaaaatttttagcatgactgatttaaaagt1080taaataattatttgttattgagatcaaaattgagtgactgaagtacgaaagaaatgataa1140gtgcacccttacttcaatcaacaaattaatagttaccattggtaaaacggctttctaagc1200gaagtttttcttactcttgcatcatataataaattccagtaacatgaagagtcagcatgc1260cgccacctgaaaaacattctgcatctacctggtcatggcaactaaacatttctcatccag1320taagtattaaaacataccaagccaactcctgttattacaaaaacgaatcatgacagcatg1380taaaatatggtataaattgtttttgcaatcatatttagttgatgggttccatctcaacaa1440ctatttggtgcagacagcaaccgaatccctcgtatctgttgtatcttttttttccccatt1500tttcttttacttcaagagacaaccaagtgaagaaaatgcctccccaattaaacaacaacc1560tcccaaagccaacttaattataaaaccaaaccccattgctcctggtcttctaaatttcct1620gacttaaaattccattttactcataagatggggtctgctgagagaacaaagaaggaa167權(quán)利要求1.一個(gè)植物基因啟動子，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)與序列表中SEQID№1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有轉(zhuǎn)錄起始作用的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于所述啟動子具有序列表中SEQID№1的DNA序列。3.含有權(quán)利要求1所述啟動子的表達(dá)載體。4.含有權(quán)利要求1所述啟動子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。5.含有權(quán)利要求1所述啟動子的宿主菌。6.權(quán)利要求1所述的啟動子在植物品質(zhì)改良及植物抗性改良中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為棉花。全文摘要本發(fā)明公開了一個(gè)植物基因啟動子及其應(yīng)用。該啟動子是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID№1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)與序列表中SEQID№1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有轉(zhuǎn)錄起始作用的核苷酸序列。煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明pGhGlcat1能賦予GUS報(bào)告基因在表皮毛、頂端分生組織區(qū)和植物花器官的雄蕊和雌蕊中高水平表達(dá)，表明GhGlcat1在棉纖維初生細(xì)胞壁合成期、細(xì)胞伸長、花器官發(fā)育及脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，pGhGlcat1的功能研究為揭示GhGlcat1的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了線索。此外，pGhGlcat1還可用于植物品質(zhì)及抗性的基因工程改良中。文檔編號C12N15/82GK1869233SQ20061007847公開日2006年11月29日申請日期2006年5月30日優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日發(fā)明者劉進(jìn)元,吳藹民,呂世友申請人:清華大學(xué)