專利名稱：定性、定量檢測藍舌病毒的引物和TaqMan探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用分子生物學(xué)方法對病毒進行定性、定量檢測的引物和探針，特別是涉及用實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR，real-time FQPCR)技術(shù)對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針。
背景技術(shù)：
藍舌病是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)確認(rèn)的15種A類動物疾病之一，受到了全世界有關(guān)國家的特別關(guān)注。藍舌病最早發(fā)生于南非(19世紀(jì)后期)，進入20世紀(jì)后，該病在世界各地陸續(xù)發(fā)生或查出該病病毒。我國自1979年在云南師宗縣首次發(fā)生該病以來，又先后在其它地區(qū)多次發(fā)生。
藍舌病毒(bluetongue virus，BTV)是感染家養(yǎng)及野生反芻動物的蟲媒病毒。BTV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的代表成員，迄今已發(fā)現(xiàn)25個BTV血清型(Davies FG，Muugai JN，Pini A.Vet Microbiol 1992；3125-32)，其中在美國查出6個血清型(BTV2，10，11，13、17及24)，在我國查出1個血清型(BTV10)。BTV基因組含10個節(jié)段的雙鏈RNA(dsRNA)，按大中小分片段1-3為長片段，片段4-6為中長片段，片段7-10為短片段。該10個節(jié)段的dsRNA分別編碼7個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP7)和3個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3)。其中NS1由片段6(segment 6，S6)編碼翻譯，屬中長大小的dsRNA片段，是與BTV復(fù)制有關(guān)的一種非結(jié)構(gòu)蛋白。Wang LF等的研究表明，NS1基因(又稱S6)在BTV血清群的10個節(jié)段基因中最為保守(Wang LF，Dior h，Osburn BI.Nucleic Acid Res 1989；178002)。Jonathan等提出BTV NS1基因與其它環(huán)狀病毒屬交叉反應(yīng)最小(Jonathan B K，Gary AG，David A A，Karl A A & Kathryan M M，Am J Vet Res，54(1993)2021)。
可根據(jù)發(fā)病癥狀、流行病學(xué)和病理剖檢變化對藍舌病進行假定診斷，確診則必須依靠病毒的分離和鑒定或特異性血清學(xué)試驗。國際通用的診斷方法是采用瓊脂免疫擴散、熒光抗體或補體結(jié)合試驗檢測特異性抗體。中和試驗、競爭性ELISA、間接ELISA也可用于檢測特異性抗體。此外，PCR技術(shù)可用于該病毒的基因檢測。
PCR技術(shù)作為新型的基因檢測手段，具有快速、準(zhǔn)確、特異性強等特點，已成為病毒檢測方法發(fā)展的必然趨勢。
PCR技術(shù)自1989年開始應(yīng)用以來，不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域成為常規(guī)的方法和手段，而且在遺傳性疾病的診斷、病原體的檢測、法醫(yī)學(xué)標(biāo)本的鑒定等多方面得到了廣泛的應(yīng)用。并且該項技術(shù)不斷得到改進。1996年，美國Applied Biosystems公司推出了實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantification PCR，real-time FQ PCR)技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記來進行定量，不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、無污染(無需使用溴化乙淀)、自動化程度高等特點。該技術(shù)是將DNA探針連接熒光試劑，待此DNA探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合后，通過檢測熒光光量，并用計算機軟件進行輔助分析，進行量化計算，靈敏度為0.1％。定量PCR不僅可以應(yīng)用在基礎(chǔ)研究、臨床檢測，還可以在海關(guān)及食品衛(wèi)生檢疫方面發(fā)揮重要的作用。
實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針(TaqMan探針)，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點位于兩條引物之間，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。目前常用的Taqman熒光探針為寡核苷酸，其5′端標(biāo)記有報告熒光基團(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)記有淬滅熒光基團(Quencher，Q)，如TAMRA等。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒光；在PCR擴增過程中，Taq酶的5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。在PCR擴增過程中，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程，每個循環(huán)結(jié)束后檢測一次熒光強度，整個反應(yīng)結(jié)束后，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴增曲線可以得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線以及未知模板的擴增曲線可對未知模板進行定量分析。
但是，目前尚沒有專門用于藍舌病毒基因的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，因為沒有合適的引物和特異性熒光探針。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一對用于對藍舌病毒(BTV)進行定性、定量檢測的引物。
本發(fā)明所提供的引物，其上游引物具有序列表中的SEQ ID №1，下游引物具有序列表中的SEQ ID №2。
將上游引物命名為P(NS1-1)，序列表中的SEQ ID №1由21個堿基組成，該序列位于BTV NS1基因(又稱S6基因)自5’端第10-30堿基；將下游引物命名為P(NS1-2)，SEQ ID №2由21個堿基組成，該序列為BTV NS1基因自5’端第110-130位堿基的反向互補序列。所述NS1基因指含有5’端非編碼區(qū)核苷酸序列的全基因。
由上述引物衍生的引物序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQID №1和/或SEQ ID №2的基礎(chǔ)上經(jīng)過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
上述引物既適用于藍舌病毒各血清型的實時熒光定量PCR檢測中，也可用于該病毒的常規(guī)PCR檢測技術(shù)中，其檢測的對象是BTV的NS1基因。若以待測樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板，在上述引物的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物中有121bp大小的條帶，則樣品中含有BTV。
本發(fā)明還提供了用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的TaqMan探針。
本發(fā)明所提供的TaqMan探針，可具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA序列；所述探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，其5’端標(biāo)記有報告熒光基團，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團。
所述報告熒光基團可為FAM、VIC等，熒光淬滅基團可為TAMRA、MGB等。
為防止PCR擴增時被延伸，所述探針的3’端要經(jīng)過磷酸化處理。
將具有序列表中SEQ ID NO3的TaqMan探針命名為TaqManProbel(NS1)，序列表中的SEQ ID №3由25個堿基組成，該序列為BTV NS1基因自5’端第70-94位堿基的反向互補序列；將具有序列表中SEQ ID NO4的TaqMan探針命名為TaqManProbe2(NS1)，序列表中的SEQ ID №4由23個堿基組成，該序列為BTV NS1基因自5’端第72-94位堿基。
上述TaqMan探針序列的衍生序列也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQ ID №3或SEQ ID №4的基礎(chǔ)上，在序列的5’端和/或3’端再添加、減少一個或多個堿基得到的序列。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測藍舌病毒的實時熒光定量PCR試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測藍舌病毒的實時熒光定量PCR試劑盒，可包括用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針。
本發(fā)明提供了用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針，通過提取待測樣品的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可達到準(zhǔn)確定量待測標(biāo)本中藍舌病毒RNA的目的。本發(fā)明所提供的引物及探針可用于臨床及科研中對感染藍舌病的動物中的藍舌病毒RNA進行定性及定量分析，對判斷藍舌病的發(fā)生、復(fù)發(fā)，治療效果評價及病情的動態(tài)觀察具有重要意義。本發(fā)明將在動物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A)樣品PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為陽性克隆質(zhì)粒pGEM-T120的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖4A為不同稀釋度的pGEM-T120標(biāo)準(zhǔn)品的實時熒光定量PCR擴增曲線圖4B為6種BTV血清型樣品的實時熒光定量PCR擴增曲線圖5為檢測BTV的實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線以及6種BTV血清型的樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位點圖6為2種其它BTV血清型樣品的實時熒光定量PCR擴增曲線具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物均由三博公司合成，所用TaqMan探針由上海生工合成，所有序列測定工作均由華大公司完成。
實施例1、用于對藍舌病毒(BTV)進行定性、定量檢測的引物及TaqMan探針的設(shè)計根據(jù)GenBank中8個血清型BTV的NS1基因序列，利用DNAStar軟件對該8個血清型BTV的NS1基因進行序列比對，選取NS1基因5’端的最保守區(qū)域序列作為檢測序列。由于該8個血清型BTV NS1基因中有6個血清型BTV NS1基因序列(GenBankAccession No.AY462225、M97762、NC_006025、X15891、X56735、Y00422)包括較長的5’非編碼區(qū)序列，利用DNAStar軟件對該6個血清型/株BTV NS1基因序列進行比對，然后根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計引物及TaqMan探針，序列如下上游引物P(NS1-1)5’-GTTCTCTAGTTGGCAACCACC-3’(序列表中SEQ ID NO1)，Tm為57℃；下游引物P(NS1-2)5’-GTGACTGCAAGTCCATTGAGG-3’(序列表中SEQ ID NO2)，Tm為57℃。
TaqManProbe1(NS1)5’FAM-AGTTCTCGTGGCATTTGCGTAATCC-TAMRA3’(序列表中SEQ IDNO3)，Tm為67℃。
TaqManProbe2(NS1)5’FAM-ATTACGCAAATGCCACGAGAACT-TAMRA3’(序列表中SEQ IDNO4)，Tm為62℃。
將上游引物命名為P(NS1-1)，序列表中的SEQ ID №1由21個堿基組成，該序列位于BTV NS1基因(又稱S6基因)自5’端第10-30堿基；將下游引物命名為P(NS1-2)，SEQ ID №2由21個堿基組成，該序列為BTV NS1基因自5’端第110-130堿基的反向互補序列。所述NS1基因指含有5’端非編碼區(qū)核苷酸序列的全基因。
將具有序列表中SEQ ID NO3的TaqMan探針命名為TaqManProbe1(NS1)，序列表中的SEQ ID №3由25個堿基組成，該序列為BTV NS1基因自5’端第70-94位堿基的反向互補序列。
將具有序列表中SEQ ID NO4的TaqMan探針命名為TaqManProbe2(NS1)，序列表中的SEQ ID №4由23個堿基組成，該序列為BTV NS1基因自5’端第72-94位堿基。
將上述TaqMan探針的5’端標(biāo)記報告熒光基團FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團TAMRA，并將探針的3’端進行磷酸化處理。
實施例2、用本發(fā)明的引物對藍舌病毒進行BTV的常規(guī)PCR檢測1、BTV樣品的處理選用經(jīng)細胞培養(yǎng)的BTV、血漿及組織中的8個血清型(分別為BTV3、BTV5、BTV8、BTV10、BTV11、BTV21、BTV22、BTV(A)型)的BTV作為待測BTV樣品。
用下述方法對經(jīng)細胞培養(yǎng)的BTV樣品進行處理先接種BTV至BHK-21細胞，在37℃的CO2溫箱中培養(yǎng)至細胞病變達80％以上，然后在無菌條件下將病變細胞移入滅菌離心管中，8000rpm離心30min，在無菌條件下將上清移入另一離心管中暫置于室溫下，將細胞沉淀反復(fù)凍融三次后加入上清，吹打混勻，8000rpm離心30min，取上清用于BTV RNA的提取。
血漿及組織中的BTV樣品無需進行處理。
2、BTV RNA的提取上述BTV樣品各取300μl，用Body-fluid viral DNA/Viral RNA Mini-prep試劑盒(V-Gene)并參照試劑盒說明書提取RNA。
3、反轉(zhuǎn)錄分別以步驟2提取的不同BTV樣品的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為取BTV RNA 9μl，加下游特異性引物P(NS1-2)2μl(50pg/μl)，混勻，97℃水浴5min，迅速置于冰水上5min，再在冰盒上加入M-MLV緩沖液4μl、dNTPs(2.5mM each)4μl(TaKaRa)、M-MLV RT 1μl(TaKaRa)、RNasin 0.5μl(TaKaRa)，混勻，42℃反應(yīng)1h。
4、常規(guī)PCR檢測分別以步驟3反轉(zhuǎn)錄合成的不同BTV樣品的cDNA為模板，在本發(fā)明引物P(NS1-1)和P(NS1-2)的引導(dǎo)下進行PCR擴增，25μl PCR反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液 2.5μl，dNTPs(2.5mM each)2μl，P(NSl-1)0.5μl(50pg)，P(NS1-2)0.5μl(50pg)，cDNA 5μl，Taq酶1μl(TaKaRa)，ddH2O 13.5μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；然后94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 1min，共35個循環(huán)；最后72℃ 7min，4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴增產(chǎn)物各6μl進行2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30min)，檢測結(jié)果如圖1所示(泳道MMarker DL2000，泳道ABTV3，泳道BBTV5，泳道CBTV8，泳道DBTV10，泳道EBTV11，泳道FBTV21，泳道GBTV22，泳道HBTV(A))，結(jié)果經(jīng)細胞培養(yǎng)的8個血清型的BTV樣品(BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A))經(jīng)PCR擴增均得到了121bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明本發(fā)明的引物可用于藍舌病毒的常規(guī)PCR檢測。
實施例3、用本發(fā)明的引物及TaqMan探針進行BTV的實時熒光定量PCR(real-timeFQ PCR)檢測1、BTV的培養(yǎng)及處理選用經(jīng)細胞培養(yǎng)的BTV作為待測BTV樣品，并用與實施例2中相同的方法對經(jīng)細胞培養(yǎng)的BTV樣品進行處理。
2、BTV RNA的提取取步驟1獲得的BTV樣品300μl，用與實施例2中相同的方法提取RNA。
3、反轉(zhuǎn)錄以步驟2提取的BTV樣品的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例2中相同。
4、real-time FQ PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備(1)BTV-5的PCR擴增產(chǎn)物回收取實施例2獲得的檢測樣品BTV5的PCR擴增產(chǎn)物50μl，對其進行2.5％瓊脂糖凝膠電泳(70V電泳30min)，在紫外燈下切取121bp的目的條帶，然后用Wizard SVGel and PCR Clean-up System(Promega)并參照試劑盒說明書對該目的片斷進行回收及純化。
(2)連接將步驟(1)回收的121bp的目的片斷與pGEM-T Easy Vector進行連接，連接體系及條件為回收產(chǎn)物8μl，2×T4DNA連接酶緩沖液10μl，pGEM-T Easy Vector 1μl(Promega)，T4DNA連接酶1μl(Promega)，混勻，16℃反應(yīng)2h后，4℃放置12-24h。
(3)轉(zhuǎn)化取步驟(2)的連接產(chǎn)物20μl，加入100μl用CaCl2法制備的DH5α感受態(tài)細胞，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰水上放置30min，然后42℃熱激2min，再迅速置冰水上5min，加入800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h，6000rpm離心5min，棄約800μl上清，用剩余上清吹打懸浮沉淀，并將菌懸液涂布于LB抗性選擇平板(含氨芐青霉素(Amp)50mg/L，50mg/mL X-gal 16μl，200mg/mL IPTG 4μl)上，在37℃下培養(yǎng)12-24h。
(4)菌落PCR檢測隨機挑取在LB抗性選擇平板上長出的3個白斑進行菌落PCR擴增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例2中的常規(guī)PCR所用的相同。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴增產(chǎn)物6μl，對其進行2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30min)，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道MMarker DL2000，泳道A菌落1，泳道B菌落2，泳道C菌落3)，結(jié)果其中1個克隆(菌落1)經(jīng)PCR擴增出現(xiàn)了121bp的目的條帶。
(5)提取陽性克隆的質(zhì)粒挑取步驟(4)經(jīng)初步鑒定的陽性單克隆，將其接種于含50mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、300rpm下?lián)u床培養(yǎng)14h，然后用高純度質(zhì)粒提取試劑盒(法特捷)提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pGEM-T120。取提取的質(zhì)粒pGEM-T120 5μl，對其進行2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30min)，檢測結(jié)果如圖3所示(泳道MMarker DL2000，泳道A和泳道BpGEM-T120)，質(zhì)粒pGEM-T120的條帶大小約為3kb，與預(yù)期結(jié)果相符。
(6)測序?qū)y帶有pGEM-T120的重組菌命名為DH5α(pGEM-T120)，取DH5α(pGEM-T120)菌液進行測序，結(jié)果pGEM-T120所攜帶擴增片斷具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，表明pGEM-T120所攜帶的121bp的擴增片斷與BTV NS1基因中的待擴增序列(BTV NS1基因自5’端第10-130位堿基)完全一致，構(gòu)建的質(zhì)粒序列正確。
(7)pGEM-T120的濃度測定取pGEM-T120原液20μl，稀釋至100μl ddH2O中，用紫外分光光度計測定OD260值，結(jié)果測得pGEM-T120原液的濃度為31.7μg/mL，1μl pGEM-T120原液含9×109個拷貝。
5、用TaqManProbe1(NS1)對BTV樣品進行real-time FQ PCR檢測(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將pGEM-T120原液按10×系列稀釋為104、105、106、107個拷貝進行real-time FQPCR檢測，25μl反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液2.5μl，dNTPs(2.5mM each)2μl，P(NS1-1)1μl(50pg)，P(NS1-2)1μl(50pg)，TaqManProbe1(NS1)0.5μl(25pg)，pGEM-T120 1μl，Taq酶1μl(TaKaRa)，MgCl2(25mM)2.5μl(Promega)，ddH2O 13.5μl。反應(yīng)條件為先94℃ 3min；然后94℃30s，45℃45s，72℃20s，共40個循環(huán)。結(jié)果各稀釋度的pGEM-T120均能產(chǎn)生熒光信號，Ct值分別為29.63、24.83、21.06、18.08，擴增曲線見圖4A，定量數(shù)據(jù)見表1，由擴增曲線得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.933，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5(Y＝-3.933X+45.257)。
表1不同稀釋度pGEM-T120以及BTV-5、8、10、21、22、(A)樣品熒光定量PCR的定量數(shù)據(jù)

(2)BTV樣品的real-time FQ PCR檢測首先對6個BTV血清型的待測樣品(BTV5、BTV8、BTV10、BTV21、BTV22、BTV(A))進行real-time FQ PCR檢測，除模板(由RNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA)外，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與步驟(1)相同，擴增曲線見圖4B，定量數(shù)據(jù)見表1，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位點見圖6，其Ct值依次為22.50、35.92、32.98、26.24、28.18、28.07，擴增起始濃度拷貝數(shù)依次為5.58×105、1.73×102、1.03×103、6.03×104、2.00×104、2.12×104。
然后對另外2個BTV血清型樣品(BTV3、BTV11)用相同方法進行real-time FQ PCR檢測，擴增曲線見圖6，其Ct值依次為22.20、19.37，擴增起始拷貝數(shù)依次為7.21×105、3.85×106。
此外，用TaqManProbe2(NS1)對上述BTV樣品進行real-time FQ PCR檢測，結(jié)論相同，表明本發(fā)明的TaqManProbe1(NS1)和TaqManProbe2(NS1)均可用于BTV的real-time FQ PCR檢測。
序列表<160>5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gttctctagt tggcaaccac c21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtgactgcaa gtccattgag g21<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3agttctcgtg gcatttgcgt aatcc 25<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4attacgcaaa tgccacgaga act23<210>5<211>121<212>DNA<213>藍舌病毒(bluetongue virus，BTV)<400>5gttctctagt tggcaaccac caaacatgga gcgctttttg agaaaataca acatcagtgg60ggattacgca aatgccacga gaactttttt ggctatttca cctcaatgga cttgcagtca120c12權(quán)利要求
1.用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物，其上游引物具有序列表中的SEQID №1，下游引物具有序列表中的SEQ ID №2。
2.權(quán)利要求1所述引物的衍生序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID №1和/或SEQ ID №2的基礎(chǔ)上經(jīng)過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
4.用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的TaqMan探針，具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA序列；所述探針的5’端標(biāo)記有報告熒光基團，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TaqMan探針，其特征在于所述報告熒光基團為FAM或VIC，淬滅熒光基團為TAMRA或MGB。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的TaqMan探針，其特征在于所述探針的3’端經(jīng)過磷酸化處理。
7.權(quán)利要求4所述TaqMan探針的衍生序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是在SEQ ID №3或SEQ ID №4的基礎(chǔ)上，在序列的5’端和/或3’端添加一個或多個堿基得到的序列。
9.檢測藍舌病毒的實時熒光定量PCR試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和權(quán)利要求4所述的用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的TaqMan探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針。該引物的上游引物具有序列表中的SEQ ID №1，下游引物具有序列表中的SEQ ID №2。該TaqMan探針具有序列表中SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的DNA序列；所述探針的5’端標(biāo)記有報告熒光基團，3’端標(biāo)記有淬滅熒光基團。本發(fā)明所提供的引物及探針可用于臨床及科研中對感染藍舌病的動物中的藍舌病毒RNA進行定性及定量分析，對判斷藍舌病的發(fā)生、復(fù)發(fā)，治療效果評價及病情的動態(tài)觀察具有重要意義。本發(fā)明將在動物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1880482SQ200610081309
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者章金剛, 尹惠瓊, 呂茂民 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所