專利名稱：O型口蹄疫病毒多表位粘膜免疫疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及用于粘膜免疫的融合蛋白，用于預(yù)防口蹄疫，其由O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1的多個(gè)抗原表位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位、T細(xì)胞抗原表位及純化標(biāo)簽序列組成，及其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動(dòng)物的急性、高度傳染性疾病，位列動(dòng)物A類傳染病之首，豬和牛的臨床表現(xiàn)最為嚴(yán)重，幼齡動(dòng)物可因心肌炎而死亡。該病的主要傳播途徑是經(jīng)呼吸道感染，對畜牧業(yè)都構(gòu)成了巨大的威脅，也造成了巨大的損失?？谔阋卟《緦傩NA病毒科口蹄疫屬，有七個(gè)血清型，即O、A、C、Asia I、SAT1、SAT2、SAT3，其中，前4種屬于同一亞群，后3種屬同一亞群。傳統(tǒng)上使用疫苗來進(jìn)行預(yù)防，所用疫苗包括基因工程疫苗、滅活或減毒病毒疫苗、合成肽疫苗、活載體病毒疫苗、核酸疫苗及抗獨(dú)特型抗體疫苗等(Balamurugan V，Acta Virol.2004；48(4)201-214)。無論是滅活疫苗還是減毒疫苗，在使用中都存在病毒重組形成新毒株的可能，因此有一定的潛在危險(xiǎn)；合成肽疫苗，由于合成肽分子較小，空間構(gòu)象簡單，因而對免疫系統(tǒng)的刺激強(qiáng)度不夠，保護(hù)率低；在亞單位疫苗方面，主要針對位于衣殼表面的VP1、VP2、VP3等蛋白進(jìn)行了廣泛試驗(yàn)，在酵母中表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白基因p1可以作為一種安全有效且價(jià)格低廉的新型疫苗(Balamurugan V，Virus Res.2003；92(2)141-9)，在苜蓿中表達(dá)VP1，將其提取物，或含有表達(dá)產(chǎn)物的苜蓿本身，飼喂動(dòng)物，均可產(chǎn)生免疫保護(hù)(Wigdorovitz A，Virology.1999；255(2)347-53)。盡管亞單位疫苗非常安全，但免疫效果并不理想，另外亞單位疫苗不具有感染性，因而其激活的免疫反應(yīng)較弱；而重組病毒載體疫苗有著其他疫苗不可比擬的優(yōu)勢，用于表達(dá)口蹄疫病毒抗原的病毒載體主要有痘苗病毒、腺病毒、核心多角體病毒及煙草花葉病毒等，但迄今為止，重組病毒疫苗仍然處于研究和探索階段。Moraes構(gòu)建含有P1區(qū)及3C蛋白酶編碼區(qū)的復(fù)制缺陷型5型腺病毒載體，單次接種給豬，在隨后的7，14，42天給以病毒攻擊，全部獲得保護(hù)(Moraes MP，Vaccine.2002；20(11-12)1631-9)。此外，DNA疫苗的研究也是一個(gè)熱點(diǎn)，Wong采用VP1蛋白中的兩個(gè)區(qū)域，即第141-160位和第200-213位的氨基酸序列，與宿主(小鼠、豬)自己的IgG融合，免疫效果優(yōu)于蛋白疫苗(WongHT，Virology.2000；278(1)27-35)，但DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)比常規(guī)疫苗低。而且，自基因疫苗開始研究起，始終伴隨著外源DNA有可能整合到宿主基因組中，外源抗原持續(xù)表達(dá)可能產(chǎn)生不良后果，質(zhì)粒DNA可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，質(zhì)粒DNA上攜帶的抗原基因不可調(diào)控等安全性問題。
近年興起的粘膜免疫，不僅可以產(chǎn)生很強(qiáng)的抗體應(yīng)答，而且還能產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫效果。尤其是口蹄疫病毒的主要傳播途徑是呼吸道傳播，故粘膜免疫應(yīng)該成為第一防線。粘膜免疫需要有粘膜佐劑分子，已經(jīng)證實(shí)霍亂毒素B亞單位(本文簡稱為CTB)、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位(本文簡稱為LTB)均是良好的佐劑分子(Lycke N，European J.of Immunol，1992；222277-2281)。此外，Blanco的研究發(fā)現(xiàn)，含有T細(xì)胞表位的多肽能增強(qiáng)Th細(xì)胞的活性，并協(xié)同誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒抗體(Blanco E，J Virol.2001；75(7)3164-74)。
目前，尚沒有見到針對口蹄疫的粘膜免疫疫苗，更未有良好療效的針對口蹄疫病毒的多表位粘膜免疫疫苗。為了有效預(yù)防口蹄疫，人們迫切需要一種新型、高效的疫苗來預(yù)防口蹄疫。本發(fā)明提供了一種新的能用于粘膜免疫的融合蛋白及其疫苗組合物，其能預(yù)防口蹄疫病毒的感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的能用于粘膜免疫的融合蛋白及其疫苗組合物，其能預(yù)防口蹄疫病毒的感染。本發(fā)明還提供了含有所述融合蛋白的藥物組合物，如疫苗組合物。此外，本發(fā)明還提供了編碼所述融合蛋白的多核苷酸以及制備該融合蛋白的方法等。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于粘膜免疫的融合蛋白，其含有O型口蹄疫病毒VP1抗原表位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位(LTB)和T細(xì)胞抗原表位。所述融合蛋白能預(yù)防口蹄疫病毒的感染，尤其能預(yù)防O型口蹄疫病毒的感染。其中，所述“O型口蹄疫病毒VP1抗原表位”或“O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1抗原表位”指的是具有免疫原性的O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1中的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等價(jià)物，優(yōu)選是O型口蹄疫病毒VP1蛋白的第21-40位氨基酸序列、第135-160位氨基酸序列或第200-213位氨基酸或其功能等價(jià)物，更優(yōu)選是選自SEQ IDNo.4、6、8、10、12和14的氨基酸序列或其功能等價(jià)物。所述的LTB指的是大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位或其具有基本相同粘膜佐劑功能的功能等價(jià)物，優(yōu)選是如SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或其功能等價(jià)物。所述的T細(xì)胞抗原表位指的是能夠能增強(qiáng)Th細(xì)胞活性的抗原表位，優(yōu)選是如SEQ IDNo.18所示的氨基酸序列或其功能等價(jià)物。
本文中所用的術(shù)語“融合蛋白”是指多個(gè)蛋白質(zhì)或多肽分子連接到一起所形成的新的蛋白質(zhì)或多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。連接可以通過公知的遺傳工程或化學(xué)合成方法來進(jìn)行，優(yōu)選通過遺傳工程方法，即通過重組DNA技術(shù)來實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白質(zhì)或多肽分子的融合。本發(fā)明的融合蛋白含有O型口蹄疫病毒VP1抗原表位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位(LTB)和T細(xì)胞抗原表位，優(yōu)選本發(fā)明的融合蛋白由O型口蹄疫病毒VP1抗原表位、LTB和T細(xì)胞抗原表位和非免疫活性成分組成。非免疫活性成分指的是融合蛋白中的部分，其不具有VP1抗原表位和T細(xì)胞抗原表位的抗原性，也不具有LTB的佐劑活性，如純化標(biāo)簽、接頭肽、化學(xué)修飾部分、融合蛋白N端的Met、融合蛋白N端的信號(hào)肽、融合蛋白C端的多聚腺苷酸等。這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。如本發(fā)明的融合蛋白中可包括一些化學(xué)修飾部分，如水溶性聚合物。優(yōu)選水溶性聚合物要為藥學(xué)上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，聚乙烯醇，乙二醇/丙二醇共聚物，丙二醇同源共聚物，多聚氨基酸等。它們可以延長融合蛋白的體內(nèi)代謝時(shí)間，加速生物體對融合蛋白的吸收，增強(qiáng)融合蛋白的穩(wěn)定性等。當(dāng)用基因工程手段表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白時(shí)，根據(jù)生產(chǎn)中所使用的宿主細(xì)胞的不同，如原核(細(xì)菌細(xì)胞)或真核(酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器)，本發(fā)明的融合蛋白可以是糖基化的、也可以是非糖基化的。當(dāng)在原核生物中表達(dá)，融合蛋白N端一般需要有編碼Met的核苷酸序列；為了在真核生物中分泌表達(dá)，融合蛋白N端需要有信號(hào)肽。本文中所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指適于與人或動(dòng)物的組織接觸，而無過多的毒性、刺激或變態(tài)反應(yīng)等的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。
本文中所用的術(shù)語“功能等價(jià)物”指的是與原有多肽或蛋白質(zhì)的活性基本相同的變異體多肽。該變異體多肽是在原有多肽或蛋白質(zhì)序列中變異一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的多肽，優(yōu)選是變異一個(gè)至五個(gè)氨基酸殘基而獲得的多肽，更優(yōu)選是變異一個(gè)至三個(gè)氨基酸殘基而獲得的多肽。變異可以通過缺失、插入和/或用其他氨基酸取代序列上的原氨基酸殘基來實(shí)施。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，可以制備出取代、插入或添加了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，2002年)等本領(lǐng)域公知的文獻(xiàn)中。在變異的氨基酸殘基中，優(yōu)選變異為與原氨基酸殘基側(cè)鏈性質(zhì)相似的其他氨基酸，從而更得以保持原有功能活性。側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、含堿性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)、含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)。
本文中所用的術(shù)語“基本相同”指的是功能等價(jià)物的活性相對于與原有多肽或蛋白質(zhì)的活性基本不減弱，優(yōu)選活性可降低不到30％，更優(yōu)選可降低不到10％，最優(yōu)選不減弱。目前已經(jīng)存在大量檢驗(yàn)諸如免疫原性、粘膜佐劑功能或增強(qiáng)Th細(xì)胞活性能力的實(shí)驗(yàn)方法，必要時(shí)也可根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的具體方法，通過諸如基因工程手段將原有多肽或蛋白質(zhì)部分替換為相應(yīng)的功能等價(jià)物，由此來選出合適的功能等價(jià)物。
優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的融合蛋白中，所述的O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1的抗原表位的氨基酸序列選自SEQ ID No.4、6、8、10、12和14；其中所述的大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位的氨基酸序列為SEQ ID No.16；其中所述的T細(xì)胞抗原表位的氨基酸序列為SEQ ID No.18。
更優(yōu)選，本發(fā)明第一方面的融合蛋白進(jìn)一步含有純化標(biāo)簽和/或接頭肽。純化標(biāo)簽(Tag)通常為特定的蛋白質(zhì)或連續(xù)的幾個(gè)氨基酸序列，其可以與相應(yīng)結(jié)合物質(zhì)產(chǎn)生特異性結(jié)合。因而當(dāng)融合蛋白中含有純化標(biāo)簽時(shí)，可以較容易地利用其結(jié)合性質(zhì)來對融合蛋白進(jìn)行純化和鑒定。目前已經(jīng)有很多純化標(biāo)簽可以使用，有些已經(jīng)商品化了，如His標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、β-半乳糖苷酶標(biāo)簽、蛋白A標(biāo)簽、GST(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽等。本發(fā)明的純化標(biāo)簽優(yōu)選是His標(biāo)簽，更優(yōu)選是氨基酸序列為SEQ ID No.20所示的氨基酸序列。接頭肽(也稱“連接子”)是起連接融合蛋白中各活性成分的不超過20個(gè)氨基酸殘基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。優(yōu)選接頭肽不超過10個(gè)氨基酸殘基大小。本發(fā)明可使用接頭肽連接在本發(fā)明中的各VP1抗原表位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位和純化標(biāo)簽之間，也可以不使用連接肽而讓上述活性成分直接。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的接頭肽的序列有(1)、Alan，n＝2-1 0(2)、Glyn，n＝2-10；(3)、Glyn-Ser，n＝2-10(4)、(Glyn-Ser)m，m＝2-3；n＝2-10(5)、Glyn-Ser-Glym，m＝0-10；n＝0-10(6)、Glyn-Pro-Glym，m＝0-10；n＝0-10(7)、(Ala-Gly)n，n＝1～10；(8)、(Gly-Ala)n，n＝1～10；(9)、Glyn-Ala-Glym，m＝0-10；n＝0-10(10)、Alan-Gly-Alam，m＝0-10；n＝0-10(11)、上述序列的任意組合形式。
本發(fā)明第一方面的融合蛋白優(yōu)選含有一個(gè)或幾個(gè)O型口蹄疫病毒VP1抗原表位、一個(gè)或幾個(gè)T細(xì)胞抗原表位、1個(gè)大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位和1個(gè)純化標(biāo)簽，其中純化標(biāo)簽連接在大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位的C端。本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選含有幾個(gè)O型口蹄疫病毒VP1抗原表位和幾個(gè)T細(xì)胞抗原表位，更優(yōu)選包含3-6個(gè)VP1抗原表位。其中，各VP1抗原表位可以是相同的，也可以是不同的；T細(xì)胞抗原表位可以是相同的，也可以是不同的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白含有O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位的六個(gè)具有廣泛代表性的抗原表位分子和兩個(gè)T細(xì)胞抗原表位。例如，融合蛋白中各活性成分的排列次序(其中，O代表O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1的抗原表位，T代表T細(xì)胞抗原表位，Tag代表純化標(biāo)簽)可以是如下次序LTB-T-O-O-T-Tag；LTB-O-T-O-Tag；LTB-O-O-O-T-Tag；LTB-O-O-O-Tag；LTB-T-O-O-O；Tag-O-O-O-LTB；Tag-T-O-O-O-LTB；Tag-O-O-O-T-LTB；Tag-T-O-O-O-T-LTB；O-O-O-T-LTB-Tag；O-O-O-T-LTB-T-Tag；O-O-O-LTB-Tag；O-T-O-LTB-Tag；O-O-O-T-LTB；O-LTB-O-T-O；O-LTB-T-O-O；O-O-LTB-T-O；O-T-LTB-T-O-T-O；O-T-O-O-LTB-Tag；O-O-T-O-LTB-Tag；O-LTB-T-O-O-Tag；O-O-T-O-T-LTB-Tag；O-O-LTB-T-O-Tag；O-T-O-O-T-LTB-Tag；Tag-O-O-T-O-T-LTB；Tag-O-T-O-O-T-LTB；LTB-O-T-O-T-O-Tag；LTB-T-O-T-O-T-O-Tag；O-T-O-T-O-LTB-Tag；O-T-O-O-T-O-LTB；O-T-O-T-O-O-LTB-Tag；O-T-O-T-O-T-O-LTB；O-T-O-T-O-T-LTB-Tag；O-O-T-LTB-T-O-O；O-O-T-LTB-T-O-O-Tag；O-O-T-LTB-T-O-O-T-Tag；O-T-O-O-O-T-O-O-LTB-Tag；O-T-O-OT-O-O-T-O-LTB-Tag等。
更佳地，融合蛋白組成方式為LTB-T-O-O-O-T-Tag；O-O-O-T-LTB-T-Tag；O-T-O-O-O-T-O-O-LTB-Tag。最佳地，融合蛋白組成方式為O-O-O-LTB-Tag；O-T-O-O-O-T-O-O-LTB-Tag。
另外優(yōu)選，本發(fā)明第一方面的融合蛋白的氨基酸序列a)如SEQ ID No.2所示；或b)是對SEQ ID No.2所示的序列插入、缺失或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而得的氨基酸序列。所述融合蛋白能預(yù)防口蹄疫病毒的感染，尤其能預(yù)防O型口蹄疫病毒的感染。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，可以制備出取代、缺失或插入了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，2002年)等本領(lǐng)域公知的文獻(xiàn)中。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的具體方法，通過諸如基因工程手段將原有多肽或蛋白質(zhì)部分替換為取代、缺失或插入了其他氨基酸殘基的產(chǎn)物，便能獲得能預(yù)防口蹄疫病毒感染的氨基酸序列。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，其編碼本發(fā)明第一個(gè)方面所述的融合蛋白。在本文中，“多核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”可以相互替換使用，均指一個(gè)含意。本發(fā)明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優(yōu)選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易獲得本發(fā)明的編碼融合蛋白的核苷酸序列或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞，然后通過常規(guī)的宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從中分離得到大量的核苷酸序列。優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種載體，其含有本發(fā)明第二個(gè)方面所述的核酸分子。本文中的術(shù)語“重組表達(dá)載體”、“表達(dá)載體”，有時(shí)僅稱“載體”，在此可以交互替換使用，是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、動(dòng)物病毒及其它各種病毒載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達(dá)用的植物病毒載體以及在哺乳動(dòng)物乳腺中表達(dá)用的各種載體?？傊灰茉谒拗骷?xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，任何質(zhì)粒和載體都可使用。優(yōu)選表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記基因，如細(xì)菌的氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標(biāo)志，如His，Leu，Trp等；真核細(xì)胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標(biāo)記基因等。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用DNA重組技術(shù)等一系列技術(shù)，構(gòu)建含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的DNA序列、合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、啟動(dòng)子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體可用來轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，以便獲得所需要的融合蛋白。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有本發(fā)明第三個(gè)方面所述的載體，或者所述細(xì)胞已用本發(fā)明第二個(gè)方面所述的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化細(xì)胞或細(xì)胞株，可用于生產(chǎn)所需融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)剡x擇適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于氯化鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，電穿孔法和原生質(zhì)體融合法用于酵母細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明第一個(gè)方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步驟用本發(fā)明第四個(gè)方面的宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明第一個(gè)方面所述的融合蛋白，并分離所述的融合蛋白。獲得的工程細(xì)胞可以通過常規(guī)方法培養(yǎng)、誘導(dǎo)來表達(dá)所需要的融合蛋白，包括發(fā)酵過程和純化工藝。上述表達(dá)的蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜上或分泌到細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞外。根據(jù)需要，可利用融合蛋白的物理的、化學(xué)的以及其它生物學(xué)特性，進(jìn)行分離純化。方法包括但不限于裂菌(超聲波裂菌、滲透壓裂菌)，離心，鹽析，分子篩色譜，離子交換色譜，吸附色譜(親和層析、金屬鏊合層析)，反向色譜，高效液相色譜，毛細(xì)管電泳，制備性等電聚焦以及常規(guī)的變性、復(fù)性處理等，這些方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于粘膜免疫的藥物組合物，其包括本發(fā)明第一個(gè)方面所述的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。所述藥物組合物能預(yù)防口蹄疫病毒的感染，尤其能預(yù)防O型口蹄疫病毒的感染。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，已經(jīng)有很多公知的方法能將蛋白質(zhì)或多肽活性成分與藥學(xué)上可接受的載體制備成藥物組合物。本文中使用的藥學(xué)上可接受的載體指無毒的填充劑、稀釋劑、佐劑或其他制劑輔料。根據(jù)本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可以根據(jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膠囊、粉劑、乳液劑、注射劑、噴霧劑型或作為飼料添加劑的劑型。優(yōu)選該藥物組合物為注射劑型、噴霧劑型或作為飼料添加劑的劑型。這些組合物包含不同緩沖液內(nèi)容(如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液)、相應(yīng)的離子強(qiáng)度和pH值，以及其它物質(zhì)(如聚乳酸、甘露醇等)。也優(yōu)選該藥物組合物為疫苗組合物，優(yōu)選進(jìn)一步含有佐劑，如福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、CpG序列等。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一個(gè)方面所述的融合蛋白在制備預(yù)防口蹄疫的藥物中的應(yīng)用。在第八個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第六個(gè)方面所述的藥物組合物在制備預(yù)防口蹄疫的藥物中的應(yīng)用。上述所述口蹄疫優(yōu)選是指由于O型口蹄疫病毒感染而造成的口蹄疫。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以特定劑量粘膜給藥，有效地保護(hù)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1為含有融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體pPICBMDFMDVLTB的示意圖。
圖2顯示了重組表達(dá)載體pPICBMDFMDVLTB用EcoRI+XbaI酶切后的電泳結(jié)果，其中左邊為酶切產(chǎn)物，右邊為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(從下到上依次對應(yīng)200bp、400bp、750bp、1kb、1.5kb、2kb)。
圖3顯示了融合蛋白編碼基因的表達(dá)產(chǎn)物的純化和分析鑒定結(jié)果，其中左邊第1道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，第2道為發(fā)酵培養(yǎng)液上清，第3道為用60％飽和度硫酸銨沉淀純化后的樣品，第4道為用金屬鏊合層析純化后的樣品；右邊第1道為用金屬鏊合層析純化后的樣品的Western印跡的結(jié)果，右邊第2道為配制成制劑后的樣品的Western印跡的結(jié)果。
圖4A分別為血清(A)、肺沖洗物(B)和鼻沖洗物(C)的抗VP1-LTB的IgG抗體的曲線，其中分三種不同的免疫途徑，具體圖例如下(■-■)為腹腔注射；(○-----○)為鼻飼；(▲——▲)為口服，該圖用于顯示活性測定/動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果。
圖4B分別血清(A)、肺沖洗物(B)和鼻沖洗物(C)中的抗VP1-LTB的IgA抗體曲線，其中分三種不同的免疫途徑，具體圖例如下(■-■)為腹腔注射；(○-----○)為鼻飼；(▲——▲)為口服，該圖用于顯示活性測定/動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果。
本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。
為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了。
具體實(shí)施例方式
以下所述實(shí)驗(yàn)方法，沒有具體說明的，均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，2002年，第三版，科學(xué)出版社)所述方法進(jìn)行。
實(shí)施例一融合蛋白基因的來源整個(gè)融合蛋白的編碼基因按畢赤酵母偏好的密碼子人工設(shè)計(jì)，并分兩段(按編碼蛋白從氨基端到羧基端的順序，分別命名為OFD片段(其具有序列為SEQ ID No.1中第1-519位的核苷酸序列)、PLTB片段(其具有序列為SEQID No.1中第514-833位的核苷酸序列)交由上海英俊生物技術(shù)公司合成，SEQID No.1中834-897位的核苷酸序列是由Invitrogen公司的載體pPICZalpha A的1277-1340位的核苷酸序列提供的。OFD片段兩端分別設(shè)計(jì)了EcoRI(5’端)和BamHI(3’端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，PLTB片段兩端分別設(shè)計(jì)了BamHI(5’端)和XbaI(3’端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。上海英俊生物技術(shù)公司把這四個(gè)片段合成好后分別克隆到pMD18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，分別提取測序正確后，把這四個(gè)含有分別命名為pMD18T-OFD、pMD18T-PLTB重組質(zhì)粒的大腸桿菌寄給本公司。
實(shí)施例二融合蛋白酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將含有命名為pMD18T-OFD、pMD18T-PLTB重組質(zhì)粒的四個(gè)大腸桿菌菌株，接種到含氨芐青霉素50mg/L的10mlLB培養(yǎng)基中，將含有畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZalpha A(購自Invitrogen公司)的大腸桿菌菌株，接種到含25mg/L Zeocin低鹽LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按照Qiagen公司質(zhì)粒提取試劑盒使用手冊，分別提取質(zhì)粒。含融合片段編碼基因的重組質(zhì)粒分別用片段兩端對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZalphaA用EcoRI和XbaI處理，具體處理?xiàng)l件10μl反應(yīng)體系，體系內(nèi)加入2μl質(zhì)粒，各限制性內(nèi)切酶分別使用5個(gè)活性單位(New England biolabs)，加入10×緩沖液1μl，用去離子水補(bǔ)齊，37℃酶切2小時(shí)。酶切結(jié)束后，加1μl 200mM EDTA終止反應(yīng)。在1％瓊脂糖凝膠電泳中，電泳30分鐘。在紫外燈下，分別切下電泳凝膠中載體pPICZalphaA對應(yīng)的約3.6kb條帶和OFD片段各自對應(yīng)的約500bp條帶，以及PLTB各自對應(yīng)的約300bp條帶，按照Qiagen公司凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。按照載體和片段1∶1～3的比例將4個(gè)片段和表達(dá)載體混合，反應(yīng)體系15μl，由T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，4℃或16℃連接過夜。按照常規(guī)方法(氯化鈣法)轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10 F’感受態(tài)細(xì)胞，鋪于含Zeocin 25mg/L的低鹽LB平板，37℃倒置過夜。
低鹽LB的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化鈉5g，加水900ml溶解，用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5，補(bǔ)水到1000ml，高壓滅菌；低鹽LB平板的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，加水900ml溶解，用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5，補(bǔ)水到1000ml，高壓滅菌，待冷卻至55～60℃時(shí)，加入Zeocin至終濃度25mg/L，鋪平板，保存于4℃?zhèn)溆?；挑取平板上的單克隆，接種于低鹽LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，按照常規(guī)方法提取質(zhì)粒，EcoR I和Xba I進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切鑒定陽性的克隆(鑒定結(jié)果見圖2)，留存甘油菌種，儲(chǔ)存于超低溫冰箱中。同時(shí)進(jìn)行序列測定，以確保克隆正確無誤。篩選得到的酵母分泌表達(dá)載體命名為pPICBMDFMDVLTB(見圖1)。
實(shí)施例三融合蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建與篩選接種上述陽性克隆至50ml含25mg/L Zeocin低鹽LB培養(yǎng)基中，8-12小時(shí)后，轉(zhuǎn)接于500-1000ml含25mg/L Zeocin低鹽LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒，備用。
線性化DNA的制備在100μl反應(yīng)體系中，加入20μg上述提取的DNA，加入Pme I 20∪(New England biolabs)，去離子水補(bǔ)齊。37℃酶切3小時(shí)。取2μl酶切產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切是否完全。確認(rèn)線性化完全后，將余下的酶切產(chǎn)物加入2μl 200mM EDTA，終止反應(yīng)。
線性化DNA的純化在上述酶切體系中，加入100μl去離子水，加入等體積酚/氯仿，劇烈振蕩混勻，13000rpm高速離心10分鐘，將上層轉(zhuǎn)入新管，加入1/10體積3M醋酸鈉，再加入2.5倍體積無水乙醇，混勻，-70℃冰箱中放置1小時(shí)，4℃離心，13000rpm，15分鐘，棄液體，以80％乙醇洗滌一次，空氣中晾干，重新溶解在10μl去離子水中，準(zhǔn)備電融合。
酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備在5ml YPD培養(yǎng)基中接種Pichia pastoris宿主菌(購自Invitrogen公司)KM71H、GS115和X-33，30℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接入500ml新的YPD培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接量約0.1～0.5ml(根據(jù)酵母菌生長狀態(tài))，30℃繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600達(dá)到1.3～1.5為止。離心收菌，4℃條件下，1500rpm，離心8分鐘，棄上清，以預(yù)冷的500ml無菌去離子水，重新懸浮，再次離心，條件同上，以250ml預(yù)冷的無菌去離子水，重新懸浮，離心，再以20ml預(yù)冷的無菌去離子水，重新懸浮，離心，最后重新用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮，置冰上，待用。
酵母菌的電融合將80μl上述感受態(tài)細(xì)胞與5μl(約10μg)線性化DNA混合均勻，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電融合杯中，冰上放置5分鐘。電融合條件如下1500V，25μF，20Ω。電擊后，立即加入1ml預(yù)冷的1M山梨醇，混合，再轉(zhuǎn)入一個(gè)15ml培養(yǎng)管中，30℃孵育2小時(shí)。取200μl分別鋪于含不同濃度Zeocin的YPDS平板上(含Zeocin 200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml)，倒置，30℃培養(yǎng)2天。
培養(yǎng)基和平板準(zhǔn)備YPD培養(yǎng)基900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，高壓滅菌，待冷卻至55～60℃時(shí)，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，儲(chǔ)存于4℃。
YPDS平板(含Zeocin 100μg/ml為例)900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，182.2g山梨醇，20g瓊脂，高壓滅菌，待冷卻至55～60℃時(shí)，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，加入1ml 100mg/ml的Zeocin，鋪平板，儲(chǔ)存于4℃。
克隆篩選挑取各高濃度Zeocin平板上的克隆10個(gè)，接種于100ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)16～18小時(shí)，當(dāng)OD600達(dá)到2～6之間時(shí)，離心收菌，3000g，8分鐘，棄上清，用20ml BMGY培養(yǎng)基重新懸浮，繼續(xù)培養(yǎng)，并加入100％甲醇0.1ml至終濃度0.5％，每隔24小時(shí)補(bǔ)加一次，每次0.1ml。在加入甲醇后的48小時(shí)、72小時(shí)和144小時(shí)，分別取樣2ml，離心，取上清50μl，與等量的SDS-PAGE 2x載樣緩沖液混合，100℃煮沸10分鐘，13000rpm，離心10分鐘，取15μl，行10％SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察結(jié)果。挑取高表達(dá)克隆進(jìn)行表型鑒定。用O型FMDV陽性血清進(jìn)行Western鑒定，用GM1-ELISA進(jìn)行LTB部分結(jié)構(gòu)和功能檢測(見圖3)。最后篩選得到高效分泌表達(dá)融合蛋白疫苗的工程菌，命名為pPICBMDFMDVLTB/GS115。
實(shí)施例四工程菌的發(fā)酵對高效分泌表達(dá)融合蛋白疫苗的工程菌pPICBMDFMDVLTB/GS115的生長表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了有利于工程菌生長和表達(dá)的培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基、碳源(0.5％甘油)、培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基的碳氮比、pH(4～7，較佳的為5.0)、誘導(dǎo)劑甲醇的最適濃度范圍(0.5％)等。成功的建立了工程菌pPICBMDFMDVLTB/GS115的溶氧反饋高密度發(fā)酵工藝，使疫苗的理論分泌表答水平達(dá)到1.1～1.5克/升發(fā)酵液。
實(shí)施例五融合蛋白的純化發(fā)酵上清中的重組疫苗蛋白在近中性環(huán)境中，用30～75％飽和度硫酸銨沉淀；沉淀的蛋白用10～50mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分復(fù)溶；然后用金屬鏊合親和層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，分離介質(zhì)一般選用Co2+、Zn2+或Gu2+金屬鏊合親和分離介質(zhì)，可以采用pH梯度洗脫和咪唑梯度洗脫，一般選擇咪唑梯度洗脫；經(jīng)過純化的目的蛋白再經(jīng)過脫鹽柱或透析處理進(jìn)行脫鹽并將重組疫苗蛋白的緩沖液換成PBS；再通過稀釋或濃縮將重組疫苗蛋白調(diào)整到合適濃度后，進(jìn)行制劑配制，再過濾除菌，最后分裝，或直接儲(chǔ)藏備用，或真空冷凍干燥后儲(chǔ)藏備用。
具體實(shí)施中的純化工藝為發(fā)酵上清中的重組疫苗蛋白在近中性環(huán)境中，用60％飽和度硫酸銨沉淀；沉淀的蛋白用20mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分復(fù)溶；然后用Zn2+金屬鏊合親和分離介質(zhì)，采用咪唑梯度洗脫，一般選擇咪唑梯度洗脫；經(jīng)過純化的目的蛋白再經(jīng)過脫鹽柱脫鹽并將重組疫苗蛋白的緩沖液換成PBS；再通過稀釋或濃縮將重組疫苗蛋白調(diào)整到合適濃度后，進(jìn)行制劑配制，再過濾除菌，最后分裝，或直接儲(chǔ)藏備用(純化結(jié)果見圖3)。經(jīng)過該工藝處理后的重組疫苗蛋白，蛋白純度大于95％，終產(chǎn)率在0.8～1.0克/升發(fā)酵液，終產(chǎn)品達(dá)到無菌無熱源，而且穩(wěn)定性良好。后又通過VP1陽性血清ELISA(檢測抗原部分)和GM1-ELISA(檢測LTB部分)跟蹤檢測，確定的疫苗凍干和穩(wěn)定保護(hù)劑，建立了凍干工藝。
實(shí)施例六重組粘膜疫苗免疫對SPF豬的免疫效力研究將8周齡SPF豬隨機(jī)分為組，10只/組，第一組經(jīng)口、鼻腔分兩等份接種200微克(1mL，0.2mg/mL)重組疫苗，第二組經(jīng)腿部分兩點(diǎn)肌肉注射接種200微克(1mL，0.2mg/mL)重組疫苗，第3組為對照組，注射1mL PBS溶液。2周后，同等劑量同樣方法加強(qiáng)免疫一次，再過2周，同等劑量再加強(qiáng)免疫一次。最后一次免疫7天后，采用腹腔注射和皮下注射，每只豬分別用100倍的半數(shù)致死劑量的強(qiáng)毒FMDV(O型)進(jìn)行攻毒。觀察四肢是否出現(xiàn)水泡癥狀，連續(xù)觀察14天。
將4周齡SPF級Balb/c雌性小鼠隨機(jī)分為組，20只/組，采用鼻飼、口服和腹腔注射3種不同的粘膜免疫途徑。對于鼻飼和口服免疫，每只小鼠免疫2微克(20μL，0.1mg/mL)重組粘膜疫苗免疫；對于腹腔免疫，每只小鼠免疫2微克(100μL，0.02mg/mL)重組粘膜疫苗。2周和4周后，同等劑量分別加強(qiáng)免疫一次。每次免疫后，隔14天采用眼睛或者心臟采血，分離血清。用剪刀剪開鼻腔，用500μl PBS(含1％BSA)沖洗鼻腔，收集鼻沖洗物。剖開胸腔，用眼科鑷子取出肺，用500μl PBS(含1％BSA)沖洗肺部，收集肺沖洗物；將收集到的鼻沖洗物和肺沖洗物12000rpm離心5min，取上清-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 利用ELISA檢測小鼠血清、鼻沖洗物和肺沖洗物中的抗VP1-LTB IgG和IgA抗體。用純化的VP1-GST(終濃度1μg/mL)，利用原核表達(dá)載體pGEX-6P-1表達(dá))包被酶標(biāo)板(Nunc，Denmark)；用2.5％Casein封閉后，加倍比稀釋的血清、鼻沖洗物和肺沖洗物。加羊抗鼠IgG-HRP(辣根過氧化物每)(sigma)二抗檢測IgG抗體，加羊抗鼠IgA-HRP(sigma)二抗檢測IgA抗體。用OPD作為底物顯色。2M H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀490nm判讀。IgG和IgA終點(diǎn)的判斷采用文獻(xiàn)(O′Dowd et al.1999)報(bào)道的方法進(jìn)行，即血清中IgG抗體終點(diǎn)＝免疫血清的最大稀釋度≥2(沒有免疫的正常小鼠血清)；鼻或者肺沖洗物中IgG抗體終點(diǎn)＝?jīng)_洗物最大稀釋度≥2(沒有免疫的正常小鼠鼻或者肺沖洗物)。
保護(hù)率＝[(攻毒對照組死亡率-疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率]×100％]。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血清、鼻沖洗物和肺沖洗物中的抗VP1-LTB IgG抗體如圖4A所示。對腹腔免疫和鼻飼免疫來說，血清和沖洗物中的抗體水平比口服免疫各組都要高。
血清、鼻沖洗物和肺沖洗物中的抗VP1-LTB的IgA抗體如圖4B所示。對腹腔免疫和鼻飼免疫來說，血清和沖洗物中的抗體水平比口服免疫各組都要高。其中鼻飼產(chǎn)生的IgA抗體最高。
采用腹腔注射、鼻飼、口服三種不同的免疫途徑分別免疫豬3次后，用100倍的半數(shù)致死劑量的強(qiáng)毒FMDV(O型)進(jìn)行攻毒，保護(hù)率如表1所示。腹腔注射免疫效果最好，保護(hù)率即可達(dá)到100％；鼻飼免疫保護(hù)率可達(dá)90％，而口服免疫最高保護(hù)率只有60％。對照組用PBS免疫，攻毒后全部死亡。
表1.重組VP1-LTB融合蛋白免疫后對受試動(dòng)物(豬)的保護(hù)效應(yīng)

序列表<110>北京寶麥德生物醫(yī)藥科技有限公司<120>O型口蹄疫病毒多表位黏膜免疫疫苗及其應(yīng)用<160>20<210>1<211>897<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>O型口蹄疫病毒多表位黏膜免疫疫苗DNA編碼序列<222>(1)...(897)<400>
gaattcagac ataagcaaag aattgttgct ccagctaagc aattgttgtc tttcgaaaga ttcgaaatct 70ttccaaagga accaaagtac ggtgatactt ctactaacaa cgttagaggt gatttgcaag ttttggctca 140gaaggctgaa agaactttgc caggtggttc tggtggtgaa actcaagttc aaagaagaca acatactgac 210attgctttca tcttggatag atttgttggt ggttctggtg gtaagtacgg tgaatctcca gttactaacg 280ttagaggtga tttgcaagtc ttggctcaga aggctgctag aactttgcca tcctttgaaa gattcgaaat 350ctttccaaag gaaccaagac ataagcagaa gattgttgct ccagtcaagc agttgttggg tggttctggt 420ggtaagtacg gtgatacttc tactaacaac gttagaggtg acttgcaagt cttggctcag aaggctgaaa 490gaactttgcc aggtggttct ggtggatccg ctccacaaac tatcactgag ttgtgttctg agtacagaaa 560cactcaaatc tacactatca acgacaagat tttgtcctac actgagtcta tggctggtaa gagagagatg 630gtcatcatta ctttcaagtc tggtgaaact ttccaagttg aggttccagg ttctcaacat atcgattctc 700agaagaaggc tattgagaga atgaaggata ctttgagaat cacttacttg actgagacta agattgataa 770gttgtgtgtt tggaacaaca agactccaaa ctccattgct gctatctcta tgaagaatct agaacaaaaa 840ctcatctcag aagaggatct gaatagcgcc gtcgaccatc atcatcatca tcattga 897<210>2<211>298<212>蛋白質(zhì)<213>人工設(shè)計(jì)<220>
<221>O型口蹄疫病毒多表位黏膜免疫疫苗氨基酸序列<222>(1)...(298)<220>
<221>VP1的主要抗原表位3(第200-213氨基酸序列)氨基酸序列(SEQ.ID.No.12)<222>(3)...(16)<220>
<221>T細(xì)胞抗原決定族氨基酸序列<222>(17)...(28)<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)氨基酸序列(SEQ.ID.No.6)<222>(29)...(54)<220>
<221>連接肽<222>(55)...(59)<220>
<221>VP1的主要抗原表位1(第21-40位氨基酸序列)氨基酸序列(SEQ.ID.No.4)<222>(60)...(79)<220>
<221>連接肽<222>(80)...(84)<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)氨基酸序列(SEQ.ID.No.8)
<222>(85)...(110)<220>
<221>T細(xì)胞抗原決定族氨基酸序列<222>(111)...(122)<220>
<221>VP1的主要抗原表位3(第200-213氨基酸序列)氨基酸序列(SEQ.ID.No.14)<222>(123)...(136)<220>
<221>連接肽<222>(137)...(141)<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)氨基酸序列(SEQ.ID.No.10)<222>(142)...(167)<220>
<221>連接肽<222>(168)...(172)<220>
<221>LTB氨基酸序列<222>(174)...(276)<220>
<221>Tag氨基酸序列<222>(277)...(298)<400>
Glu Phe Arg His Lys Gln Arg Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Ser Phe Glu Arg 20Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Pro Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly 40Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser Gly Gly Glu 60Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Gly 80Gly Ser Gly Gly Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val 100Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys 120Glu Pro Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Gly Ser Gly 140Gly Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln 160Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu 180Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr 200Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr 220Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg 240Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val 260Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Leu Glu Gln Lys 280Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 298<210>3<211>60<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>VP1的主要抗原表位1(第21-40位氨基酸序列)DNA編碼序列<222>(1)...(60)<400>
gaaactcaag ttcaaagaag acaacatact gacattgctt tcatcttgga tagatttgtt 60<210>4<211>20<212>多肽(Polypeptide)<213>O型口蹄疫病毒<220>
<221>VP1的主要抗原表位1(第21-40位氨基酸序列)氨基酸序列<222>(1)...(20)<400>
Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val 20<210>5<211>78<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)DNA編碼序列<222>(1)...(78)<400>
aagtacggtg atacttctac taacaacgtt agaggtgatt tgcaagtttt ggctcagaag gctgaaagaa 70ctttgcca 78<210>6<211>26<212>多肽(Polypeptide)<213>O型口蹄疫病毒<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)氨基酸序列<222>(1)...(26)<400>
Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 20Ala Glu Arg Thr Leu Pro 26<210>7<211>78<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)DNA編碼序列<222>(1)...(78)<400>
aagtacggtg aatctccagt tactaacgtt agaggtgatt tgcaagtctt ggctcagaag gctgctagaa 70ctttgcca 78<210>8<211>26<212>多肽(Polypeptide)<213>O型口蹄疫病毒<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)氨基酸序列<222>(1)...(26)<400>
Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 20Ala Ala Arg Thr Leu Pro 26<210>9<211>78<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)DNA編碼序列
<222>(1)...(78)<400>
aagtaoggtg atacttctac taacaacgtt agaggtgact tgcaagtctt ggctcagaag gctgaaagaa 70ctttgcca 78<210>10<211>26<212>多肽(Polypeptide)<213>O型口蹄疫病毒<220>
<221>VP1的主要抗原表位2(第135-160氨基酸序列)氨基酸序列<222>(1)...(26)<400>
Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 20Ala Glu Arg Thr Leu Pro 26<210>11<211>42<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>VP1的主要抗原表位3(第200-213氨基酸序列)DNA編碼序列<222>(1)...(42)<400>
agacataagc aaagaattgt tgctccagct aagcaattgt tg 42<210>12<211>14<212>多肽(Polypeptide)<213>O型口蹄疫病毒<220>
<221>VP1的主要抗原表位3(第200-213氨基酸序列)氨基酸序列<222>(1)...(14)<400>
Arg His Lys Gln Arg Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu 14<210>13<211>42<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>VP1的主要抗原表位3(第200-213氨基酸序列)DNA編碼序列<222>(1)...(42)<400>
agacataagc agaagattgt tgctccagtc aagcagttgt tg 42<210>14<211>14<212>多肽(Polypeptide)<213>O型口蹄疫病毒<220>
<221>VP1的主要抗原表位3(第200-213氨基酸序列)氨基酸序列<222>(1)...(14)<400>
Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu 14
<210>15<211>309<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>LTB DNA編碼序列<222>(1)...(309)<400>
gctccacaaa ctatcactga gttgtgttct gagtacagaa acactcaaat ctacactatc aacgacaaga 70ttttgtccta cactgagtct atggctggta agagagagat ggtcatcatt actttcaagt ctggtgaaac140tttccaagtt gaggttccag gttctcaaca tatcgattct cagaagaagg ctattgagag aatgaaggat210actttgagaa tcacttactt gactgagact aagattgata agttgtgtgt ttggaacaac aagactccta280attccattgc tgctatctct atgaagaat 309<210>16<211>103<212>蛋白質(zhì)<213>豬(Pocine)<220>
<221>LTB氨基酸序列<222>(1)...(103)<400>
Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile 20Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile 40Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser 60Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr 80Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser 100Met Lys Asn 103<210>17<211>36<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>T細(xì)胞抗原決定族DNA編碼序列<222>(1)...(36)<223>y＝t或c<400>
tctttcgaaa gattygaaat ctttccaaag gagcca 36<210>18<211>11<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>T細(xì)胞抗原決定族氨基酸序列<222>(1)...(12)<400>
Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Pro 12<210>19<211>66<212>DNA<213>人工合成
<220>
<221>Tag DNA編碼序列<222>(1)...(66)<400>
ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcat66<210>20<211>22<212>多肽(Polypeptide)<213>人工設(shè)計(jì)<220>
<221>Tag氨基酸序列<222>(1)...(22)<400>
Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His 20His His 2權(quán)利要求
1.一種用于粘膜免疫的融合蛋白，其包含O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1抗原表位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位和T細(xì)胞抗原表位。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述的O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1的抗原表位的氨基酸序列選自SEQ ID No.4、6、8、10、12和14；其中所述的大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位的氨基酸序列為SEQ ID No.16；其中所述的T細(xì)胞抗原表位的氨基酸序列為SEQ ID No.18。
3.權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其進(jìn)一步含有純化標(biāo)簽和/或接頭肽。
4.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其中所述的純化標(biāo)簽的氨基酸序列為SEQ ID No.20所示的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其含有一個(gè)或幾個(gè)O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1的抗原表位、一個(gè)或幾個(gè)T細(xì)胞抗原表位、1個(gè)大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位和1個(gè)純化標(biāo)簽，其中純化標(biāo)簽連接在大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位的C端。
6.如權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其氨基酸序列a)如SEQ ID No.2所示；或b)是對SEQ ID No.2所示的序列插入、缺失或取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而得的氨基酸序列。
7.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-6之任一所述的融合蛋白。
8.權(quán)利要求7所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
9.一種載體，其含有權(quán)利要求7或8所述的核酸分子。
10.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求9所述的載體，或者所述細(xì)胞已用權(quán)利要求7或8所述的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
11.一種制備權(quán)利要求1所述融合蛋白的方法，其包括，用權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1-6之任一所述的融合蛋白，并分離所述的融合蛋白。
12.一種用于粘膜免疫的藥物組合物，包括權(quán)利要求1-6之任一所述的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
13.權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其為注射劑型、噴霧劑型或作為飼料添加劑的劑型。
14.權(quán)利要求1-6之任一所述的融合蛋白在制備預(yù)防口蹄疫的藥物中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求12所述的藥物組合物在制備預(yù)防口蹄疫的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防口蹄疫的融合蛋白及該融合蛋白的制備方法及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，該融合蛋白包含O型口蹄疫病毒主要胞膜蛋白VP1的抗原表位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位、T細(xì)胞抗原表位及純化標(biāo)簽，本發(fā)明還涉及該融合蛋白的制備方法及其藥學(xué)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101070348SQ200610078580
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者李殿明, 趙常貴, 蒲勤, 齊春梅, 趙明, 柴玉波 申請人:北京寶麥德生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司